全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2016)03 － 0498 － 05 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2016． 03． 006
收稿日期:2015 － 04 － 02
基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(31400257，
31400333) ;四川省“十二五”重点公关资助项目(2011YZGG-
10) ;四川省应用基础研究基金资助项目(2013JY0182) ;四川省
生物质资源利用与改性工程技术研究中心基金资助(12zxsk07，
13zxsk01)
作者简介:廖 倩(1991 －) ，女，四川成都人，在读硕士，从事植
物遗传与品种改良研究。E-mail:liaoqianmxcz@ 163． com，Tel:
18084887253，* 为通讯作者。
梁山慈竹 UGP基因克隆与生物信息学分析
廖 倩1，2，黄 艳1，2，胡尚连1，2* ，曹 颖1，2，卢学琴1，2，徐 刚1，2
(1．西南科技大学 植物细胞工程实验室，四川 绵阳 621010;2．四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川 绵阳 621010)
摘 要:以梁山慈竹笋为材料，采用 ＲT-PCＲ方法克隆梁山慈竹 UGP 基因，对梁山慈竹 UGP 基因的编码区、氨基酸序列及蛋白质
的结构和功能进行生物信息学分析。获得 1 个梁山慈竹 UGP基因，命名为 DfUGP(Genebank:KJ525752)。测序结果显示该序列全
长 1561 bp，包含一个完整的 OＲF框，长度为 1422 bp，编码473 个氨基酸。梁山慈竹 UGP基因与巨龙竹、绿竹、水稻、大麦、玉米、甘
蔗的具有高度的同源相似性，编码的蛋白结构较为相似，均含有 N 端区域、中心区域和 C 端区域，且蛋白三级结构中都具有 NB-
loop环和 l-loop环。DfUGP具有 N端的 UDPGP功能域，其位于第 90 ～ 379 氨基酸，证明 DfUGP属于尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶
基因家族。
关键词:梁山慈竹;UGP;克隆;生物信息学
中图分类号:S795． 504 文献标识码:A
Cloning and Bioinformatics Analysis of DfUGP Gene in Dendrocalamus farinosus
LIAO Qian1，2，HUANG Yan1，2，HU Shang-lian1，2* ，CAO Ying1，2，LU Xue-qin1，2，XU Gang1，2
(1． Lab of Plant Cell Engineering，Southwest University of Science and Technology，Sichuan Mianyang 621010，China;2． Engineering Ｒe-
search Center for Biomass Ｒesource Utilization and Modification of Sichuan Province，Sichuan Mianyang 621010，China)
Abstract:Taken Dendrocalamus farinosus as tested materials，the young shoots of Dendrocalamus farinosus was used to clone the UGP gene
by using ＲT-PCＲ，and the encoding region and amino acid sequence of UGP gene and the structure and function of protein encoded with
UGP gene were analyzed by NCBI，ExPASy． The result showed that the UGP gene was cloned in Dendrocalamus farinosus，which was named
DfUGP (GenBank:KJ525752)． Its full-length of nucleotide sequence was 1561 bp，containing a complete open reading frame with 1422
