全 文 ：·中药及天然药物·
猪苓菌酯酶同工酶及过氧化物同工酶的研究
王秋颖　徐锦堂 (北京 100094中国医学科学院-中国协和医科大学药用植物研究所)
摘要　目的:研究不同来源猪苓菌株的酯酶同工酶及过氧化物同工酶图谱的变化规律。 方法:采用聚丙烯酰胺圆盘电泳法。
结果:同一猪苓菌株在不同培养天数同工酶谱带及活性不相同 ,但是具有一定数量迁移率(Rf)相同的谱带贯穿于整个培养时
间 ,不同菌株之间具有特征性谱带。结论:同工酶谱带的多少及活性与菌丝的生长速度即代谢的强弱成正相关。
关键词　猪苓菌;同工酶;电泳
Studies on esterase isozyme and peroxidase isozyme of Polyporus umbel latus
Wang Qiuying(Wang QY), Xu Jintang(Xu JT)(Institute of Medicinal Plant , Chinese Academy of Medical Sciences ,
Peking Union Medical College , Beijing 100094)
ABSTRACT　OBJECTIVE:To study the change regular of esterase isozyme and peroxidase isozyme of Polyporus umbellatus.
METHOD:Using polypropy lene amide circle electrophoresis.RESULTS:The pattern and activity of isozyme in same strain had some
difference at different culture day s , but some of isozyme pattern bands of the R f value were visible in whole culture stage.Every strain
had its peculiar pattern bands.CONCLUSION:The number of iso zyme pattern bands and enzyme activity w ere proportional to the
g rowing rate of myceliun , as w ell as its metabolic activity.
KEY WORDS　Polyporus umbellatus , isozyme , electropho resis
　　猪苓〔Polyporus umbellatuse(Pers.)Fr.〕是一
种常用中药 ,具有 2500多年的药用历史 。其菌核具
有利水 、解毒的功效 。1973 年 T .M iyazaki等[ 1] 首
次从猪苓菌核中提取出了猪苓多糖 ,并证明具有免
疫刺激作用[ 2] ,主要用于治疗慢性传染性肝炎[ 3] 。
近年来 , 对猪苓的研究主要为猪苓的发酵培
养[ 4 ～ 5] ,栽培[ 6～ 7] 、猪苓与蜜环菌的关系[ 8] 及药效
等方面 ,对猪苓菌酯酶同工酶及过氧化物同工酶的
研究尚未见报道 ,我们对不同来源的猪苓菌及菌核
的同工酶进行了研究 ,现将结果报道如下。
1　实验材料
1.1　供试菌种
供试菌种为猪苓菌:由猪苓菌核分离的猪苓菌
种———Z1;中国科学院微生物研究所的猪苓菌种
———Z2;采自山西古县人工栽培的猪苓菌核(灰
苓)———Z3;山西医药工业研究所的猪苓菌种———
Z4 。
1.2　培养基
菌丝培养使用麦麸-葡萄糖培养基:麦麸 50g ,
葡萄糖 20g ,KH2PO41.5g ,MgSO41.0g ,琼酯 15g ,水
1000ml。
2　样品的制备及电泳
2.1　样品的制备
用 pH8.3的 Tris-甘氨酸电极缓冲液制备菌丝
体匀浆 。刮取在 25℃条件下培养的猪苓菌丝各一
皿 ,菌核取内部组织 ,然后加入 Tris-甘氨酸电极缓
