全 文 ：菌 物 学 报 23（4）：514~519, 2004
Mycosystema
中国栽培白灵侧耳的 RAPD和 IGS分析
张金霞 黄晨阳 张瑞颖 管桂萍
（中国农业科学院土壤肥料研究所 北京 100081）
摘 要：以 RAPD和 IGS为分子标记，研究了中国栽培白灵侧耳 Pleurotus nebrodensis菌株
的遗传多样性，RAPD结果表明，供试菌株间存在多态性；对供试菌株的 IGS分析表明，
白灵侧耳 P. nebrodensis的 IGS1区域较保守，菌株间没有多态性；IGS2区域进化较快，菌
株间具丰富的多态性。IGS2-RFLP 可应用于白灵侧耳的菌株鉴定鉴别，较 RAPD更稳定，
更具可操作性。
关键词：遗传多样性, 菌株多态性， IGS2-RFLP
中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2004）04-0514-0519

白灵侧耳 Pleurotus nebrodensis 商品名白灵菇或阿魏菇，其分布与新疆阿魏 Ferula
sinkiangensis K. M. Shen 的分布密切相关，广泛分布在新疆的阿尔泰、托里、木垒、塔城等
地有新疆阿魏生长的荒滩，分布海拔高度在 720~1000m（牟川静等, 1987）。虽然宿主只有一
种——新疆阿魏，但是自然野生和分离物栽培出的子实体在形态上却有相当的多样性（张金
霞, 2004）。白灵侧耳最早记载为 Pleurotus ferulae Lanzi（邓叔群, 1963）。后来又有 Pleurotus
eryngii (DC.:Fr.) Quél. var. tuoliensis C. Z. Mou (牟川静等, 1987)、Pleurotus eryngii var.
nebrodensis (Inzenga) Sacc.（黄年来, 1996）和 Pleurotus nebrodensis (Inzenga) Quél. (卯晓岚,
2000)等报道。公认的学名应为 Pleurotus nebrodensis。
多年的真菌分类学和生态学研究表明，白灵侧耳 P. nebrodensis和刺芹侧耳 P. eryngii二
种之间的亲缘关系较近，近年对刺芹侧耳 P. eryngii的遗传多样性研究报道较多（Zervakis et
al., 1994; Lewinsohn et al., 2000; Lewinsohn et al., 2001; Venturella, 2000; Venturella et al.,
2002），但是对白灵侧耳 P. nebrodensis遗传多样性的研究未见报道。
RAPD已经成为生物种内变种和种群差异性研究的通用手段和标记。这一方法在栽培食
用菌菌株遗传分析中的应用不断增加（Zhang & Francis, 1994; 王镭等, 1997; 鲍大鹏等, 2000;
沈天峰等, 2001）。对真核生物 rDNA的研究中，IGS（intergenic spacer）成为分析生物种内多
样性的重要 DNA片段。通常认为 IGS是高变区（Paule & Lofquist, 1996），是检测真菌种群
或个体间遗传关系的有效变异序列（Anderson et al., 1990; Albee et al., 1996; Gryta et al., 1997;
Guidot et al., 1999）, 是真菌属内种间比较和种内变种及其遗传多样性分析的重要分子标记
（Bunyard et al., 1996a, 1996b; Sugita et al., 2001）。 Chillali et al. (1998)研究了欧洲蜜环菌属
Armillariella7个生物学种 rDNA的 ITS（internal transcribed spacer）和 IGS（intergenic spacer），
进行了 IGS-RFLP分析。Bunyard et al.（1996a, b）和 Saito et al.（2002）分别研究了栽培种
双孢蘑菇 Agaricus bisporus (Lange) Singer、香菇 Lentinula edobes (Berk) Pegler 和平菇

引进国际先进农业科学技术（“948”计划 ）项目（2004-Z21）
收原稿日期：2004-05-24，收修改稿日期：2004-07-01
DOI:10.13346/j.mycosystema.2004.04.011
4期 张金霞等：中国栽培白灵侧耳的RAPD和IGS分析 515
Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) Quél的 IGS，结果表明各个栽培种种内不同菌株的 IGS有丰富
的多态性。
我国白灵侧耳 P. nebrodensis 的驯化栽培起始于二十世纪八十年代初期（牟川静等,
1987），当时称为阿魏菇，八十年代后期开始栽培技术的推广（黄年来，1996）。随着我国食
用菌产业的发展，白灵侧耳 P. nebrodensis 成为栽培的热点珍稀新品种，1996 年以来栽培面
积一直呈倍速增长，据中国食用菌协会统计，2003年全国白灵侧耳 P. nebrodensis产量已逾 3
万吨。但是，多年生产栽培使用菌株均来自新疆野生子实体的分离，对其基础研究极为匮乏，
对菌株遗传特性的差别缺乏基本了解，栽培措施不当导致经济损失。本实验的目的在于应用
分子生物学技术，对白灵侧耳 P. nebrodensis栽培菌株进行遗传多样性研究，在 DNA水平上
分析白灵侧耳 P. nebrodensis栽培菌株的种质遗传学差异，同时对白灵侧耳 P. nebrodensis菌