bp，which encoded 473 amino acids． Phylogenetic analysis showed that the UGP gene from Dendrocalamus farinosus was highly homologous
to the Dendrocalamus sinicus，Bambusa oldhamii，Oryza sativa，Hordeum vulgare，Zea mays and Saccharum officinarum，and the NB-loop
rings and l-loop rings were found in the tertiary structure of UGP． DfUGP had the N-terminal domain，located at 90-379 amino acids，
which indicated that DfUGP gene belonged to uridine diphosphate glucose phosphorylase gene families．
Key words:Dendrocalamus farinosus;UGP gene;Cloning;Bioinformatics
梁山慈竹纤维质量好、含量丰富，在四川已经形
成了以其为龙头的竹浆造纸工业产业链［1］，然而在
造纸过程中原料中纤维素和木质素的含量将直接影
响制浆率和纸的质量［2］。以往研究发现，纤维素的
生物合成需要多种酶协同参与［3］，而 UGPase 可能
起着重要作用。UGPase 又称尿苷二磷酸葡萄糖焦
磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase) ，
在植物体中广泛存在，能催化可逆反应:Glc-1-P +
UTP←→UDPG + Ppi［4］，是糖代谢的关键酶。在植
物生长发育过程中 UDPG 可作葡萄糖基供体，以底
物形式参与纤维素和半纤维素的合成。研究证实，
过量表达 UGP基因，纤维素的积累急剧增多，同时
细胞壁增厚且植株生长速度较快［5］。连玲［6］利用
ＲNAi技术，沉默水稻花粉中的 UGP 基因，发现在花
粉母细胞减数分裂时，突变体株的花粉母细胞附近
只有少量胼胝质积累，而对照株的花粉母细胞附近
胼胝质含量显著增加，表明 UGP基因在花粉壁的形
成中有重要作用。尽管 UGP 基因相继在部分植物
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西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2016 年 29 卷 3 期
Vol. 29 No. 3
中克隆［7 － 10］，但而在梁山慈竹中关于 UGP的结构特
征、进化关系以及表达模式等研究鲜见报道。鉴于
此，本文通过同源克隆获得了梁山慈竹 UGP基因全
长 CDNA序列，并对其进行生物信息学分析，为其应用
于梁山慈竹遗传改良提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
以四川省绵阳市西南科技大学资源圃的梁山慈
竹笋为材料，置于 － 80 ℃冷冻保存。Plant ＲNA Kit
试剂盒、LA-Taq 聚合酶、PrimeScript  ＲT reagent
Kit (Perfect DNA)反转录试剂盒、质粒小提取试剂
盒、胶回收试剂盒、大肠杆菌 DH5α、Pmd19-T Vec-
tor、IPTG、EcoＲ I、Hind III、Sal I、Pgm-T Vector、X-
Gal、Green View 染料、DL2000 DBE Marker、细菌培
养用胰蛋白胨、酵母提取物和琼脂糖等。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 总 ＲNA 的提取与第一条 Cdna 链的合成
以 － 80 ℃保存的梁山慈竹笋为材料，提取 ＲNA，并
使用反转录试剂盒合成梁山慈竹 Cdna，－ 20 ℃保
存备用。
1． 2． 2 梁山慈竹 UGP基因的编码区序列的获得
参照 NCBI中提供的绿竹 UGP基因全长片段(NCBI
序列号:AY178448) ，利用 Primer Premier 5． 0 软件
设计慈竹的 UGP 基因全长引物(F:5’CCATC-
CTTTCGAAGCCTCTC3’;Ｒ:5’GGAATGCACACGA
AAATTACAA3’) ，采用 LA-Tag 酶(TaKaＲa)进行目
的基因扩增。将 PCＲ回收产物连接 Pmd19-T载体，
测序分析。
1． 2． 3 生物信息学分析 根据克隆的梁山慈竹
UGP基因序列，于 NCBI 中选择相关 UGP 基因，利
用 MEGA5． 0 软件构建 UGP 基因的系统发育树;利
