全 文 ：正交实验优选亮菌多糖的醇沉工艺
张　平1, 2 ,宋群亮 2 ,黄赵刚 1 ,刘丽萍1 ,孙旭群 1 ,程　钢 1
(1.安徽医科大学第一附属医院药剂科 , 安徽 合肥 230022;2.安徽医科大学药学院 , 安徽 合肥 230032)
摘要:目的　确定亮菌多糖的醇沉工艺。方法　以亮菌多糖含量和得率为指标 , 采用正交实验法优选亮菌多糖的醇沉工艺。结
果　亮菌多糖醇沉最佳条件:提取液浓度 1/6g生药 /ml, 醇浓度 80%,醇沉方式流入 ,醇沉 6h。结论　优化的亮菌多糖醇沉工
艺简便 、合理可行。
关键词:正交实验;亮菌;多糖;醇沉工艺
Optimizationofalcoholprecipitationtechniquesfor
polysaccharidesfromArmilarielatabescensbyorthogonaltest
ZHANGPing1, 2 , SONGQun-liang2 , HUANGZhao-gang1 , LIULi-Ping1 , SUNXu-Qun1 , CHENGGang1
(1.DepartmentofPharmacy, TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity, Hefei230022;
2.DepartmentofPharmacy, AnhuiMedicalUniversity, Hefei230032)
Abstract:Aim　TodeterminethealcoholprecipitationtechniquesforpolysaccharidesfromArmilarielatabescens.Method　Thealcohol
precipitationprocesswasstudiedwithyieldandcontentofpoysaccharidebyorthogonaltest.Result　Theoptimumprocesswasdetermined
asfolowing:thesolutionwasconcentratedto1/6gArmillariellatabescenspermililiterandprecipitatedwiththealcoholconcentrationof
80% andthetimeof6hoursbydriping.Conclusion　Theoptimumalcoholprecipitationprocesswassimple, resonableandreliable.
Keywords:orthogonaltest;armilariellatabescens;polysaccharides;alcoholprecipitationtechniques
　　亮菌 [ Armillariellatabescens(Scop.ex.fr)Sing]是一种能
发光的担子菌 , 分布于江苏 、浙江 、四川 、河北 、安徽等地 , 在我
国民间流传用于治疗急慢性肝炎及胆道疾患。亮菌多糖是亮
菌中主要有效成分之一 , 现代药理研究表明亮菌多糖具有保
肝 [ 1, 2] 、防辐射 [ 3] 、增强免疫 [ 4]和抗肿瘤 [ 5]等多种功效 , 有非
常广阔的开发前景。为充分从亮菌水提液中醇沉出亮菌多糖
有效成分 , 选择亮菌多糖含量和得率作为评价指标 , 采用正交
实验法对亮菌多糖的醇沉工艺进行实验研究 , 为亮菌多糖的
进一步开发提供实验基础。
1　材料
TU-1800SPC紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责
任公司);AB135-S百万分之一电子天平(METTLERTOLEDO
公司);D-无水葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所 ,
0833-9501);亮菌多糖水提液;乙醇(95%, AR);苯酚(AR);
硫酸(98%, AR)。
基金项目:安徽省教育厅自然科学基金项目(No2002kj138)
作者简介:张　平 ,主任药师 ,硕士生导师 ,研究方向:中药新药的研究
开发 , Tel:0551-2922422, E-mail:zhangping ay@sohu.com
2　方法与结果
2.1　多糖含量的测定 [ 6, 7]
2.1.1　对照品溶液的配制　精密称取葡萄糖对照品 25 mg,
置 100ml容量瓶中加适量蒸馏水溶解 , 定容 , 摇匀 , 即得浓度
为 0.25 g· L-1的对照品溶液。
2.1.2　供试品溶液的配制　精密称取正交项下样品各 4.0
mg, 置 10 ml容量瓶中 , 加蒸馏水适量使充分溶解 , 用蒸馏水
稀释至刻度 , 摇匀 ,即得。
2.1.3　标准曲线的制备　分别精密吸取对照品溶液 0.1、 0.
