全 文 ：文章编号:1001-4829(2008)02-0444-04
　　收稿日期:2007-06-28
　　基金项目:上海市农业遗传育种重点实验室开发基金;云南省优
势农产品基地项目
作者简介:赵永昌(1964-),云南大理人 ,硕士 ,副研究员 , 主要
从事大型真菌资源研究。
云南羊肚菌居群多样性研究
赵永昌 1, 2 ,柴红梅 1 , 李树红 1 , 钟明惠 1 , 和顺荣 3 ,陈明杰 2
(1.云南省农业生物技术重点实验室 ,云南 昆明　650223;2.上海市农业遗传育种重点实验室 ,上海　201106;3.迪庆州土肥站 ,云
南 香格里拉　674400)
摘　要:运用 RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)技术对分布于滇西北地区的 3种羊肚菌(Morchella)的 27个居群进行分
析。 11个随机引物在 27个居群中产生 243个位点 ,所有的位点都具有多态性。
关键词:羊肚菌;居群;RAPD;多样性;滇西北
中图分类号:S646.7　　　文献标识码:A
StudyonthepopulationdiversityofMorchelainYunnan
ZHAOYong-chang1 , 2 , CHAIHong-mei1 , LIShu-hong1 , ZHONGMing-hui1 , HEShun-rong3 , CHENMing-jie2
(1.YunnanKeyLaboratoryofAgriculturalBiotechnology, YunnanKunming650223, China;2.ShanghaiKeyLaboratoryofAgriculturalGe-
neticBreeding, Shanghai201106, China;3.DiqingSoilStation, YunnanShangri-La674400, China)
Abstract:RAPDamplificationof27populationsof4speciesofMorchelaonNorthwestYunnanwasdone.243DNAfragmentswereobtained
by11RAPDprimerson27populations.Theresultsshowedthatpolymorphismscouldbefoundinalamplificationsites.
Keywords:Morchela;population;RAPD;polymorphisms;northwestYunnan
　　羊肚菌属(Morchela)是世界上最著名的大型真
菌之一 ,分布广泛 ,全世界 28种以上 ,中国 10种以
上 ,中国羊肚菌主要分布于甘肃 、青海 、内蒙古 、新
疆 、西藏 、贵州 、河南 、江西 、陕西 、云南等地 [ 1 ～ 3] ,滇
西北的丽江 、大理和迪庆是云南羊肚菌的主要分布
区域 ,有 10个羊肚菌种分布 ,主要种是美味羊肚菌
(Morchelaesculenta)、尖顶羊肚菌(M.conica)、粗柄
羊肚菌(M.crasspie)、黑脉羊肚菌 (M.anguticeps)和
小美味羊肚菌(M.deliciosa)[ 4] 。羊肚菌价值较高 ,
其人工或半人工栽培一直是科学家们研究的热点 ,
虽然在人工栽培方面已取得不少进展 ,但由于各种
原因尚未实现商业化生产 。
羊肚菌为子囊菌 ,虽然已有科学家对羊肚菌的
生活史进行了研究[ 5 ～ 6] ,但由于人工栽培的可重复
性差 ,其生活史值得商榷 ,一般认为形成菌核(scle-
rotia)是羊肚菌生活史的重要阶段 ,但羊肚菌菌核形
成的能力差别较大 ,菌核的形态和结构也有各不相
同 ,即使是同一子实体上的不同分离物其菌核形成
能力也有较大的差别 ,这可能与子囊菌为多核菌丝
有关 ,不同部位的分离物并不完全相同 [ 7] 。所以 ,
研究羊肚菌居群的多样性有利于了解其进化和基因
交换情况 ,为羊肚菌菌株分离和生活史研究提供参
考。本文以云南省分布较多的美味羊肚菌 、尖顶羊
肚菌和粗柄羊肚菌为材料研究了云南羊肚菌的居群