株鉴定鉴别提供快速有效稳定的技术和方法。
1 材料和方法
1.1 供试菌株
供试菌株见表 1。现均保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）。
表 1白灵侧耳 P. nebrodensis供试菌株
Table 1 Tested strains of P. nebrodensis
No. ACCC No. Origin Main agricultural characters
1 51342
北京玉雪阿魏菇技术
开发有限公司，赵炳
子实体掌状。质地紧密，味浓，菌盖纯白色，厚，柄短，侧
生。菌落平展，90天以上出菇。
2 51060
福建省三明市真菌研
究所，郭美英
子实体马蹄形。质地较疏松，味淡，菌盖纯白色，柄长，偏
中生。菌落平展，80天以上出菇。
3 51452
北京金信食用菌有限
公司，何玉宁
子实体掌状。质地中等，味浓，菌盖白色，较厚，柄短，侧
生。菌落平展，90天以上出菇。
4 51453
北京金信食用菌有限
公司，何玉宁
子实体掌状。质地中等，味浓，幼菇淡灰色，成熟菌盖白色，
较薄，柄短，半侧生。菌落平展，70天以上出菇。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取：将菌种活化后接种于 PDA 培养基平板上 25℃隔膜培养 8 天，收集菌丝，
DNA提取采用 Lee & Taylor (1990) 法。
1.2.2 RAPD- PCR：扩增反应体系为 25µL反应液中，dNTPs (2.5mmol/L each) 0.5µL，Primer
(10µmol/L) 0.5µl，Ex TaqTM DNA polymerase 1U，Template 25ng，1×PCR Buffer（TAKARA公
司产品），采用的 12个引物（表 2）。
反应条件为 94℃预变性 5 min，94℃变性 1min，36℃复性 1min，72℃延伸 1.5min，38
个循环，72℃补平 10min。
点样于 1.0%琼脂糖凝胶上，电泳 3h，置凝胶成像系统照相记录结果。
1.2.3 IGS-PCR：扩增体系为 dNTP（2.5mmol/L each）4µL，Primer 各 2.5µL（表 3），Ex Taq TM
DNA polymerase 1.25U，1× PCR buffer，Template 25 ng，用 ddH2O 补齐至 50µL。
IGS1-PCR反应条件为 94℃变性 1min，54℃复性 1min，72℃延伸 3min，共 35个循环，
72℃补平 7min。
516 菌 物 学 报 23卷
IGS2-PCR反应条件为 94℃变性 1min，60℃复性 1min，72℃延伸 3min；共 35个循环，
72℃补平 7min。
2.0％琼脂糖凝胶电泳 2h，置于置凝胶成像系统照相记录结果。
表 2 RAPD-PCR扩增反应的随机引物
Table 2 Primers of RAPD-PCR
No. Sequence（5’－3’） No. Sequence（5’－3’）
K67003 GTGACGCCGC K67004 TACGATGACG
K67005 GTAGACGAGC K67006 ATCTGGCAGC
K67007 CTGGCGGCTG K67008 CGTGGGCAGG
K67009 GCTGGACATC K67010 CTCCTCCCCC
K67011 CGAACGGCGG K67012 TACGTGCCCG
K67013 CCCATGGCCC K67014 GCGGGCAGGA
表 3 IGS1、IGS2引物
Table 3 Primers of IGS1 and IGS2
No. Sequence
IGS1引物：
LR12R 5’-GAA CGC CTC TAA GTC AGA ATC C-3’
5SRNA 5’-ATC AGA CGG GAT GCG GT-3’
IGS2的引物:
InvSR1R 5’-ACT GGC AGA ATC AAC CzAG GTA-3’
5SRNAR 5’-ACC GCA TCC CGT CTG AT-3’
1.2.4 IGS2- RFLP：限制性内切酶应用 BsuR I、Hin6 I、Rsa I、Bsh1236 I（上海生工产品）。
酶切体系中限制性内切酶（10U/µL）1µL，PCR产物 6µL，10×buffer 1µL，用 ddH2O补齐至
10µL。置于 37℃下对 IGS2 扩增产物酶切 4h。2.0％琼脂糖凝胶电泳 2h，置于凝胶成像系统
检测酶切反应结果。
2 结果
2.1 RAPD
12个引物均可以对所有供试菌株基因组 DNA 进行扩增，电泳后形成稳定的图谱，共扩
增出 78条带，其中有差异的 25条，不同菌株间呈现多样性（图 1）。
图 1 K67004对白灵侧耳供试菌株
扩增的 RAPD图谱
CK. 阴性对照; 1~4. 菌株编号
Fig. 1 RAPD profiles amplified by
K67004 for t he t e s t ed s t r a in s o f
P. nebrodensis
1~4. Strain no.; CK. The control;
M. Marker（?DNA/HindⅢ+EcoRⅠ）
bp
4期 张金霞等：中国栽培白灵侧耳的RAPD和IGS分析 517
2.2 IGS-PCR
IGS1 扩增结果表明，各菌株的 IGS1 大小相同，均为
920bp，Genbank登录号 AY463034。
IGS2 扩增结果表明，IGS2 区域较长，而且是个长度多
