全 文 ：刺儿菜性别连锁的同工酶标记分析
洪达 , 孙富从 , 姬艳克 , 高武军 , 邓传良 , 卢龙斗＊　(河南师范大学生命科学学院 ,河南新乡 453007)
摘要　[目的] 利用刺儿菜进行同工酶分析 , 确定适合作为遗传标记的同工酶类型。[ 方法] 采用聚丙烯酰胺不连续垂直平板电泳
(PAGE)技术 ,对刺儿菜雌雄株花和叶片中过氧化物酶(POD),苹果酸脱氢酶(MDH),苹果酸酶(ME)及酯酶同工酶(EST)的差异进行比较
分析。[ 结果] POD、MDH及 EST同工酶在刺儿菜雌雄株的花和叶中存在明显的性别差异。在花和叶片中 , POD同工酶均发现了性别特
异的酶带 ,MDH同工酶仅发现在花中具有 1条雄性特异带 ,苹果酸酶同工酶(ME)没有明显的性别差异。除花中的酯酶酶谱外 ,两种同
工酶在同一性别的不同个体间 ,酶谱无明显差异。[结论] 同一种酶在刺儿菜叶片和花中的雌雄株酶谱有明显差异。
关键词　雌雄异株;刺儿菜;同工酶
中图分类号　Q789　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)09-03540-02
Analysis of the Sex-linked Isozyme Marker in Cephalanoplos segetum(Bunge)Kitam
HONG Da et al　(College of Life Science , Henan Normal University , Xinxiang, Henan 453007)
Abstract　[ Objective] The research aimed tomake the isozyme analysis on Cephalanoplos segetum(Bunge)Kitam and confirm suitable types of isozyme
as genetic marker.[Method] The vertical polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)technique were used to compare and analyze the differences among
peroxidase(POD), malate dehydrogenase(MDH), malic enzyme(ME)and esterase isozyme in the flowers and leaves of female and male plants in C.
segetum.[ Result] Isozymes POD , MDH and EST in the flowers and leaves of female and male plants in C.segetum had obvious sexual differences.The
isozyme bands of POD isozymes with special sex could be found in both the flowers and leaves.One male specific band of MDH isozymes was found only
in the flowers.And the isozymes of malic enzyme(ME)had no sexual difference.Except the zymogram of esterase in flowers , the zymogram of 2 kinds
of isosozymess had no obvious difference among different individuals with the same sex.[ Conclusion] The zymogram of the same kind of enzyme in the
leaves and flowers of male and female plants of C.segetum had obvious difference.
Key words 　Dioecism;Cephalanoplos segetum(Bunge)Kitam;Isozyme
基金项目　河南省自然科学基金(0611030300);河南省教育厅自然科
学基金(2006180014)。
作者简介　洪达(1982-),男 ,河南洛阳人 ,硕士研究生 ,研究方向:植
物遗传学。 ＊通讯作者。
收稿日期　2007-12-27
　　同工酶是位于同一基因位点上不同等位基因编码的具
有组织发育和物种特异性功能 ,但结构不同的酶[ 1] 。同工酶
在进化中具有一定的保守性 ,可用来对不同分类群的植物进
行比较 ,在植物的品种鉴定 、起源 、进化 、分类 、遗传育种等方
面都有广泛的应用[ 2-4] 。同工酶技术也被用来进行植物性
别的差异比较分析。Penel等曾发现菠菜的雌雄性别差异与
过氧化物酶同工酶的数目有关[ 5] 。Petig等也发现过氧化物
酶 、吲哚乙酸氧化酶与黄瓜性别表现密切有关[ 6] 。钟诲文等
利用过氧化物酶同工酶成功地鉴定了银杏植物的性别 ,进一
步阐明了过氧化物酶同工酶与性别表现的关系[ 7] 。E.