多样性。
1　材料与方法
1.1　材料
供研究用的羊肚菌居群材料见表 1。
1.2　随机引物
　　根据前期研究的结果 ,下列引物在羊肚菌属中具
有较好的多态性 ,本研究采用的引物序列为:OPA-01
CAGGCCCTTC, OPA-02 TGCCGAGCTG, OPA-03 AGT-
CAGCCAC, OPA-04 AATCGGGCTG, OPA-06 GGTCCCT-
GAC, OPA-07 GAAACGGGTG, OPA-08 GTGACGTAGG,
OPA-09 GGGTAACGCC, OPA-10 GTGACCGCAG, OPA-
13CAGGACCCAG, OPA-19CAAACGTGGG。
444
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2008年 21卷 2期
Vol.21　　No.2
DOI :10.16213/j.cnki .scjas.2008.02.049
表 1　研究用的羊肚菌菌株
Table1　Listofmorelstrainsusedinstudy
编号 中文名 拉丁名 采集地
M1 粗柄羊肚菌 M.craspie 丽江泰安乡
M2 美味羊肚菌 M.esculenta 丽江泰安乡
M3 尖顶羊肚菌 M.conica 丽江泰安乡
M4 尖顶羊肚菌 M.conica 丽江玉龙雪山三道湾
M5 尖顶羊肚菌 M.conica 丽江拉什乡
M6 尖顶羊肚菌 M.conica 丽江大东乡
M7 尖顶羊肚菌 M.conica 兰坪通甸
M8 尖顶羊肚菌 M.conica 鹤庆北衙
M9 美味羊肚菌 M.esculenta 丽江巨甸镇
M10 尖顶羊肚菌 M.conica 丽江巨甸镇
M11 粗柄羊肚菌 M.craspie 丽江巨甸镇
M12 粗柄羊肚菌 M.craspie 丽江仁和乡
M13 尖顶羊肚菌 M.conica 丽江仁和乡
M14 美味羊肚菌 M.esculenta 丽江仁和乡
M15 美味羊肚菌 M.esculenta 兰坪通甸
M16 美味羊肚菌 M.esculenta 维西三家村
M17 美味羊肚菌 M.esculenta 剑川石宝山
M18 尖顶羊肚菌 M.conica 剑川石宝山
M19 美味羊肚菌 M.esculenta 香格里拉宝山
M20 美味羊肚菌 M.esculenta 维西柯那
M21 美味羊肚菌 M.esculenta 维西塔城
M22 美味羊肚菌 M.esculenta 丽江拉马古
M23 美味羊肚菌 M.esculenta 香格里拉小中甸
M24 美味羊肚菌 M.esculenta 丽江九河
M25 粗柄羊肚菌 M.craspie 丽江九河
M26 粗柄羊肚菌 M.craspie 剑川沙溪
M27 美味羊肚菌 M.esculenta 剑川沙溪
1.3　样品采集和处理
采集的羊肚菌子实体去掉菌柄基部 ,用清水洗
净并用蒸馏水冲洗 3次 ,吸水纸吸干水分 ,用刀将子
实体平均一分为二 ,一份制成干标本供进一步鉴定 ,
一份当日冰冻保存 ,相同区域内同种样品取 20个子
实体作 1个群体 。
1.4　DNA的提取
冰冻子实体加适量液氮研磨成粉沫 ,加预热至
60 ℃的 CTAB提取液 [ 2 %CTAB(W/V), 1.4 M
NaCl, 0.2 %β-巯基乙醇(W/V), 20 mMEDTA, 100
mMTris-HCl(pH8.0)] , 60℃保温 30min,并不断摇
动 ,加等体积的氯仿 -异戊醇(24∶1, V/V)进行抽
提 ,室温下离心 ,将水相转入新管 ,再用氯仿 -异戊
醇抽提水相一次 ,加 2/3体积的预冷异丙醇入水相 ,
温和地混均 , 5000r/min离心收集 DNA,真空干燥沉
淀 , DNA溶于 pH7.4 Tris-HCl(10 mMTris-HCl, 1
mMEDTA)中。
1.5　PCR反应
50 μl反应液由下列成分组成:50 mMKCl, 10
mMTris-HCl(pH9.0), 1.5 mMMgCl2 , 0.05 %(w/
v)明胶 , 0.1%Triton, 20 ng模板 , 200 μMdNTP, 1U
