全 文 ：食用菌学报 2011.18(2):57～ 61
收稿日期:2011-04-28 原稿;2011-06-05 修改稿
基金项目:上海市农委重点攻关项目[ 编号:沪农科攻字(2008)第 8-2 号]的部分研究内容
作者简介:蒋　俊(1986-), 男 ,南京农业大学生命科学学院微生物系在读硕士研究生 , 主要从事猴头菌多糖提取 、
脱色工艺及生物活性方面研究 。
＊本文通讯作者　E-mail:yangyan9200@yahoo.com.cn
文章编号:1005-9873(2011)02-0057-05
醇沉条件对猴头菌多糖得率和品质的影响
蒋　俊1 , 2 , 3 , 罗　珍1 , 刘艳芳2 , 彭川丛1 , 吴　迪2 , 周　帅2 , 张劲松2 , 冯志勇2 , 杨　焱2＊
(1无限极中国有限公司 ,广东广州 510665;2农业部南方食用菌资源利用重点实验室, 国家食用菌工程技术研究中心 ,
上海市农业遗传育种重点开放实验室 , 上海市农业科学院食用菌研究所 , 上海 201403;
3南京农业大学生命科学学院 ,江苏南京 210095)
摘　要:以粗多糖得率和含量为评价指标 ,对水提醇沉制备猴头菌多糖(Hericiu m erinaceus polysacchar ides ,
HEP)工艺中主要醇沉条件进行了筛选 ,得出猴头菌多糖醇沉的最佳工艺条件:提取液的浓缩比(粗提液体积∶
子实体干重 ,mL∶g)为 3∶1 , 醇沉浓度 70%,加入乙醇时浓缩液温度为 40 ℃, 醇沉时间和静置温度分别为 8 h
和 4 ℃。不同醇沉浓度得到的多糖分子量分布及体外免疫活性测定结果表明 , 醇沉浓度为 40%时 , 得到的多
糖大分子部分占的比例较高 ,活性较好。醇沉浓度越高 ,多糖含有的小分子物质越多。
关键词:醇沉工艺;浓缩比;醇沉浓度;分子量分布;免疫活性
　　猴头菌(Hericium erinaceus)在分类学上隶
属担子菌门(Basidiomycota), 红菇目(Russu-
lales), 猴菇科(Hericiaceae), 猴菇属(Herici-
um)[ 1] 。猴头菌性平 、味甘 ,能利五脏 ,助消化 ,
滋补 ,抗癌 ,治疗神经衰弱[ 2] 。国内已经广泛用
于医治消化不良 、胃溃疡 、食道癌 、胃癌 、十二指
肠癌 、贲门癌等消化系统的疾病[ 3-7] 。猴头菌多
糖(H .erinaceus po ly saccharides , HEP)是猴头
菌活性物质中最重要的成份之一[ 8 , 9] ,可通过刺
激免疫系统中的自然杀伤细胞 、T 细胞 、B细胞和
巨噬细胞来发挥作用[ 10] 。多糖制备过程中 ,醇沉
时提取液浓缩比(粗提液体积∶子实体干重 , mL∶
g)、醇沉浓度等对多糖的得率和品质有较大的影
响 ,笔者以多糖含量作为品质的主要评价指标 ,
考察了醇沉条件对猴头菌多糖得率和品质的影
响 ,对猴头菌多糖醇沉工艺进行优化 ,为其工业
生产提供参考。
1　材料与方法
1.1 材料及试剂
　　猴头菌(H .erinaceus)子实体由无限极中国
有限公司提供 ,产地为福建 。子实体于 60 ℃烘
干后用粉碎机粉碎(DJ-10A ,上海淀久中药机械
制造有限公司)。RAW264.7骨髓巨噬细胞株购
自美国典型菌种中心(American Type Culture
Collecction , ATCC)。
葡聚糖标准品(分子量分别为 12 、25 、50 、
80 、150 、270 、410 、670 kDa)为 Sigma-A ldrich 公
司产品;DMEM 培养基 、RPMI-1640 培养基 、胎
牛血清为 Gibco 公司产品;青霉素 、链霉素为
Amersco 产品;细菌脂多糖(lipopoly saccharide ,
LPS)为 Sigma公司产品 。其它试剂均为国产分
析纯 。
1.2 方法
1.2.1 粗提液制备
　　称取一定量的猴头菌子实体粉末(180 ～
270 g),按料液比 1∶18(w∶v)加入蒸馏水 , 100 ℃
提取 2 h ,过滤后提取液于 6 471 g 离心 30 min ,
弃沉淀 ,得到猴头菌多糖的粗提液 。
1.2.2 提取液浓缩比的筛选
　　将 1.2.1得到的提取液分成 5 等份 ,分别按
浓缩比(粗提液体积∶子实体干重 , mL∶g)1∶1 ,
2∶1 , 3∶1 , 4∶1 , 5∶1减压浓缩 ,再将每份浓缩液分
成 3等份置于 250 mL 的三角瓶中 ,浓缩液温度
为 20 ℃时 ,每份加入无水乙醇至醇浓度为 70%
(乙醇的体积百分比),用封口膜封口 , 15 ℃静置
食　用　菌　学　报 第 18 卷
12 h ,6 471 g离心 15 min ,弃上清 ,沉淀用 15 mL
相同浓度的乙醇洗涤 , 6 471 g 离心 15 min ,收集
沉淀 ,水浴挥去乙醇后置于 60 ℃烘干 ,称量 ,计
算粗多糖得率 ,用苯酚-硫酸法测定糖含量[ 12] ,以
多糖含量为指标找出最佳的浓缩比 。
1.2.3 醇沉浓度的筛选
　　按1.2.1方法得到的提取液以1.2.2的最佳
浓缩比浓缩 ,加无水乙醇至醇浓度分别为 40%、
50%、60%、70%和 80%, 每个处理设 3个重复 ,