用 ExPaSy 中的 Prot-Param 软件和 SOPMA 软件，对
UGP基因编码蛋白的理化性质与二级结构进行预测分
析;利用MeMe在线软件对 UGP基因进行高保守区域
分析;利用 ExPaSy 中的 CPHmodels 程序，在线对梁山
慈竹、巨龙竹、绿竹、水稻、大麦进行利用同源模建，再
利用 ＲasMol 预测软件进行蛋白三维结构分析。
2 结果与分析
2． 1 梁山慈竹 UGP基因全长序列的获得
梁山慈竹 UGP 基因经克隆测序，其核酸序列、
编码的氨基酸及功能结构域如图 1 所示。结果显
示，该序列长为 1561 bp，OＲF 框长度为 1422 bp，编
码 473 个氨基酸，将其命名为 DfUGP，GenBank 注册
号为 KJ525752。
该序列的 Blast N比对结果表明，梁山慈竹和绿
竹、巨龙竹、水稻等物种的 UGP核酸序列高度相似，
其中 DfUGP与巨龙竹 DsUGP 相似性达 98 %，确定
克隆得到的序列为梁山慈竹 UGP 基因的 cDNA 序
列。对 DfUGP 的蛋白功能域进行预测分析可知，
DfUGP具有 N端的 UDPGP 功能域，其位于第 90 ～
379 氨基酸，证明 DfUGP 保守区基因编码的蛋白质
属于尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶家族。
图 1 梁山慈竹 UGP基因克隆(A)、全长序列(B)和编码蛋白质功能结构域(C)
Fig． 1 Cloning (A)and full-length sequences (B)of UGP gene and conserved function domain of amino acid sequence from UGP(C)
9943 期 廖 倩等:梁山慈竹 UGP基因克隆与生物信息学分析
图 2 UGP基因系统发育树与高保守区域对比分析
Fig． 2 Phylogenetic tree of UGP gene from different plant species and comparative analysis of highly conserved region
2． 2 UGP 基因系统发育树的构建、高保守区域和
氨基酸序列对比分析
从 NCBI中选择植物 UGP基因编码的氨基酸序
列，利用 Mega5． 0 软件构建其系统发育树(图 2)。
从图可以看出梁山慈竹与巨龙竹、绿竹、水稻、大麦、
玉米、甘蔗聚为一族，说明梁山慈竹与其亲缘关系较
近。利用在线软件 http:/ /meme． nbcr． net /meme /
tools /meme 对 UGP 基因高保守区域进行分析(图
2) ，DfUGP 与 DsUGP、BoUGP1、HvUGP 的高保守区
域一致，而与其他植物的 UGP 基因在首端 1 ～ 8 bp
有差异。
利用 DNAMAN软件和在线程序 ClustalW2 对慈
竹、梁山慈竹、绿竹和水稻 UGP 基因的序列及其编
码的氨基酸进行多序列比对分析(图 3)。DfUGP 与
DsUGP 、BoUGP1、BoUGP2 和 OsUGP1 的氨基酸相似
性都极高，各为 99． 37 %、98． 31 %、97． 04 %和 95．
35 %。DfUGP编码氨基酸中含有保守的 Lys 残基:
Lys260、Lys326、Lys364、Lys405 和 Lys406。
2． 3 DfUGP基因编码蛋白的理化性质与结构预测
分析
梁山慈竹、巨龙竹、绿竹、水稻、大麦 UGP 基因
编码蛋白的理化性质与二级结构表现出相同的规律
“* ”表示氨基酸一致;“:”表示氨基酸强相似;“．”表示弱相似;“-”表示氨基酸缺失;“▲”表示 Lys残基
图 3 氨基酸序列对比
Fig． 3 Amino acid sequence alignment of UGP gene
005 西 南 农 业 学 报 29 卷
表 1 DfUGP基因编码蛋白的理化性质与结构分析
Table 1 Physiological characteristics and secondary structure analysis of protein encoded by UGP gene
基因名称
Gene names
氨基酸个数
Coded
amino acids
分子量
Molecular
weight
酸性残基
Acidic
amino acids
碱性残基
Alkaline
amino acids
理论等电点
Theoretical
pI
总亲水性
平均系
Grand average
of hydropathicity
无规卷曲
Ｒandom coil
α-螺旋
Alpha helix
延伸链
Extended
strand