Taq酶 , 0.2 μM引物。
扩增条件:PCR在 MJ公司的 PTC-200进行 ,条
件为 93℃ 1 min, 35℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 45个循
环 , 72℃ 5 min。
　　电泳检测:10μlPCR反应物在 1.2%琼脂糖凝
胶上电泳 ,标准 DNA用 PCRmarker, 电泳结果在
Syngen公司的全自动凝胶成像系统 GeneGenius上
观察照像 ,并用该机的软件测量分子量 。
1.6　数据处理
扩增带的有无分别记为 1和 0,用 NTSYS-PC软
件中的 SIMQUAL程序计算 DNA相似系数 ,并用
UPGMA方法构建聚类图。
2　结果与分析
2.1　DNA多态性
实验结果表明 , 11个 RAPD引物共扩得 243个
位点 ,条带大小为 0.13 ～ 2.8 kb,除 M1、M24和 M27
群体外 ,其它群体都表现出良好的多态性 ,带型最多
的为 M3群体 ,共扩增出 90条带(图 1),各引物的
多态性差别也较大 , 多次的实验表明 , 羊肚菌的
RAPD具有较好的稳定性和可重复性 , 27个居群除
OPA-01外 ,其余 10个引物的扩增结果都表现出较
好的多态性(表 2)。
2.2　聚类分析
引物序列不同时 DNA的多态性差别较大 ,选用
不同序列的引物和不同数量的引物研究居群的多样
性时结果有较大差别 ,当只用 1个引物的扩增结果
进行聚类分析时 ,平均相似系数都大于 0.6(图 2和
表 2),对实验研究出的不同数量和序列的引物扩
图 1　27个羊肚菌居群的 RAPD多态性
Fig.1　Thepolymorphismof27populationofMorchelabyRAPD
4452期 　　　　　　赵永昌等:云南羊肚菌居群多样性研究
表 2　各个居群扩增出的 RAPD条带数
Table2　TotalnumberofDNAbandsofvariouspopulationbyRAPD
引物 居群M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10M11M12M13M14M15M16M17M18M19M20M21M22M23M24M25M26 M27
OPA-01 0 0 5 2 5 0 3 6 2 6 4 3 4 9 3 0 0 7 3 3 3 6 2 0 5 5 1
OPA-02 2 0 7 11 11 9 8 4 2 11 11 2 6 6 2 5 2 7 3 5 5 6 2 1 8 5 0
OPA-03 4 2 14 9 5 9 12 7 9 6 7 8 7 8 2 6 7 8 8 5 10 10 5 0 5 6 1
OPA-04 0 5 12 7 9 10 5 9 11 7 4 7 5 8 4 8 0 10 5 6 3 8 6 0 0 5 0
OPA-06 0 4 2 6 11 5 7 5 0 2 7 13 7 9 0 6 0 7 5 0 1 0 0 1 4 9 0
OPA-07 1 1 11 6 8 14 8 8 4 9 5 6 6 10 5 4 0 6 5 5 7 6 8 1 15 9 1
OPA-08 0 3 8 4 7 9 7 8 2 7 7 5 7 6 6 0 1 1 4 6 3 8 8 0 8 0 0
OPA-09 0 2 11 13 8 9 10 6 11 3 2 6 7 7 4 3 3 6 3 3 2 6 10 0 9 4 0
OPA-10 0 3 7 6 6 5 4 5 6 5 6 4 7 6 4 5 2 8 5 5 5 0 6 1 0 4 1
OPA-13 1 2 8 0 4 9 7 0 4 2 8 10 7 7 4 8 0 7 9 5 8 6 9 2 10 7 1
OPA-19 0 0 5 7 8 7 7 4 1 3 3 5 0 6 6 8 3 9 8 1 0 9 7 0 3 10 0
合计 8 22 90 71 82 86 78 62 52 61 64 69 63 82 40 53 18 76 58 44 47 65 63 6 67 64 5