其余操作参考 1.2.2 ,以多糖含量为指标 ,找出最
佳的醇沉浓度。
1.2.4 浓缩液温度的筛选
　　按1.2.1方法得到的提取液以1.2.2的最佳
浓缩比浓缩 ,在浓缩液温度分别为 20 、40 、60 和
80 ℃时加入无水乙醇 ,使醇浓度为 1.2.3得到的
最佳浓度 ,每个处理设 3 个重复 ,其余操作参考
1.2.2 ,考察浓缩液温度对多糖得率的影响 ,选择
适宜的温度。
1.2.5 醇沉时间的筛选
　　按1.2.1方法得到的提取液以1.2.2的最佳
浓缩比浓缩 ,在 1.2.4的最佳温度下加入无水乙
醇至最佳醇沉浓度 ,分别于 15 ℃静置 4 、8 、12 、
24和 36 h ,每个处理设 3个重复 ,其余操作参考
1.2.2 ,选择最适宜的静置时间 。
1.2.6 醇沉静置温度的筛选
　　按1.2.1方法得到的提取液以1.2.2的最佳
浓缩比浓缩 ,在 1.2.4的最佳温度下加入无水乙
醇至最佳醇沉浓度 ,分别静置于 4 ℃和 15 ℃,每
个处理设 3个重复 ,其余操作参考 1.2.2 ,选择多
糖得率高的静置温度 。
1.2.7 不同醇沉浓度沉淀多糖的分子量分布特征
　　葡聚糖标准品用 0.1 mo l/L 的磷酸缓冲液
(pH 7.0)配成 2 mg/mL 的溶液 ,上 HPLC(Wa-
ters 600)测定每个标准品的保留时间 。将 1.2.3
中不同醇沉浓度沉淀的多糖样品用0.1 mol/L的
磷酸缓冲液(pH 7.0)配成 5 mg/mL 的溶液上
HPLC ,分析其分子量分布特征 。HPLC 色谱条
件:色谱柱 TSK-GEL G3000PWXL 串联 TSK-
G EL G4000PWXL ;2410 示差折光检测器;流动
相为 NaNO 3∶NaH2 PO 4 =3∶1 , 用 NaOH 调 pH
至 7.0;流速为0.3 mL/min ,上样量 20 μL 。
1.2.8 不同醇沉浓度沉淀的多糖对体外刺激巨
噬细胞释放 NO的影响
　　在无菌条件下将 1.2.3中得到的多糖样品
用 PBS(含 0.14 mol/L NaCl , 0.027 mol/L
KCl , 0.004 mol/L Na2 HPO4 , 0.002 mol/L
KH2PO4 , pH 7.4)配成 25 、50 、100 μg/mL 的溶
液。参考文献[ 12]的方法测定巨噬细胞释放 NO
的产量。
2　结果与分析
2.1 浓缩比对多糖得率和含量的影响
　　表 1 为提取液按不同浓缩比浓缩醇沉后的
粗多糖得率和糖含量 ,结果表明 ,得率随浓缩比
增大而降低 ,浓缩比为(1∶1)～ (3∶1)时 ,样品中
的糖含量逐渐增大 ,3∶1以后无显著差异。因此 ,
本实验选择 3∶1为最佳浓缩比。
表 1　不同浓缩比的多糖得率和含量
Table 1　Yield and polysaccharide content of ethanol precipitated material obtained from aqueous extracts of
H.erinaceus fruit bodies after different degrees of concentration
浓缩比
Concentr ation r atio (extr act volume∶
dry weight of f ruit body , mL∶g)
得率
Yie ld(%)
多糖含量
Polysacchar ide content(%)
1∶1 4.67±0.19 a 33.65±1.02 b
2∶1 3.72±0.07 b 35.93±0.40 b
3∶1 3.12±0.02 c 44.12±0.80 a
4∶1 2.89±0.01 d 43.68±1.78 a
5∶1 2.75±0.13 d 45.58±2.99 a
　　　差异显著水平为 0.05　Signi fican ce at P<0.05
2.2 醇沉浓度对多糖得率和糖含量的影响
　　多糖得率随醇沉浓度增加而增大 ,在醇沉浓
度为 40%～ 70%区间内 ,多糖样品中的糖含量随
醇沉浓度增高而增大 ,在醇沉浓度为 80%时 ,多
糖含量显著降低(表 2),因此选择 70%为最佳醇
沉浓度。
58
第 2 期 蒋　俊 ,等:醇沉条件对猴头菌多糖得率和品质的影响
表 2　不同醇沉浓度的多糖得率和含量
Table 2　Yield and polysaccharide content of material precipitated using different ethanol concentrations
醇沉浓度
Ethanol concentr ationused for pr ecipitation(%)
得率
Yield(%)
多糖含量
Polysacchar ide content(%)
40 1.03±0.03 e 40.85±1.42 b
50 1.41±0.04 d 41.44±3.19 b
60 1.84±0.01 c 47.34±2.10 a
70 2.54±0.01 b 49.80±1.46 a
80 3.74±0.02 a 39.50±0.58 b
差异显著水平为 0.05　Signi fican ce at P<0.05
2.3 浓缩液温度对多糖得率和含量的影响
