全 文 ：　2007年第 4期
辽 宁 林 业 科 技
Journal of Liaoning Forestry Science &Technology 2007№4
16个山杏无性系 POD及 PPO同工酶的比较研究①
刘青华1 ,刘明国1＊ ,赵桂玲1 ,董胜君1 ,刘立新2
(1.沈阳农业大学 林学院 , 辽宁 沈阳　110161;2.喀左县小城子林场 , 辽宁 喀左 　122300)
摘　要:采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ,对 16 个山杏无性系 1年生枝皮的过氧化物酶
POD及多酚氧化酶 PPO同工酶进行了分析研究 ,并采用聚类分析法对其亲缘关系进行比较和分
类。结果表明:POD同工酶共分离出13条酶带 ,其中 P1 、P2 和 P8 为 16个无性系所共有 ,且分离清
晰 ,可作为山杏无性系的特征酶带;PPO同工酶分离出 9条酶带 ,其中 P1′、P2′和 P6′分离清晰 ,为 16
个无性系所共有。
关键词:山杏;过氧化物酶;多酚氧化酶;同工酶
中图分类号:S662.2;Q55　　文献标识码:A　　文章编号:1001-1714(2007)04-0016-03
Comparative Study on Peroxidease and Polyphenol
for 16 Clones of Prunus sibirica
LIU Qing-hua1 ,LIUMing-guo1＊ ,ZHAO Gui-ling1 ,DONG Sheng-jun1 , LIU Li-xin2
(1.Forestry College of Shenyang Agricultural University , Shenyang 110161 , China;2.Kazuo County Xiaochengzi Forestry Farm ,
Kazuo 122300 , China)
Abstract:Peroxidase(POD)and polyphenol oxidase(PPO)in the peels of 16 Prunus sibirica clones were studied by means of
polyacrylamide gel slab electrophoresis.The relationships were compared by clustering analysis methods.The results showed that:
13 peroxidases and 9 polyphenol oxidases were separated;P1 , P2 and P8 in clones were similar and they were clearer and the par-
ticular enzyme bands;P1′, P2′and P6′were clearer and similar in clones.
Key words:Prunus sibirica;peroxidase(POD);polyphenol oxidase(PPO);isozyme
　　山杏作为一种抗旱 、抗寒 、耐瘠薄的生态经济树
种近年来在辽西半干旱地区发展很快。但生产中存
在坐果率低 、结实量小 、经济效益难以发挥的局面 ,
成为该地区山杏发展的一大障碍 ,为此 ,在辽宁省科
技攻关课题———山杏良种选育及丰产栽培技术研究
前期选出地方优株 ,并定植于辽西北票市林木良种
繁育中心山杏鉴定园内的基础上 ,对 16个优良无性
系枝皮的 POD 、PPO同工酶进行对比研究 ,以期探明
亲缘关系 ,为优良品系的选择提供依据 。
1　研究地区自然概况
试验地位于北票市北部林木良种繁育中心。地
理位置为东经 120°18′,北纬 42°28′,海拔 350m ,属低
山丘陵区。大陆性季风气候 , ≥10℃的年有效积温
为 3 502℃,年均气温 8.3℃,夏季炎热多雨 ,绝对气
温达40.7℃;冬季寒冷 、晴燥而少雪 ,绝对最低气温
达-26.4℃,全年无霜期 145 ～ 150d ,年均降水量 450
～ 550mm ,70%集中在 7 、8月份 ,年蒸发量 2 000mm ,
为降水量的 3 ～ 4倍。土壤为褐土类型 ,质地为沙壤
土 ,土层厚度 50 ～ 100cm ,pH 值 7 ～ 7.2 ,土壤肥力中
等 。植被属华北植物区系向蒙古植物区系过渡 ,除
山杏外 ,试验地还有紫穗槐 、荆条 、紫丁香等灌木及
