全 文 ：食用菌学报２０１３．２０（２）：１２～１９
收稿日期：２０１３－０１－１０原稿；２０１３－０５－１２修改稿
基金项目：云南省农业科学院院专项（编号：ＹＡＡＳ２０１３ＪＣ００５）、国家食用菌产业技术体系（编号：ＣＡＲＳ２４）项目的部
分研究内容
作者简介：陈立佼（１９８７－），女，在读博士，主要从事大型真菌发育学研究。
＊本文通讯作者　Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａａｓｍｕｓｈｒｏｏｍ＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ．ｃｎ
文章编号：１００５－９８７３（２０１３）０２－００１２－０８
尖顶羊肚菌遗传多样性的ＡＦＬＰ分析
陈立佼１，２，柴红梅２，黄兴奇２，赵永昌２＊
（１云南大学生命科学学院，云南昆明６５００９１；２云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南昆明６５０２２３）
摘　要：以是否产菌核及产菌斑为标准将尖顶羊肚菌子实体ＺＤ－１８分离的４９个单孢菌株分为四组，并以１个
组织分离菌株为对照，采用 ＡＦＬＰ技术进行 ＤＮＡ多态性分析。用筛选出的４对引物进行扩增，在１００ｂｐ－
６００ｂｐ有效带范围内的４８８条带都具有多态性，通过Ｎｅｉ’ｓ无偏遗传相似度及遗传距离（１９７８）的 ＵＰＧＭＡ 聚
类分析，可将５０个菌株分为１１个组群，且与四个形态分组的多态性指数很一致，但形态和遗传仅在产菌斑性
状上具有对应趋势，产菌核性状的遗传聚类说明其基因表达复杂多变，可利用研究得出的多态性遗传图谱进
行较深入的分子研究。
关键词：尖顶羊肚菌；遗传多样性；ＡＦＬＰ分析
　　扩增片段长度多态性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ
ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）标记技术是建立
在ＰＣＲ技术和 ＲＦＬＰ标记技术基础上的，是通
过限制性内切酶片段的不同长度检测ＤＮＡ多态
性的一种 ＤＮＡ指纹分析技术［１，２］，具有模板量
少，引物通用性高，检测效率、多态性高及可靠性
高的优点，在植物分子遗传连锁图谱构建、亲缘
关系和遗传多样性研究、种质资源鉴定、分子标
记辅助选择育种、基因表达和基因克隆等研究领
域有着其他分子标记技术不可比拟的优势［３］。
在食用菌研究领域，ＡＦＬＰ分子标记技术主要应
用于遗传多样性及亲缘关系分析、遗传图谱构建
和种质资源鉴定等［４］，在利用ＡＦＬＰ分子标记技
术对香菇［５，６］、糙皮侧耳［７］、双孢蘑菇［８］、灵芝［９］、
松茸［１０］和毛木耳［１１］的遗传分析中都得到了很好
的结果。
尖顶羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ　ｃｏｎｉｃａ）在羊肚菌属
中因菌盖长且呈近圆锥状、顶端尖而得名，是
我国野生食用菌的主要出口产品之一［１２］。由
于野生资源限制，近年来半人工栽培数量逐渐
增加。尖顶羊肚菌在培养过程中菌丝和子实
体形态变化较大，这种现象是否起因于多核体
的争论较多。尖顶羊肚菌子实体成熟子囊中
排列八个子囊孢子，由减数分裂后细胞生长而
来，能反映母本的遗传背景；各单孢菌株形态
差异很大，尤其在菌丝颜色及是否产生菌核等
特性上［１３］。栽培实践中菌丝体的颜色及菌核
产生情况与羊肚菌子实体形成紧密相关，而且
尖顶羊肚菌的半人工栽培需要在纯菌种的基
础上辅以一定量的孢子液，可知不同的遗传类
型在出菇过程的重要性，探讨其原因可能会对
人工栽培羊肚菌提供帮助。笔者之前通过单
孢分离获得不同形态的４９个单孢菌株，利用
ＡＦＬＰ技术探索这些单孢菌株和一个组织分离
菌株的遗传多样性，尝试寻找与每一类形态学
特征相关的分子标记，期望为深入的研究羊肚
菌培养和栽培提供依据。