　　醇沉时浓缩液温度对多糖得率和糖含量的
影响见表 3。结果表明 ,各处理间的糖含量无显
著差异 , 浓缩液温度较低时醇沉的得率较高 ,
20 ℃与 40 ℃间没有显著差异 ,因此选择 40 ℃为
适宜的温度。
表 3　浓缩液在不同温度时醇沉的多糖得率和含量
Table 3　Yield and polysaccharide content of material
precipitated with ethanol from aqueous extracts at
different initial temperatures
温度
Extr act
temperature(℃)
得率
Yield(%)
多糖含量
Polysacch aride
content(%)
80 2.45±0.04 b 46.33±1.42 a
60 2.37±0.02 b 45.56±3.50 a
40 2.56±0.02 a 43.81±1.67 a
20 2.57±0.03 a 45.82±0.48 a
差异显著水平为 0.05　Signi fican ce at P<0.05
2.4 醇沉时间对多糖得率和含量的影响
　　不同醇沉时间下多糖得率和糖含量的测定
结果(表 4)表明 ,醇沉4 h的多糖得率最低 ,其余
处理间无差异 ,因此 ,8 h为适宜的醇沉时间 。
表 4　不同醇沉时间的多糖得率和含量
Table 4　Yield and polysaccharide content of material
precipitated from aqueous extracts with ethanol
for dif ferent times
醇沉时间
Prec ipit ation
time(h)
得率
Yield(%)
多糖含量
Polysacch aride
content(%)
4 2.83±0.02 b 48.82±1.21 a
8 2.94±0.01 a 49.90±4.19 a
12 2.99±0.05 a 49.00±3.81 a
24 2.98±0.05 a 47.43±2.88 a
36 3.10±0.08 a 48.57±1.10 a
差异显著水平为 0.05　Signi fican ce at P<0.05
2.5 醇沉静置温度对多糖得率和含量的影响
　　在 4 ℃静置醇沉的多糖得率为(3.13 ±
0.09)%,糖含量为(47.26±0.50)%, 15 ℃下的
多糖得率为(2.81±0.04)%,糖含量为(49.23±
0.95)%。4 ℃的得率显著高于 15 ℃的 , 因此
4 ℃为适宜的静置温度 。
2.6 不同醇沉浓度沉淀多糖的分子量分布特征
　　不同醇沉浓度沉淀多糖的 HPLC 图谱表明
分子量为 12 、25 、410 kDa 的标准品的出峰时间分别是 55 、50 、41 min
Retent ion tim es of stan dards wi th molecular weight of 12 , 25 and 410 kDa w ere 55 , 50 and 41 min , respectively 40%, 50%, 60%, 70%,
80% indicate polys accharide precipitated at these ethanol concent rat ions
图 1　不同醇沉浓度沉淀多糖的高效液相色谱图
Fig.1　Chromatography of polysaccharide precipitated using different ethanol concentrations
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食　用　菌　学　报 第 18 卷
(图 1),猴头菌多糖的分子量主要集中在 12 ～
25 kDa之间;醇沉浓度为 40%时得到的多糖大分
子部分占的比例较高;醇沉浓度为 70%、80%时
得到的多糖含有较多的小分子物质 。
2.7 不同醇沉浓度沉淀的多糖对体外刺激巨噬
细胞释放 NO的影响
　　图 1 为不同醇沉浓度沉淀多糖对体外刺
激巨噬细胞释放 NO 的影响 。结果表明 ,醇沉
浓度为 40%时得到的多糖活性最好 , 在试验
浓度范 围内 的 活 性均 好 于 阴 性对 照 , 在
25 μg/mL浓度时就表现出活性作用 ,醇沉浓度
为 60%和 70%得到的多糖样品只有在高浓度
时活性略好于阴性对照 ,其它的与阴性对照差
异不大 。
PBS:磷酸缓冲盐为阴性对照;LPS:细菌脂多糖为阳性对照
PBS:phosph ate bu ffer (n egat ive cont rol);LPS:lipopolysacch aride (posi tive cont rol);40%, 50%, 60%, 70%, 80% in dicate polysac-
charid e pr ecipi tated at these ethanol concen trat ions
图 2　不同醇沉浓度沉淀多糖对体外刺激巨噬细胞释放 NO的影响