茵陈蒿 、隐子草 、羊胡苔草 、碱草等草本;周围有油
松 、杨树 、柳树 、刺槐 、柞树等乔木。
2　材料与方法
2.1　材　料
2003年将 16个无性系定植于北票市林木良种
—16—
① 收稿日期:2006-09-24
基金项目:辽宁省科技攻关课题(2001207005)
＊通讯作者
繁育中心山杏鉴定园内 ,随机排列 ,株行距 2m×3m 。
调查的无性系代号 、母株号及母株来源地见表 1。
表 1　嫁接苗母株号 、来源及特点
无性系 母株号 母株来源地
4 LMK 009-2003 辽宁喀左老爷庙平房子沟里下位
14 2003-11 辽宁喀左刘官营子镇西南沟村七组
16 LMK057-2002 辽宁喀左六官营子镇西南沟村黄家沟
22 LMK024-2003 辽宁喀左大营子乡大仗子村二道梁子头道沟
6 LMK074-2002 辽宁喀左草场乡郭彩店村最上一株
10 LMK072-2002 辽宁喀左草场乡东汤村对面沟下位
11 LMK040-2002 辽宁喀左草场乡东汤村对面沟上位
41 CY1-2002 辽宁朝阳县张文相
42 CY4-2002 辽宁朝阳县大西洼
46 CY6-2002 辽宁朝阳县
28 AHM030-2002 内蒙赤峰敖汉市木头营子南一区
31 AHM036-2002 内蒙赤峰敖汉市木头营子南四区
35 AHM041-2002 内蒙赤峰敖汉市木头营子北一区
49 BP18-2002 北票林木良种繁育中心圃内
94 ELS1-2000 俄罗斯
2.2　取　样
2006年 7月取 1年生小枝的枝皮 ,每一无性系
取3份 ,用蒸馏水洗净后 ,用锡纸包裹 ,立即置于液
氮罐中保存。
2.3　制　样
取0.5g 叶片置于预冷研钵中 ,加 2ml 冷却的
Tris-Gly缓冲液(pH 值 8.3)及少许石英砂 ,冰浴条
件下充分研磨成匀浆。将匀浆转入离心管中 , 于
10 000rpm 、0 ～ 4℃条件下 ,在GL-20G-Ⅱ型高速冷
冻离心机上离心 20min ,取上清液转入新的离心管
中 ,加等体积 40%蔗糖及 1 滴 0.2%溴酚兰 ,放入
-30℃冰箱中备用 。
2.4　电　泳
采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,分离胶浓度
为7.5%,浓缩胶浓度为3%,电极缓冲液 pH值 8.3;
POD 、PPO的进样量分别为 30μl 、50μl;电泳在 4℃冰
箱中进行 。浓缩胶内电泳电压为 100V ,进入分离胶
后 ,电压调至 180V ,待溴酚兰迁移至距胶底端 1cm
时停止电泳。重复 3次 ,确定酶带的一致性。
2.5　染　色
过氧化物酶(POD):联苯胺 2g在 18ml冰乙酸中
微热溶解后 ,再加入蒸馏水 72ml。取该溶液 40ml ,
加30%过氧化氢溶液 0.8ml ,蒸馏水 159.2ml ,配成
200ml显色液。凝胶放入显色液后 ,室温下很快出现
蓝色酶带 ,待酶带清晰后立即用蒸馏水冲洗 , 7%乙
酸固定 ,拍照[ 1] ,计算酶带迁移率。
多酚氧化酶(PPO):0.06%邻苯二胺(0.01M 草
酸溶解):1%邻苯二酚:0.05M磷酸缓冲液(pH 值 6.
8)=1:3:1(V/V),染色大约需要 30min[ 2] 。凝胶取
出后 ,浸入染色液中 ,待凝胶出现清晰的深棕色酶带
后 ,约 5min左右取出凝胶用蒸馏水冲洗干净胶面 ,
7%乙酸固定 ,拍照 ,计算酶带迁移率。
3　结果与分析
3.1　POD同工酶分析
无性系共出现13条酶带 ,见图 1 、图 2。酶带的
Rf值依次为 0.1705 、0.2313 、0.2887 、0.3291 、0.4165 、
0.4365 、0.4626 、0.4950 、0.5113 、0.6988 、0.7154 、
0.7321 、0.7465。与上述酶带相对应 , 分别命名为
P1、P2 、P3 、P4 、P5 、P6 、P7 、P8 、P9 、P10、P11、P12 、P13 。从电
泳图谱可以看出 ,按酶带集中分布程度可分为慢区
S区(P1 ～ P4)、中区 M 区(P5 ～ P9)、快区 F 区(P10 ～
P13)。
图 1　1年生枝皮 POD同工酶酶谱图
所有无性系共同的酶带为 P1 、P2 、P8 ,其余 10条
全部为多态性标记 ,占 78.6%。由此可见 ,在 POD
同工酶上供试的 16个无性系间差异较大 ,生理分化
明显 ,但无性系间酶带差异程度各有不同 。酶带差