Maestri等认为 ,分析芦笋同工酶 ,可以绘制性染色体图谱 ,找
到同工酶标记和性别修饰基因中间的联系[ 8] 。显然 ,利用同
工酶技术也可为探求雌雄异株植物遗传性别决定机制的研
究提供参考依据。
刺儿菜[ Cirsium setosum(Willd.)MB.] [ 9] ,亦称小蓟 、刺
蓟 ,菊科 ,多年生草本植物 ,是典型的雌雄异株农田杂草植
物。刺儿菜带花全草或根茎均为药材 ,又可用作饲料 ,或作
为蜜源植物 。该研究利用刺儿菜进行同工酶分析 ,确定适合
作为遗传标记的同工酶类型 ,为性别的基因决定提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料　刺儿菜雌雄株叶片和花取自河南师范大学生物
原地实验田 。雌雄性别根据花的结构进行鉴定。随机取雌
雄各 10株 ,单株取样。
1.2　方法
1.2.1　酶液提取。在开花期分别取刺儿菜叶片和花 ,剪碎 ,
加入适量液氮 ,在冰浴中研磨 。将研磨碎的材料装入 1.5 ml
离心管中 ,加入 1 ml Na2HPO4-KH2PO4 提取缓冲液(Na2HPO4-
KH2PO4配比参照文献[ 10] ), 4 ℃放置 20 min , 4 ℃ 10 000
r/min离心 20 min 。取上清至新离心管中 , -20 ℃保存备用 。
1.2.2　同工酶分析。采用薄层垂直板聚丙稀酰胺凝胶电泳
法。常规方法制备分离胶(7%)、浓缩胶(4%)。在 0 ～ 4 ℃进
行电泳 ,电泳时间为 3 h ,电压 100 V ,电流 20 mA。同工酶的
特异性染色分析参照文献[ 10] 。
1.2.3　酶带命名。命名原则参照Gosling方法[ 11 ] ,即以各种
酶谱的相对迁移率(Rf)由小到大依次命名。
Rf =d
l
(1)
式中 , d 为酶带迁移距离 , l为指示剂迁移距离。
2　结果与分析
2.1　刺儿菜的过氧化物酶(POD)同工酶电泳结果与分析
图 1　刺儿菜叶片 POD同工酶电泳图谱
Fig.1　POD isozyme electrophoretograms in leaves of Cirsium seto-
sum(Willd.)MB.In leaves
2.1.1　叶片过氧化物酶(POD)同工酶电泳结果与分析 。从
图 1可以看出 ,雌雄株分离出 10条酶带 ,其 Rf 值由小到大依
次为 0.189、0.278 、0.311、0.467、0.533、0.556、0.600 、0.644 、
0.667、0.800。雄株比雌株多了 2条 Rf 为 0.278、0.311的酶
带 ,而少了 2条 Rf 为 0.467、0.644的酶带。 Rf 为 0.189 、
0.533、0.556、0.600、0.667、0.800的酶带为主酶带 ,雌雄株共
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 ,36(9):3540-3541 , 3544　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　李玮　责任校对　李玮
图 2　刺儿菜花POD同工酶电泳图谱
Fig.2　POD isozyme electrophoretograms in flowers of Cirsium seto-
sum(Willd.)MB.In flowers
有。另外 , Rf 为 0.556的酶带雌株比雄株强 ,而 Rf为0.667的
酶带雌株比雄株弱。
2.1.2　花过氧化物酶(POD)同工酶电泳结果与分析。由图 2
可见 ,雌株和雄株的花中酯酶同工酶共分离出 6条酶带 , Rf
值从小到大依次为 0.289、0.306 、0.556、0.589、0.644、0.800 ,其
中 4条酶带雌雄株共有 ,为主酶带。雄株比雌株少了 Rf 为
0.289、0.306的酶带 。
2.2　刺儿菜的酯酶(EST)同工酶电泳结果与分析
2.2.1　叶片酯酶(EST)同工酶电泳结果与分析。由图 3可
见 ,雌雄株共分离出 5 条酶带 ,酶带 Rf 值由小到大依次为
0.296、0.368 、0.400、0.424、0.448。整体来说 ,雌株叶片酯酶比
雄株活性高。就每条酶带来说 ,雄株比雌株多了 1条 Rf 为
0.424的酶带 ,而少了 2条 Rf为 0.400 、0.448的酶带。Rf 为
0.296、0.368的酶带为主酶带 ,雌雄株共有。另外 ,Rf 为0.296
和 0.368的酶带 ,雌株比雄株活性高。
图 3　刺儿菜叶片 EST同工酶电泳图谱
Fig.3　EST isozyme electrophoretograms in leaves of Cirsium seto-
sum(Willd.)MB.In leaves
图 4　刺儿菜花 EST同工酶电泳图谱
Fig.4　EST isozyme electrophoretograms in flowers of Cirsium seto-
sum(Willd.)MB.In leaves
2.2.2　花酯酶(EST)同工酶电泳结果与分析。由图 4可见 ,
雌株和雄株的花中酯酶同工酶也共分离出 3条酶带 ,Rf 值从
小到大依次为 0.296、0.376、0.448 ,其中 Rf 为 0.296的酶带为
雌雄株所共有 ,为主要酶带。雄株比雌株多了 2 条 Rf 为
0.376的酶带 。另外 ,Rf为 0.296的酶带 ,雌株比雄株活性高。
2.3　刺儿菜的苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶电泳结果与分析
2.3.1　叶片苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶电泳结果与分析 。
由图 5可见 ,雌雄株电泳仅仅分离出 1条 Rf 为 0.263的酶
带 ,为雌雄株共有。刺儿菜雌雄株叶片酶谱在苹果酸脱氢酶
同工酶中无明显差异。
2.3.2　花苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶电泳结果与分析 。由
图 6可见 ,雌株和雄株的花中苹果酸脱氢酶同工酶共电泳分
离出 2条酶带 , Rf 值从小到大依次为 0.188、0.225 ,其中 Rf
为 0.188的酶带为雌雄株所共有 ,为主要酶带 。雄株比雌株
仅多了 1条 Rf 为 0.225的带。另外 ,雌株Rf为 0.188的酶带
比雄株活性高 。
图 5　刺儿菜叶片MDH同工酶电泳图谱
Fig.5　MDH isozyme electrophoretograms in leaves of Cirsium seto-
sum(Willd.)MB.