增结果进行聚类分析 ,结果表明用 11个引物的扩增
结果进行聚类分析时 ,在 0.21的相似系数水平 ,可
将羊肚菌的 3个属分开 ,其中美味羊肚菌 M2、M24
和 M27居群的相似系数为 1, 美味羊肚菌 M14和
M15居群的相似系数为 1;尖顶羊肚菌 M4和 M13
居群的相似系数为 1,尖顶羊肚菌 M5和 M10居群
的相似系数为 1。在 0.65相似系数时美味羊肚菌
分为 6个组 ,尖顶羊肚菌分为 4个组 ,粗柄羊肚菌分
为 4个组 ,由此可见滇西地区羊肚菌居群多样性及
其丰富 ,同时从进化的角度看尖顶羊肚菌与美味羊
肚菌的关系较近 ,而粗柄羊肚菌与尖顶羊肚菌 、美味
羊肚菌的关系较远 ,因为粗柄羊肚菌与尖顶羊肚菌 、
美味羊肚菌可在 0相似系数的条件下分开。
A:单一引物 OPA-02扩增结果的居类分析;B:单一引物 OPA-07扩增结果的居类分析;C:11个引物扩增结果的居类分析
图 2　不同引物扩增结果聚类的结果
Fig.2　Theresultsoftheclusterofamplificationresultsbydiferentprimers
446 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　21卷
3　讨　论
　　羊肚菌的分类一直处于较大的争论之中 ,子实
体的错误鉴定可能会延伸到子实体的分离物无性菌
丝体上 ,而这些错误的鉴定又传给了菌种保藏机构 。
研究者把从菌种保存机构得到的典型的不同菌株进
行比较研究 ,而实际上他们研究的有可能是同一个
种 。在缺乏羊肚菌清晰的分类时 ,当进行大范围的
资源调查时可能导致研究者把大量的时间和金钱浪
费在同一个种上 ,问题的关键是分类学的形态依据
的精确性。
分子生物学的发展提供了一些对鉴定进行判别
的工具 ,垂直板淀粉电泳酶分析 [ 8 ～ 9] 、rDNAITS序
列测定 [ 10 ～ 11] 、rDNAITS的 PCR-RFLPs分析 [ 12] 、IGS
分析[ 12]和微卫星序列分析 [ 13]等技术已在羊肚菌鉴
定上得到使用的 。通过同工酶分析以前认为是小美
味羊肚菌 (M.deliciosa)的菌株归类到美味羊肚菌
M.esculenta[ 9] 。陈吉岳等对国内各地收集和采集
分离到的 15个羊肚菌菌株和 1个子实体对照进行
了 RAPD分析 ,实验筛选的 6个引物对宽圆羊肚菌
(M.robustaBond.)子实体及其分离菌株的 DNA指
纹完全相同 ,引物 OPD-08扩增的 RAPD谱带能够
将 15个供试羊肚菌菌株完全区别开来 [ 14] 。DNA的
研究结果表明北美只有 3种基本的羊肚菌类型 ,即
黑色(black)、黄色(yelow)和 半自由(half-free),许
多被定为种的羊肚菌都被可归入 3个真实的种
上 [ 11] 。研究表明同一个种在地理学上的孤立群体
有可能被明显地分为 2个不同的种[ 12] , Goldway等
研究显示来自以色列 DanNatureReserve地区的尖
顶羊肚菌 M.conica分离物的 DNA-PCR指纹图谱与
包括毗邻地区的 M.conica在内的任何地区的羊肚
菌的都不同 [ 15] 。
　　一般认为 RAPD可作为一种快速 、灵敏的分子
遗传标记 ,适合于种内菌株遗传多样性 、亲缘关系的
分析 ,是真菌种性鉴定的有效 、可靠的工具 ,但对于
种间乃至近缘属之间的亲缘关系的研究有一定的局
限性[ 16] 。由于种内多样性丰富 ,用 RAPD技术对单
一菌株进行研究会出现差异大而将同一种鉴定为不
同种 ,通过 RAPD技术对羊肚菌居群的多样性进行
研究可以克服个别菌株的影响 ,较为真实地反映羊
肚菌的遗传特性 ,同时对能羊肚菌的系统进化和种
群变异也能得到较好地体现 , RAPD的结果表明滇
西北地区是羊肚菌资源最为丰富的地区 ,种类资源
也较为丰富 ,一些新的种将会不断发现[ 17 ～ 18] 。
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(责任编辑　王家银)
4472期 　　　　　　赵永昌等:云南羊肚菌居群多样性研究