１　材料与方法
１．１材料
　　以本实验室之前分离的香格里拉大田栽培
尖顶羊肚菌（Ｍ．ｃｏｎｉｃａ）子实体 ＹＡＡＳＭ０５８２－
ＺＤ－１８单孢菌株为基础［１３］，选出４９个单孢菌株
及一个子实体组织分离菌株为研究材料，见表１。
１．２仪器和试剂
　　美国Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　ＣＥＱ８０００毛细管电
泳系统及遗传分析系统，美国 ＭＪ公司ＰＴＣ－２００
ＰＣＲ扩增仪ＰＣＲ仪，德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司５４１Ｒ
DOI:10.16488/j.cnki.1005-9873.2013.02.010
第２期 陈立佼，等：尖顶羊肚菌遗传多样性的ＡＦＬＰ分析
离心机，美国Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司ＡＣＡＤＥＭＩＣ－Ｑ超纯
水仪，美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司ＤＵ６４０核酸蛋白分析
仪等。
十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、三羟甲基
氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、β－巯基乙醇、乙二胺四乙酸二钠
（ＥＤＴＡ）、ＲＮａｓｅ　Ａ、异丙醇、乙醇、氯仿、异戊醇、
乙 酸 钾，ＥｃｏＲＩ 酶、ＭｓｅＩ 酶、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ
ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ、Ｔ４连接酶（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司）、
Ｔａｑ酶（ＴａＫａＲａ公司）；ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ人工接头、
ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ　Ｐｒｉｍｅｒ预扩增引物；选择性扩增引
物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）：ＭｓｅＩ－ＸＸＸ （Ｘ 为选择性
碱基），ＥｃｏＲＩ－ＸＸＸ（此引物５端为Ｄ４ＰＡ荧光
标 记 ）；ＧｅｎｅＦｉｎｄｅｒ 核 酸 染 料，超 纯 水
（１８．２　ＭΩ·ｃｍ）。
表１　供试菌株
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｅｓｔ　ｉｓｏｌａｔｅｓ
组别
Ｇｒｏｕｐ
菌株号
Ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ
菌丝特征
Ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｎ　ＰＤＡ　ｍｅｄｉｕｍ
ＳＳ＊ Ａ３，Ａ１２，Ａ１４，Ａ２０，Ａ２１，Ａ３０，Ａ３６，Ａ３８ ＋●
ＮＳ＊
Ａ１，Ａ１０，Ａ１７，Ａ２３，Ａ２５，Ａ２９，Ａ３３，Ａ３７，Ａ４０，Ａ４２，
Ａ４３，Ａ４５，Ａ４７，Ａ４９，Ａ４８
－●
ＳＮ＊
Ａ２，Ａ５，Ａ６，Ａ７，Ａ８，Ａ１３，Ａ１５，Ａ１６，Ａ２４，Ａ２６，
Ａ２８，Ａ３１，Ａ３５，Ａ３２，Ａ３９，Ａ４１，Ａ４７
＋○
ＮＮ＊ Ａ４，Ａ９，Ａ１１，Ａ１８，Ａ１９，Ａ２２，Ａ２７，Ａ３４，Ａ４４，Ａ４６ －○
ＭＢ＊＊ Ａ５０ ＋○
＊单孢分离菌株；＊＊组织分离菌株；＋产菌核；－不产菌核；●菌落形成不均匀的菌丝色斑；○菌落颜色均匀