变异区域，各菌株间 IGS2 的长度不同（图 2），所有掌状菌
株均扩增出一条带，但是大小不同，分别为 7.8kb和 3.5kb。
马蹄状菌株 ACCC51060则两条带，大小也分别为 7.8 kb和
3.5kb。
2.3 IGS2-RFLP
BsuRI、Hin6I、RsaI、Bsh1236I 等 4 个限制性内切酶对
供试菌株的 IGS2 进行酶切，结果显示每个菌株均存在 4 种
酶的酶切位点，电泳后产生不同的带型（图 3）。Bsh1236Ⅰ
酶切后产生 3个条带，BsuRⅠ酶切后产生 11个条带, Hin6
Ⅰ酶切后产生 4个条带，RsaⅠ酶切后产生 7个条带，共计
25条，其中存在多态性的 16条，占 64％。通过 BsuRⅠ或
RsaⅠ酶切后，即可将供试菌株全部清晰地鉴别。
3讨论
虽然 RAPD 是对基因组总 DNA 进行分析，但是在本试验中不同菌株间的差异不及
IGS2-RFLP（图 1、图 3）显著, 这与香菇（Lentinula edodes）的有关报道（Zhang & Francis,
1994；Saito, 2002）相一致。
本试验结果表明白灵侧耳 P. nebrodensis IGS1具较高保守性，不同菌株间大小没有差别，
测序结果也表明没有差异（未发表）。IGS2 区域较长，变异多，是 rDNA 的高变区；白灵侧
耳不同菌株间的 IGS2 区域不但 DNA 大小和数量有差异, 通过限制性内切酶酶切表明 DNA
序列也不同，IGS2是白灵侧耳种内遗传多样性分析和菌株鉴定的有效标记区域，IGS2-RFLP
是白灵侧耳种内遗传多样性和菌株鉴定鉴别的有效分析方法。与 RAPD相比，IGS2-RFLP有
更丰富的多态性，更好的稳定性和可重复性。
由于 IGS存在内部重复，同时经常发生不均等交换，所以某些单位重复数目的变化造成
IGS长度的变异（Austen et al. 1998; Martin 1999; Saito et al.2002）。在本试验中也发现在 IGS2
图 2 白灵侧耳供试菌株
IGS2扩增结果
1~4. 菌株编号
Fig. 2 IGS2 profiles of the tested
strains of P. nebrodensis
1~4. Strain No.; M. Marker
（?DNA/HindⅢ+EcoRⅠ）
图 3 白灵侧耳不同菌株 IGS2-RFLP电泳图谱
1~4. 菌株编号; A. Bsh1236I; B.BsuRI; C. Hin6I; D. RsaI
Fig. 3 IGS2-RFLP profiles of the tested strains
A. Bsh1236I; B. BsuRI; C. Hin6I; D. RsaI; 1~4；strain No; M stands for marker（?DNA/HindⅢ+EcoRⅠ）
518 菌 物 学 报 23卷
存在数量异质性，但是在白灵侧耳 P. nebrodensis IGS2中存在的亚重复序列和数量以及缺失
的重复数量，还有待于进一步研究。
本实验室收集了北京、河南、山西、福建等省栽培的 20个白灵侧耳 P. nebrodensis栽培
菌株，根据拮抗反应和农艺性状分为 4组，本项研究中 RAPD和 IGS2-RFLP的分析结果和拮
抗反应结果相吻合。对组内菌株进行了 RAPD和 IGS分析，结果表明各组内菌株间无差异，
实验结果表明，生产上大量栽培使用的掌状菌株，绝大多数与供试菌株 ACCC51342 相同，
ACCC51060是唯一栽培的马蹄状菌株（未发表）。
致 谢 感谢郭美英女士、何玉宁女士、赵炳先生赠送菌种，感谢卯晓岚先生鉴定标本。
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RAPD AND IGS ANALYSIS OF PLEUROTUS NEBRODENSIS CULTIVARS
IN CHINA
ZHANG Jin-Xia HUANG Chen-Yang ZHANG Rui-Ying GUAN Gui-Ping
(Institute of Soil and Fertilizers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)
ABSTRACT: The genetic diversity of Pleurotus nebrodensis was studied by RAPD and IGS
analysis. The RAPD profiles shows a polymorphism among the tested cultivars. IGS1 region keeps
conservative and steady, and is no appearance in the diversity. IGS2 region displays an abundant
diversity with more evolution. It is recognized that IGS2-RFLP can be used in identification and
discrimination of strains in P. nebrodensis. The results of IGS2-RFLP are more steady, more
handle and more differentiation than those of RAPD analysis.
KEYWORDS: Genetic diversity, polymorphism among cultivars, IGS2-RFLP