β-转角
Beta turn
DfUGP 473 51． 84 62 51 5． 28 － 0． 141 159 141 119 54
DsUGP 473 51． 83 62 52 5． 34 － 0． 135 169 170 94 40
BoUGP1 473 51． 99 62 52 5． 35 － 0． 149 154 157 112 50
OsUGP1 469 51． 65 61 52 5． 43 － 0． 158 148 153 116 52
HvUGP 473 51． 64 62 50 5． 20 － 0． 078 158 154 112 49
(表 1)。DfUGP 基因分子量为 51． 84 Kd，编码 473
个氨基酸，其中碱性氨基酸数目少于酸性氨基酸，预
测其属碱性蛋白。DfUGP 基因的总亲水性平均系
数为 － 0． 141，推测其为亲水性蛋白。DfUGP 基因
编码的蛋白序列的二级结构含有丰富的无规卷曲和
α-螺旋，其次为延伸链，β-转角含量最少。
选取与梁山慈竹进化关系较近的巨龙竹、绿竹、
水稻、大麦 UGP基因编码的蛋白进行三级结构分析
(图 4)。梁山慈竹与巨龙竹、绿竹、水稻和大麦的
UGP基因编码的蛋白结构较为相似，均含有 N 端区
域、中心区域和 C 端区域，且都有 UGP 蛋白三级结
构所特有的 NB-loop环和 l-loop环。
3 讨论与结论
大型丛生竹遗传改良过程中，基因工程的发展
为其提供了可行途径，采用基因工程手段提高纤维
素含量已成为当前一个活跃的研究领域。DfUGP
基因序列长为 1561 bp，OＲF框长度为 1422 bp，编码
473 个氨基酸，具有 N 端的 UDPGP 功能域，其位于
第 90 ～ 379 氨基酸(图 1) ，DfUGP 保守区基因编码
的蛋白质属于尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶家族，
与绿竹、巨龙竹、水稻等物种的 UGP 核酸序列高度
相似。梁山慈竹与巨龙竹、绿竹、水稻、大麦、玉米、
甘蔗聚为一族，说明梁山慈竹与其亲缘关系较近
(图 2)。目前，关于巨龙竹与绿竹 UGP 基因功能的
研究尚未见报道，但关于 OSUGP1 的研究表明，其在
花粉发育、种子碳水化合物的代谢和水稻生长发育
中起着至关重要的作用［10］，OsUGP1 的抑制会导致
水稻分蘖少、开花时间迟、植株矮小和生长延迟。由
此推测，DfUGP 可能对梁山慈竹生长发育有影响。
拟南芥和大麦 UGPase的三级结构可分为 3 个主要
区域，即 N 端区域、中心催化区域和 C 端区域。其
中，中心区域包含有一个核苷结合环(NB-loop) ，C
端区域包含一个插入环(I-loop)［5］。在本研究中，
图 4 UGP基因编码蛋白的三级结构预测
Fig． 4 Model of tertiary structure of protein coded by UGP gene
1053 期 廖 倩等:梁山慈竹 UGP基因克隆与生物信息学分析
梁山慈竹 UGP编码蛋白的三级结构中含有 NB-loop
和 I-loop (图 4)。中心区域是所有 UGPase 高度保
守的一个区域，同时也是 UGPase 的活性区域，其中
包括有底物结合位点和催化中心。Katsube［12］和
Kazuta［13］等定向突变了马铃薯 UGPase 的 5 个 Lys
残基 位 点 (Lys263、Lys329、Lys367、Lys409 和
Lys410) ，结果分析表明，Lys263 和 Lys329 参与 Mg-
PPi或葡萄糖-1-P的结合和 UDPG 诱导的酶的构象
变化，Lys367 对维持 UGPase 的催化活性是必须的，
但 Lys409 和 Lys410 则与催化无关。本研究中得到
DfUGP编码氨基酸中含有保守 Lys 残基:Lys260、
Lys326、Lys364、Lys405 和 Lys406，对维持 UGPase活
性及底物结合方面的作用有待进一步研究。梁海
泳［14］、刘文哲［15］从紫穗槐中克隆出 UGP 基因并对
烟草进行遗传转化，研究结果表明，转基因株生长速
度快于对照株，且茎秆中纤维素的积累量也高于对
照株。Coleman［5］在烟草中过表达棉花与木醋酸菌
的 UGP基因，发现转基因株中 UGP 的转录水平和
活性均高于对照株，且转基因株的高度、可溶性糖类
的积累及总生物量均有所增加。
据以上研究结果可推测，DfUGP 在梁山慈竹中
可能在促进竹纤维生长发育方面可能有着重要作
用，有待进一步深入研究。
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(责任编辑 陈 虹)
205 西 南 农 业 学 报 29 卷