（＊）Ｓｉｎｇｌｅ　ａｓｃｏｓｐｏｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅ；（＊＊）ｆｒｕｉｔ　ｂｏｄｙ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｓｏｌａｔｅ；（＋）ｆｏｒｍ　ｓｃｌｅｒｏｔｉａ；（－）ｄｏｅｓ　ｎｏｔ　ｆｏｒｍ　ｓｃｌｅｒｏｔｉａ；●ｎｏｎ－ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ
ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｃｏｌｏｎｙ　ｗｉｔｈ　ｄａｐｐｌｅｄ　ａｒｅａｓ；○ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ，ｕｎｉｆｏｒｍｌｙ－ｃｏｌｏｒｅｄ　ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｃｏｌｏｎｙ
１．３ＤＮＡ提取
　　供试菌株分别培养后用改良的 ＣＴＡＢ法
提取总ＤＮＡ［１４］，核酸蛋白分析仪测定２６０ｎｍ
和２８０ｎｍ 下的光密度值，以确定其纯度和
浓度。
１．４ＡＦＬＰ－ＰＣＲ扩增
　　提取得到 ＤＮＡ 用 ＥｃｏＲＩ　３７ ℃酶切２ｈ，
６５℃灭活酶２０ｍｉｎ，２０μＬ酶切体系包含ＥｃｏＲ１
１μＬ（１０　Ｕ／μＬ）、１０×Ｂｕｆｆｅｒ　２μＬ、ＤＮＡ３μＬ、
ｄｄＨ２Ｏ１４μＬ；ＭｓｅＩ　６５℃酶切２　ｈ，８０℃灭活酶
３０　ｍｉｎ，２０μＬ 酶切体系包含 ＭｓｅＩ　０．２μＬ
（１０　Ｕ／μＬ）、１０×Ｂｕｆｆｅｒ　２μＬ、ＥｃｏＲＩ酶切产物
１５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ２．８μＬ。Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　２２℃连
接２　ｈ，６５℃１０　ｍｉｎ终止反应，２０μＬ连接体系
包含Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　０．４μＬ （５　Ｕ／μＬ）、１０×
Ｂｕｆｆｅｒ　２μＬ、酶切产物 １０μＬ、ＥｃｏＲ１／ＭｓｅＩ
Ａｄａｐｔｏｒ　２μＬ、ｄｄＨ２Ｏ５．６μＬ；连接产物加入
ＥｃｏＲⅠ和 ＭｓｅⅠ引物进行预扩增，２０μＬ扩增
体系包括ＡＦＬＰ　Ｃｏｒｅｍｉｘ１５μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ　ＥｃｏＲ１／
ＭｓｅＩＰｒｉｍｅｒ（３５　ｎｇ／μＬ）１μＬ，连接产物４μＬ，预
扩增程序为：９４℃预变性２　ｍｉｎ；９４℃变性２０　ｓ，
５６℃复性３０　ｓ，７２℃延伸２　ｍｉｎ，２０个循环；
６０℃延伸３０　ｍｉｎ。２１μＬ选择性扩增体系包括
Ｅ＋２和 Ｍ＋２引物各１μＬ、预扩增产物稀释２０
倍４μＬ，ＡＦＬＰ　Ｃｏｒｅ　Ｍｉｘ　１５μＬ。扩增反应程序
为９４℃预热２　ｍｉｎ；９４℃２０　ｓ、６６℃３０　ｓ、７２℃
２　ｍｉｎ，退火温度每循环一次降低１℃，１０个循
环；９４℃２０　ｓ、５６℃３０　ｓ、７２℃２　ｍｉｎ，１５个循
环；６０℃延伸３０　ｍｉｎ。１００个反应 ＡＦＬＰ　Ｃｏｒｅ
Ｍｉｘ（Ｈ２Ｏ　１２４０μＬ、ｄＮＴＰ （１０　ｍＭ）４０μＬ、
Ｔａｑ２０μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ　２００μＬ）
１．５ＡＦＬＰ－毛细管电泳检测
　　选择性扩增样本的检测在贝克曼库尔特
（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）公司ＣＡＥＱ８０００遗传分析系
统上完成，上机体系：选扩产物稀释２０倍上样
３μＬ，甲酰胺２０μＬ，内标０．２μＬ。该系统采用
荧光标记和毛细管电泳分离技术，扩增产物经高