冲液(pH8.3),置-10℃冰箱冷冻 ,在冰溶中用研钵
研磨成浆 , 在 4℃条件下离心 , 3 000r/min 离心
30min ,取其上清液置冰箱内保存备用。
2.2　电泳及染色
采用聚丙烯酰胺圆盘电泳 。DYY型稳压稳流
电泳仪 。样品分离胶浓度 7.5%, pH8.9;样品浓缩
胶的浓度4.0%, pH6.7[ 9] 。点样量100μl;电极缓冲
液为 Tris-甘氨酸系统 ,pH8.3。每管电流 2mA ,加 1
滴 0.2%的溴酚蓝做为指示剂 ,待溴酚蓝泳动到凝
胶管下端 1cm 时 ,停止电泳 。
过氧化物同工酶染色采用抗坏血酸-联苯胺染
色系统[ 10] ;酯酶同工酶染色采用醋酸-α-萘酯和坚牢
蓝染色系统[ 10] 。
将剥离的凝胶放入 pH4.7的乙酸液中 ,5min后
去掉乙酸液 ,用蒸馏水将凝胶冲净 ,放入上述混合好
的染色液中 , 37℃条件下染色 20min。酶带清晰后
去掉染色液 ,用水冲洗干净 ,然后用 7%的乙酸固
定 ,绘图 。
·9·中国药学杂志 1999 年 1 月第 34 卷第 1 期　　　　　　　　　Chin Pharm J , 1999 January , Vol.34 No.1 　　　
3　结果与分析
3.1　同一菌株在不同培养时间同工酶酶谱变化规
律分析
对培养 10 ,16 ,21 ,28 ,35d的猪苓菌及猪苓菌核
进行酯同工酶及过氧化物同工酶酶谱分析 ,结果表
明谱带多少及其活性与菌丝的生长速度即代谢的强
弱成正比 。如 Z4 号菌株其前期生长快 ,后期生长
慢;其过氧化物同工酶由培养 10d时的 5条谱带减
少为培养 35d 时 2 条谱带;酯酶同工酶由培养 10d
时的 4条谱带减少为培养 35d时的 1条谱带 ,其谱
带颜色均由深变浅(图 1)。Z2 号菌株前期生长缓
慢 ,随着培养时间的增加 ,生长速度加快 ,酯酶同工
酶由培养 10d时的 2条谱带增加为培养 35d时的 8
条谱带 ,谱带颜色均由浅变深(图 2)。
各菌株均在一定培养时间内同工酶谱带趋于稳
定;Z1 ,Z2 号菌株 ,过氧化物同工酶在整个测定过程
中酶谱基本趋于稳定。酯酶同工酶谱带数 Z 1 号菌
株在培养的 21d至 28d 趋于稳定 , Z2 号菌株在培养
的 21d至 35d趋于稳定(图 2 ,3)。Z4号菌株过氧化
物同工酶谱带在培养的 21d至 35d趋于稳定 ,酯酶
同工酶谱带在培养的 10d至 21d趋于稳定(图 1)。
图 1　Z4 号菌株不同培养天数同工酶酶谱图
A-酯酶同工酶;　　　B-过氧化物同工酶;
□—强带;◆—较强带;◆—弱带;　图 2～ 5同
图 2　Z2 号菌株不同培养天数同工酶酶谱图
图 3　Z1 号菌株不同培养天数同工酶酶谱图
3.2不同菌株间同工酶图谱分析
分析培养 10 , 28d Z 1 ,Z 2 ,Z3 , Z4 号菌株及菌核
Z3 酯酶同工酶谱及过氧化物同工酶谱 ,结果可见各
菌株与猪苓菌核之间均具有特征性谱带。Z 1 , Z2 ,Z3
号菌株酯酶同工酶 ,谱带总条数分别为 8条 、8条 、6
条;Z1 号菌株有 7条谱带其 Rf 值与 Z2 菌株完全一
致 ,有 6条谱带 R f 值与 Z3(猪苓菌核)完全一致 。
Z2 号菌株比 Z3 菌核多出两条 R f 值为 0.68 , 0.78
的谱带;另外两菌株的第 5条谱带 E5R f 值不同 ,Z2
号菌株为 0.52 ,Z 3号菌株为 0.57(表 1),此外两菌
株之间 5条谱带 R f 值完全相同 。Z1 , Z2 号菌株与
Z3猪苓菌核过氧化物同工酶图谱 ,在培养的第 10d ,
28d均为 2 条谱带 , R f 值完全相同 , Z4 号菌株除特
征谱带外 ,过氧化物同工酶图谱多出 3条谱带 ,酯酶
同工酶图谱有 4条谱带(图 4 ,图 5)。
表 1　不同猪苓菌株酯酶同工酶谱带 R f 值比较
谱带 Z1 Z2 Z3 Z 4
1 0.34 0.34 0.34
2 0.38 0.38 0.38
3 0.41 0.41 0.41
4 0.45 0.45 0.45 0.45