2、 0.3、0.4、0.5 ml, 于 10 ml具塞试管中 , 各以水补充至 2.0
ml,然后加入 6%的苯酚溶液 1 ml及浓硫酸 5 ml, 静置 10
min, 摇匀 ,室温下放置 20min后于 490 nm处测定吸收度 , 另
以同样处理的 2 ml水作为空白对照。以对照品溶液浓度为
横坐标(X), 吸收度值(Y)为纵坐标 , 绘制标准曲线 , 得回归
线性方程:Y=-0.0228 + 0.0465X, r=0.9998, 线性范围:
3.1 ～ 15.6 mg· L-1。
2.1.4　稳定性实验　取葡萄糖对照品溶液 0.3 ml,按 2.1.3
决了中药制剂贮存期吸潮和起效缓慢问题 , 又避免了其有效
成分挥发油的散失 , 且便于携带 , 是一种很有前途的剂型 , 为
慢性盆腔炎患者带来了方便。
参考文献:
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(收稿日期:2006 -09-04)
·395·安 徽 医 药　AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal　2007May;11(5)
项下方法显色 , 每隔 20 min测定吸光度 , RSD为 0.33%, 结果
表明 2 h内显色稳定。
2.1.5　加样回收率实验　精密称取已知含量的样品 5份 , 分
别加入葡萄糖对照品 5 mg, 加水溶解并定容至 50 ml容量瓶
中 , 取溶液适量 ,按 2.1.3项下方法操作测定 , 计算出平均回
收率为 99.78%, RSD为 0.99%。
2.1.6　样品中多糖含量的测定　分别精密吸取各供试液
0.3ml, 按 2.1.3项下方法操作 ,分别测定各样品吸收度 , 由
回归方程求得供试液中多糖的重量(mg)。 按下式计算多糖
含量和多糖得率 , 多糖含量(%)=多糖重量 /沉淀物重量 ×
100%;多糖得率(%) =多糖重量 /菌丝体重量 ×100%。
2.2　亮菌多糖醇沉工艺条件优选
2.2.1　实验设计　采用正交实验法 ,以亮菌多糖含量和得率
为指标 , 选择提取液浓度 、醇沉浓度 、醇沉方式和静置时间 4
个影响醇沉效果的因素为考察因素 ,各因素水平设计见表 1。
表 1　因素水平表
水平 因素 A提取液浓度 /g生药 /ml
因素 B
醇沉浓度 /%
因素 C
醇沉方式
因素 D
静置时间 /h
1 1/5 80 滴入 24
2 1/6 70 流入 12
3 1/8 60 倾入 6
　　注:其中因素 C的水平排列为随机排列
2.2.2　实验方法与结果　将亮菌菌粉优化水提条件制备的
水提液 [ 8]等分成 9等份 , 按表 1项下条件进行醇沉。 按 2.1
项下方法测定并计算多糖含量和得率 ,以二者为衡量的指标。
数据处理采用权评分法。评分标准为:设定多糖含量(x)和
多糖得率(y)两者的权重系数均为 1,对两项指标进行加权求
和。通过公式 z=x+y,得到综合评分(z), 正交实验结果见
表 2。采用 Spss11.5对正交实验结果进行方差分析 , 结果见
表 3。
表 2　正交实验结果
实验号 因素 A因素 B因素 C因素 D多糖含量/%
多糖得率
/%
综合
评分
1 1 1 1 1 60.0828 5.4391 65.5219
2 1 2 2 2 56.0536 7.9476 64.0012
3 1 3 3 3 49.7606 7.9458 57.7064
4 2 1 2 3 58.4219 9.9439 68.3658
5 2 2 3 1 51.285 9.3853 60.6703
6 2 3 1 2 52.949 5.3619 58.3109
7 3 1 3 2 41.413 7.6935 49.1065
8 3 2 1 3 42.4328 5.5561 47.9889
9 93 3 2 1 41.9007 6.1350 48.0357
K1 62.410 60.998 57.274 58.076
K2 62.449 57.553 60.134 57.140K3 48.377 54.684 55.828 58.020
R 14.072 6.314 4.306 0.936
表 3　方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
A 394.9413 2 197.4706 238.5104 <0.01
B 59.9604 2 29.9802 36.2109 <0.05
C 28.8188 2 14.4094 17.4041
误差(D) 1.6558 2 0.8279
注:F0.05(2, 2)=19, F0.01(2, 2)=99
　　由表 2可知影响亮菌多糖含量和得率的醇沉因素的主次
顺序为提取液浓度(A因素)>醇沉浓度(B因素)>醇沉方
式(C因素)>静置时间(D因素),根据 K值和极差 R值考虑
最优方案选 A2B1C2D1。方差分析表明:提取液浓度(A因素)
对亮菌多糖醇沉影响极显著(P<0.01), 醇沉浓度(B因素)
对亮菌多糖醇沉影响显著(P<0.05), 醇沉方式(C因素)和
静置时间(D因素)对亮菌多糖醇沉影响不显著(P>0.05),
考虑到生产成本和生产条件 , 因素 D选择 D3 , 因此最优方案
为 A2B1C2D3 ,即:亮菌多糖水提取液减压浓缩至溶液浓度为
1/6 g生药 /ml,在搅拌状态下 , 以流入的方式加入 95%乙醇
使醇浓度达 80%, 静置 6h。
3　讨论
本文采用苯酚-硫酸比色法测定亮菌多糖的含量 ,多糖在
浓硫酸作用下 , 先水解成单糖 , 并迅速脱水生成糖醛衍生物 ,
与苯酚反应生成橙黄色溶液 , 此溶液经 400 ～ 700 nm扫描表
明在 490nm处有最大吸收 ,因此选定为测定波长。此法具有
简单 、快速 、灵敏 、重复性好等优点 ,可作为亮菌多糖含量的测
定方法。
以亮菌多糖含量和得率为指标 , 由正交实验的直观分析
和方差分析结果知 , 亮菌多糖的最佳醇沉工艺为 A2B1C2D3 ,
验证实验进一步证明该工艺稳定可行 , 因此筛选的最佳醇沉
工艺为亮菌多糖水提取液减压浓缩至溶液浓度为 1/6g生药 /
ml,醇浓度 80%,醇沉方式流入 , 醇沉 6 h。本实验优选出来
的醇沉工艺为工业化生产提供了实验依据 。
参考文献:
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