分辨率毛细管中电泳分离，激光激发荧光采集并
数据，电泳结果通过软件自动统计分析并转化为
“０、１”原始矩阵数据，同时导出电泳分离指纹
图谱。
１．６数据处理与分析
　　ＣＥＱ８０００遗传分析仪统计得到的原始数据
０，１矩阵，用 ＮＴＳＹＳｐｃ２．１软件［１５］对各菌株进
行 基 于 简 单 匹 配 系 数 （ｓｉｍｐｌｅ　ｍａｔｃｈｉｎｇ
ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ＳＭ系数）的非加权算术平均聚类分
析 （Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ　ｐａｉｒ　ｇｒｏｕｐ　ｗｉｔｈ　ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ
ａｖｅｒａｇｅ，ＵＰＧＭＡ）；用ＰＯＰＧＥＮＥ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．３２
３１
食　用　菌　学　报 第２０卷
软件［１６］进行遗传多样性分析：各菌株遗传多样性
以常规的多态位点百分率 Ｐ （Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｌｏｃｉ）、平 均 有 效 等 位 基 因 数
（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ａｌｅｌｅｓ，ｎｅ）、Ｓｈａｎｎｏｎ表型
多样性信息指数 （Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘ，
Ｉ）、Ｎｅｉｓ基因多样性指数（期望杂合度，Ｈ）和单
孢 间 基 因 分 化 系 数 （Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　ｇｅｎｅ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ＧＳＴ）为测定指标。应用 Ｎｅｉ’ｓ
（１９７８）基因多度法计算ＧＳＴ，其关系式为ＧＳＴ ＝
ＤＳＴ／ＨＴ，其中 ＨＴ ＝ Ｈｓ＋ ＤＳＴ，ＨＴ为总遗传
多样性，Ｈｓ为群体内的遗传多样性，ＤＳＴ为群体
间遗传多样性；按照 Ｗｒｉｇｈｔ（１９５１）的方法计算
反映基因流强度的基因每代迁移数（Ｎｍ），其关
系式为：ＦＳＴ＝１／（１＋４　Ｎｍ），Ｎｍ ＝ （１–ＦＳＴ）／
４　ＦＳＴ，在此，ＦＳＴ值等同于ＤＳＴ［１７］。
２　结果与分析
２．１引物筛选及其多样性检出效率
　　利用两个表型差异很大的单孢菌株 Ａ３和
Ａ９，对８８对引物组合进行筛选，选出４对扩增多
态性好、带型整齐清晰的引物（表２）。四对引物
多态性位点检出率都为１００％，扩增范围为４２～
７２０ｂｐ，在１００～６００ｂｐ间的带为有效带，共扩增
出４８８条带，全部具有多态性，多态性比率为
１００％，表明尖顶羊肚菌单孢之间具有很高的多
样性，符合人们对羊肚菌具多变特性的认识，同
时也表明ＡＦＬＰ技术在检测尖顶羊肚菌单孢多
样性方面有着较高的效率。
表２　选择性扩增引物筛选结果
Ｔａｂｌｅ　２　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
扩增位点
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ
Ｅ－ＡＡＣ／Ｍ
５’－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡＣ－３’
５’－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　Ｃ－３’
１３１
Ｅ－ＡＣＡ／Ｍ
５’－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＡ－３’