图 6　刺儿菜花MDH同工酶电泳图谱
Fig.6　MDH isozyme electrophoretograms in flowers of Cirsium seto-
sum(Willd.)MB.
2.4　刺儿菜的苹果酸酶(ME)同工酶电泳结果与分析　刺
儿菜雌雄株叶片的苹果酸酶同工酶酶谱基本一致 ,无明显差
异 ,仅分离出 1条酶带。由于存在个体差异性 ,条带间强弱
略有不同。虽经多次重复 ,雌雄花的苹果酸酶同工酶均未显
示条带 ,说明刺儿菜花的苹果酸酶活性极弱或没有活性。
3　讨论
雌雄异体生物的发育生物学资料表明 ,在个体发育过程
中 ,雌雄个体之间在生殖器官中的生理生化特征差异较大 ,
而在营养器官中的生理生化特征差异较小或者几乎没有差
异。雌雄个体间的这种明显差异与生物体的性别有密切的
关系 ,这为找到性别相关的生理生化标记提供了可能。从该
研究结果可以看出 ,同一种酶在刺儿菜的叶片和花中的雌雄
株酶谱差异明显 ,过氧化物酶 ,苹果酸脱氢酶及酯酶同工酶
的迁移率和酶活在刺儿菜的不同器官雌雄株中存在着性别
连锁的特异标记;苹果酸酶同工酶的迁移率和酶活在刺儿菜
(下转第 3544页)
354136卷 9期　　　　　　　　　　　　　　　　洪达等　刺儿菜性别连锁的同工酶标记分析
结构和功能的异常[ 4] ,而随着 p53研究的深入 ,发现禽白血
病[ 5] 、牛的白血病[ 6]及犬的结肠直肠癌[ 7] 、乳腺瘤[ 8] 等动物
的肿瘤疾病也有 p53的突变。虽然 , p53的突变导致了肿瘤
的发生 ,但研究发现 ,突变的 p53在体外能够结合 DNA ,保持
野生型构象 ,但是在体内没有转录活性[ 9] 。
p53抑癌基因分为野生型和突变型两种 ,其编码产物
p53蛋白是应激性蛋白 ,在正常情况下 ,以野生型形式存在 ,
维持较低水平 ,在细胞中不发挥作用 ,只有在细胞受到刺激
后 ,引起细胞核内 p53蛋白水平的升高 , p53才开始发挥其细
胞周期阻滞 、细胞凋亡 、维持基因组稳定等转录因子的功
能[ 10] 。该实验发现 ,在马立克氏病的发生中 ,突变型抑癌基
因 p53在病鸡的肝脏 、肾脏 、肿瘤 、心脏 、脾脏 、肺脏 、胸腺及
法氏囊中均可检出中等量的表达 。p53发生突变时所产生的
p53蛋白突变体其半衰期较未发生突变时要长 ,可以在细胞
内堆积 ,用免疫组化法可测到 。
实验中 ,免疫组化染色 p53在体外培养感染马立克病毒
的鸡胚成纤维细胞呈阳性。分析其可能的原因是:在体外培
养的鸡胚成纤维细胞感染马立克病毒后 ,基因毒应激引起细
胞内DNA损伤 ,导致各种蛋白激酶被激活从而引起 p53的
表达活化。
马立克氏病的发生是多原因 、多因素的结果 ,而MDV致
瘤基因的表达或者细胞原癌基因的激活是其中之一[ 11] 。研
究发现 ,最可能的候选致瘤基因 meq所表达的meq蛋白能够
与 p53碳端四聚体的结构域相结合 ,也可能通过干扰 p53与
DNA的结合来促进细胞的增殖[ 12] 。而突变型 p53基因不仅
失去抑制癌变等功能 ,还具有直接转化细胞和阻碍野生型
p53发挥作用的特点 ,致使突变的 DNA得以积累 ,最终癌变。
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(上接第 3541页)
的不同器官中有一定差异 ,而雌雄株之间没有明显差异。雌
雄异体生物性别相关的同工酶标记在动物中也已经被发现。
苹果酸酶基因在两栖类是性别连锁基因 ,其表达与性别相
关[ 12-13] 。因此 ,苹果酸酶 、苹果酸脱氢酶和酸性磷酸酶同工
酶在雌雄文昌鱼个体之间酶谱带的数量和迁移率也存在明
显差异[ 14] 。显然 ,不同的同工酶在生物的性别决定和分化
中扮演不同的角色。植物中过氧化物酶 、多酚氧化酶被认为
与植物的性别分化有关[ 15-16] 。但是值得注意的是 ,植物个
体发育中的时空特异性等原因会影响同工酶表型的可靠性 ,
甚至会产生矛盾的结果 。因此 ,在研究同工酶作为性别的特
异标记的同时 ,需要进一步探索其作用机制和表达特性。
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3544 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年