Fig.2　Effect on NO release from RAW264.7 cells of polysaccharide precipitated using different ethanol concentrations
3　讨论
　　醇沉工艺是猴头菌多糖制备中的一个重要
环节 ,对猴头菌多糖的得率和品质有直接的影
响。考虑多糖得率 ,最佳浓缩比为 1∶1 ,但从多
糖品质考虑最佳浓缩比为 3∶1 。浓缩比和醇沉
浓度的增加有利于多糖沉淀 ,但同时也使沉淀
中的杂质含量增加 , 因此 , 在多糖的工业生产
中 ,可根据不同的目的来选择浓缩比和醇沉浓
度。高温时 ,分子运动较快 ,不利于聚集成沉
淀 ,低温更有利于沉淀的生成 ,在生产中 ,等浓
缩液冷却后加入乙醇有利于提高多糖得率 ,另
外若有条件 ,可以考虑放入 4 ℃的环境中静置 。
实验结果表明醇沉 8 h后多糖得率已稳定 ,在生
产中选择合适的醇沉时间可以减少多糖的生产
周期 ,提高生产效率 。多糖品质包括多糖含量 、
分子量分布 、单糖组成 、生物活性等 。多糖发挥
生物学活性通常需要其分子质量在一定范围
内[ 13] 。醇沉浓度对多糖分子量分布和免疫活性
都有影响 ,在生产中可以针对目标产物来选择
醇沉浓度 。
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Effect of Precipitation Conditions on the Yield
and Quality of Hericium erinaceus Polysacchar ides
JIANG Jun
1 , 2 , 3 , LUO Zhen1 , LIU Yanfang2 , PENG Chuancong1 ,
WU Di
2 , ZHOU Shuai2 , ZHANG Jingsong2 , FENG Zhiyong2 , YANG Yan2＊
(1I nf initus Company Ltd , Guangzh ou , Guangdong 510000 , China;2National Engineer ing Resear ch Center of
Edible Fungi;Shanghai Key Labora tory of Agricultur al Genetics and Breeding;Institute of Edible Fungi ,
Shanghai Academy of Agr icultur al Sciences , Sh anghai 201403 , Chin a;3College of Lif e Sciences ,
Nanjing Agr icultural University , Nanjing , Jiangsu 210095 , China)
Abstract:The conditions used for e thanol pr ecipitation of Hericium erinaceus polysacchar ides from aqueous
extr acts of mushroom fruit bodies were optimized based on yield and polysacchar ide content.Higher yields
and polysacchar ide contents were obta ined under the following conditions:concentra tion r atio(extr act vol-
ume∶dry weight of f ruit body), 3∶1(mL∶g);ethanol concentra tion used for precipita tion , 70%;initial tem-
per ature of concentr ated extr act , 40 ℃;precipitation time and temperature , 8 h and 4 ℃ r espectively.Mo-
lecular we igh t distr ibution determinations r evealed that the propor tion of macromolecula r mater ial was high
in polysacchar ide pre cipitated with 40% ethanol , while incr easing ethanol concentr ations prec ipit ated more
mater ial of lower molecula r weight.Polysaccharide pr ecipita ted with 40% e thanol also exhibited highe r im-
munological activity.
Key words:Ethanol pr ecipitation;concentr ation r atio;ethanol concentr ation;immunological competence
[本文编辑] 　朱丽娜
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