５’－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　Ｃ－３’
１０７
Ｅ－ＡＧＧ／Ｍ
５’－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧＧ－３’
５’－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　Ｃ－３’
１２５
Ｅ－ＡＣＣ／Ｍ
５’－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＣ－３’
５’－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　Ｃ－３’
１２５
总计Ｔｏｔａｌ　４８８
２．２菌株聚类分析
２．２．１碱基分辨值的确定
　　各菌株在扩增产物以ＣＥＱ８０００遗传分析系
统比较分析得出各对引物扩出的特征带，并选出
各引物最好的碱基分辨值及最终聚类分析“０，１”
矩阵数据的碱基分辨值，如表３：
表３　四对选择性扩增引物碱基分辨值及特征带
Ｔａｂｌｅ　３　Ｏｐｔｉｍｕｍ　ｂａｓｅ－ｐａｉｒ　ｓｅｔｔｉｎｇ　ｆｏｒ　ｂａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
ａｎｄ　ｓｉｚｅｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｂａｎｄｓ
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
最适碱基分辨值
Ｏｐｔｉｍｕｍ　ｂｐ　ｓｅｔｔｉｎｇ
ｆｏｒ　ｂａｎｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（ｂｐ）
总群体特征带大小
Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ
／ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
ｂａｎｄ　ｓｉｚｅ（ｂｐ）
产菌核群体
特征带大小
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
ｂａｎｄ　ｓｉｚｅ（ｂｐ）
产菌丝斑群体特
征带大小
Ｄａｐｐｌｅｄ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｂａｎｄ　ｓｉｚｅ（ｂｐ）
Ｅ－ＡＡＣ／Ｍ　 ４　 ２２９．９，４４１．７，４１４．３　 ２０８．７ －
Ｅ－ＡＣＡ／Ｍ　 ２
１６５．３，１６７．４，３０５．３，３６１．８，
３６３．７，３８４．３
１０５．２，１９５．５，
２３１．８，３８０．８
３０２．３，４２９．９，
６１１．８
Ｅ－ＡＧＧ／Ｍ　 ３
１９０．４，２２１．１，２２４．９，３３１．９，
３５４．０，３８２．２
１５９．５，２６０．５，
３８４．４，
１６２．２，２９３．５，
３２２．８
Ｅ－ＡＣＣ／Ｍ　 ４
９２．１，２２０．９，２７６．２，３３４．０，
３３７．２，３８９．７，３９３．５
１１２．５　 １１５．２，１９８．５
４１
第２期 陈立佼，等：尖顶羊肚菌遗传多样性的ＡＦＬＰ分析
　　在选择中发现随着碱基分辨值的增大，各引
物得总群体特征带大小范围增大，特异性降低，产
菌核群体及产菌丝斑群体的特征带无法从总特征
带范围内筛选出来，使聚类分析准确性下降。根据
表３，将２、３、４ｂｐ碱基分辨值下进行预聚类，根据
最接近表型分类的原则筛选到以３ｂｐ碱基分辨值
下所得矩阵数据较符合表型分类。
２．２．２聚类分析
　　将３ｂｐ碱基分辨率的各四对引物合并，用
ＮＴＳＹＳｐｃ２．１软件进行基于ＳＭ系数的ＵＰＧＭＡ
聚类分析，结果见图１。分析的各个体间的遗传
相似系数范围在０．５６至０．８８之间，符合这些菌
株来自同一子实体这一统一的遗传背景。相似