异最小的一组为 22号 、28号 、35号 、41号 ,与 6号 、
42号 、49号谱型相近 ,相差 1 ～ 2条酶带 ,相似性为
92.31%;10号 、31号 、39号也较相近 ,与上述无性系
的相似性为 65.79%;其它无性系差异较大。4号 、
16号 、94号酶带较少 ,仅出现 5条;46号最多 ,出现9
条 ,且 P9 、P10是其特有带。10号 、11号也各自显现出
一条有别与其它无性系的特征带 ,分别为 P6、P7 。
图 2　1年生枝皮 POD同工酶谱型图
3.2　PPO同工酶分析
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　第 4 期　　　　　　　　　刘青华等:16个山杏无性系 POD及 PPO同工酶的比较研究　　　　　　　　　　2007 年　
16个山杏无性系 1年生枝皮 PPO 同工酶电泳
图谱及谱型图见图 3 、图 4。由图 3和图 4可见 ,16
个无性系共出现 9条同工酶酶带 ,依次命名为 P1′～
P9′。电泳后谱带分离成两个区 ,即 S区和M 区。在
S区所有供试无性系共出现 3 条酶带 , Rf值依次为
0.1579 、0.2465 、0.2879 ,其中 Rf 值为 0.1579 、0.2465
两条酶带是所有无性系的公共带 , Rf值为 0.2879的
酶带出现频率也较高 ,达 93.75%,仅在 94号中未出
现;M 区出现 Rf值依次为 0.4454 、0.4594 、0.4790 、
0.5070 、0.5266 、0.5379 的 6 条带 , 其中 Rf 值为
0.4790的酶带是一条公共带。
图 3　1年生枝皮 PPO同工酶酶谱图
42号 、16 号 、46号 、49号 、6 号 、28号 、31号 、35
号 、41号共有 4条酶带 ,谱型相同;39 号 、94号谱型
相同 ,比上述无性系少一条带 ,相似性为 85.71%;Rf
值为 0.4454 、0.4594的酶带分别为 10号 、11号的特
有带;Rf值为 0.5266 、0.5379的两条带只出现在 46
号中 。
图 4　1年生枝皮 PPO同工酶谱型图
3.3　同工酶Q型聚类分析
依酶带位置及颜色深浅计算试材间欧氏距离 ,
做Q型聚类分析 ,绘制酶谱的系统聚类树系图[ 3] ,结
果如下:
据SPSS的有关数据 ,以欧氏距离 10为阈值 ,可
将 16个无性系分成 4个类群 ,第 Ⅰ类:35号 、41号 、
28号 、31号 、42 号 、6号 、49号 、14号 、4号 、16号 、22
号 、39号 、94 号;第 Ⅱ类:10 号;第 Ⅲ类:11 号;第 Ⅳ
类:46号 ,见图5。
图 5　1 年生枝皮 POD、PPO酶谱 Q型聚类分析树状图
4　讨　论
依据山杏的植物学性状进行分类 ,难免带来局
限性或片面性 ,难以揭示品种间亲缘关系的远近 ,特
别是形态十分接近的品种。同工酶是基因分子水平
的表现型 ,基因的微小变化会引起同工酶的变化 。
因此 ,可从同工酶谱的变化及酶谱特征了解品种间
的亲缘关系 。利用同工酶技术进行品种分类及亲缘
关系鉴定具有准确性高 、简便等优点 。
通过对 16 个山杏无性系 1 年生枝皮 POD 和
PPO同工酶进行分析 ,结果表明:POD 共分离出 13
条酶带;PPO同工酶共分离出 9 条酶带 ,酶谱简单 ,
分离清晰 ,因此可以把 POD 、PPO 同工酶结合起来作
为山杏无性系间亲缘关系鉴定的一个指标 。
由聚类分析结果可知 , 16个山杏无性系可分为
4类:46号为一类 ,11 号为一类 , 10号为一类 ,剩下
的 13个无性系为一类;同时 ,结合图 5还可得知 ,46
号与其它山杏无性系亲缘关系最远 ,可能为山杏品
种的一个变异种 。
参 考 文 献:
[ 1] 胡能书 , 万贤国.同工酶技术及其应用[ M] .长沙:湖南科
学技术出版社 , 1985.
[ 2] 袁艺.侧耳的酯酶 、多酚氧化酶及过氧化物酶同工酶的
电泳分析[ J] .安徽农业大学学报 , 1997 , 24(1):88-92.
[ 3] 苏金明 , 傅荣华 ,周建斌.统计软件 SPSS for Windows 实用
指南[ M] .北京:电子工业出版社 , 2000.
(责任编辑:张素清)
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　第 4期　　　　　　　　　　　　　　　　　　辽 宁 林 业 科 技　　　　　　　　　　　　　　　　　　2007 年