5 0.57 0.52 0.57 0.52
6 0.68 0.68 0.68
7 0.72 0.72 0.72 0.72
8 0.78 0.78
合计 8 8 6 4
4　讨　论
4.1　猪苓菌同一菌株具有一定数量 ,迁移率相同的
谱带贯穿于整个培养时间 ,不同培养时间谱带的多
少及活性不完全相同。同工酶谱带的多少及活性与
菌丝的生长速度即代谢强弱成正比 。如猪苓菌 Z 4
号菌株酯酶同工酶的活性在培养的第 10天到第 16
天最强 ,以后逐渐减弱 ,说明猪苓菌 Z4 号菌株在培
养的第 10天到第 16天代谢强度最大 ,生长速度最
快 。而 Z1 ,Z2 号菌株培养到第 28天时酶活性达到
·10· Chin Pharm J , 1999 January , Vol.34 No.1 　　　　　　　　 中国药学杂志 1999 年 1 月第 34 卷第 1 期
最高 。实际培养时 ,两菌株生长缓慢 ,则需进行驯化
后方可用于生产 。蛋白质是生命的重要的物质基
础 ,酶是生物体实现正常代谢的必要条件 ,是生命活
动最重要的因素 。因此测定不同培养时间猪苓菌同
工酶图谱 ,对于了解代谢与生长可提供有益的线索 。
图 4　培养 10d 不同菌株同工酶酶谱图
图 5　培养 28d 不同菌株同工酶酶谱图
4.2　同一菌株在一定培养时间内谱带的多少趋于
稳定 ,如 Z2 号 菌株在培养的第 21天到第 35天时 ,
酯酶同工酶谱带数为稳定的 8条 。不同菌株之间以
菌丝状态存在和以菌核状态存在的纯猪苓菌株因其
存在形态不同 ,其同工酶谱带不可能完全相同 ,如猪
苓菌 Z2 和 Z3 。Z1 号菌株刚刚从菌核中分离出来 ,
即保留了菌核中特有的同工酶谱带(祖征),又出现
了分离后菌丝体应产生的谱带(新征)。
因此 ,对难以培养出菌核及子实体的猪苓菌来
说 ,其菌株之间酯酶同工酶及过氧化物同工酶的测
定对菌种的鉴定(遗传理论)提供了重要指标。
参考文献
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(收稿:1997-11-28)
刺果甘草化学成分的研究
李伟东　阚毓铭 (南京 210029南京中医药大学)
摘要　目的:分离鉴定刺果甘草的化学成分。方法:乙醇提取 ,硅胶柱层析分离 , IR , NMR和 MS 方法确定结构 。结果:分得 5
个化合物经鉴定为后莫紫檀素 ,β-谷甾醇 , 4, 7-二甲氧基异黄酮 , 美迪紫檀素和异光甘草酚。结论:4, 7-二甲氧基异黄酮为首
次从该植物中分离得到。
关键词　刺果甘草;4, 7-二甲氧基异黄酮
Studies on chemical constituents of Glycyrrhiza pallidif lora
Li Weidong(Li WD),Kan Yuming(Kan YM)(Nanjing University of Traditional Chinese Medicine , Nanjing 210029)
ABSTRACT　OBJECTIVE:To study the chemical constituents of Glycyrrhiza pallidiflora.METHOD:IR , 1H-NM R, 13C-NMR ,
MS and TLC w ere used to identify conpounds .RESULTS:Five compounds were elucidated as homopterocarpin , β-sitosterol , 4, 7-
dimethoxyiso flavone ,medicarpin and isog labrol.CONCLUSION:The 4, 7-dimethoxyisoflavone was first separated from this plant .
·11·中国药学杂志 1999 年 1 月第 34 卷第 1 期　　　　　　　　　Chin Pharm J , 1999 January , Vol.34 No.1