系数最大为Ａ２０和 Ａ２１之间的０．８７４７，符合形
态分类；相似系数最小为 Ａ０１和 Ａ２１之间的
０．５６１６，它们分别为不产菌核和产菌核菌株，说
明与是否产菌核性状相关的基因结构复杂且效
应显著。Ａ４２与 Ａ２１之间遗传距离最大，为
０．６２８６，Ａ１５ 与 Ａ１２ 之 间 遗 传 距 离 最 小，为
０．１１１０。
按图１菌株间相似性分组如表４，大部分菌
株有按照产菌核及产斑特性分组的趋势，Ｄ１中
除Ａ４３外都不产菌斑，且 Ａ４４，Ａ３４，Ａ４１不产菌
核；Ｅ１中除 Ａ１４、Ａ４９外都不产斑，且除 Ａ４，Ａ９
外都产菌核；余下各组产菌斑菌株居多。以此可
推想：产菌斑及不产菌斑菌株遗传相似性较小，
大约为０．７３，影响该性状的基因遗传距离较远，
产菌核及不产菌核菌株在不同遗传距离上都能
被分辨，说明控制其性状的基因较复杂，可能是
由复合基因控制。此外，菌丝颜色和菌核产生的
分子分类不同步，说明与它们的相关的控制基因
不连锁。
图１　ＵＰＧＭＡ聚类分析
Ｆｉｇ．１　ＵＰＧＭＡ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ
５１
食　用　菌　学　报 第２０卷
表４　基于聚类分析的菌株分组
Ｔａｂｌｅ　４　Ｇｒｏｕｐｉｎｇ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ
ＵＰＧＭＡ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ
组别
Ｇｒｏｕｐ
菌株
Ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｂ１ Ａ２，Ａ３，Ａ４２
Ｃ１ Ａ１
Ｃ２ Ａ１８，Ａ２６
Ｃ３ Ａ４７
Ｃ４ Ａ３１，Ａ３２
Ｄ１ Ａ４４，Ａ３４，Ａ１９，Ａ３５，Ａ４３
Ｅ１ Ａ４，Ａ７，Ａ８，Ａ５，Ａ６，Ａ１３，Ａ９，Ａ１５，Ａ１４，Ａ４９
Ｆ１ Ａ３７，Ａ４０，Ａ３３，Ａ４１
Ｆ２ Ａ２３，Ａ２５，Ａ２２，Ａ２０，Ａ２１，Ａ２４
Ｆ３ Ａ１０，Ａ４５，Ａ２７，Ａ２９，Ａ３０
Ｆ４
Ａ１１，Ａ２８，Ａ３８，Ａ３６，Ａ１７，Ａ４８，Ａ１２，Ａ１６，
Ａ４６，Ａ３９，Ａ５０
２．３遗传多样性分析
２．３．１形态分类群的遗传多样性分析
　　根据表１的形态分组用ＰＯＰＧＥＮＥ　ｖｅｒｓｉｏｎ
１．３２软件进行遗传多样性分析（表５、表６），个体
水平上，基因多样性指数Ｈ ＝０．３０３０，表型多样
性指数Ｉ＝０．４６３２。组间水平上，菌株多态位点
百分率Ｐ ＝１００％，Ｈ ＝０．２５１８，Ｉ＝０．３９６２；
组间的遗传分化不大（ＧＳＴ＝０．２３８２），平均有效
等位基因数ｎｅ为１．４０５１，遗传相似性系数在
０．９８３６～０．８１９２之间，基因交流比较频繁（基因
每代迁移数Ｎｍ ＝１．５９９３）。形态分类聚类结果
见图２Ａ，ＮＳ、ＳＮ和ＮＮ分组为一个群，和 ＭＢ遗
传距离较远，ＳＳ单独分为一组，这可能与在聚类
分析碱基分辨值筛选分析中ＳＳ组菌株产生带多
于其它三组菌株带型的总和有关。
２．３．２聚类分析分类群的遗传多样性分析
　　根据表４的形态分组用ＰＯＰＧＥＮＥ　ｖｅｒｓｉｏｎ
１．３２软件进行遗传多样性分析（表７，表８），个体
水平上，Ｈ ＝０．３０３０，Ｉ＝０．４６３２；间组水平上
Ｐ ＝１００％，Ｈ ＝０．２６３５，Ｉ＝０．４１１７，平均有
效等位基因数ｎｅ为１．４９６７，遗传相似性系数在
０．６３１６－０．９５４７之间，分组间基因交流不频繁
（Ｎｍ ＝０．４１４９），各分类群间极度分化（ＧＳＴ ＝
０．５４６５），根据Ｎｅｉ’ｓ无偏差遗传距离和相似性系
数，聚类分析分类群聚类结果见图２Ｂ，各聚类组
符合原本的聚类等级，其中Ｃ１、Ｃ３亚类与其它亚
组的遗传距离最远，多具产菌核性状菌株的Ｆ４、
Ｆ３、Ｆ１、Ｄ１亚组遗传距离近，可能控制产核的基
因表达效应不太明显，易受其它基因表达或环境
的影响。
表５　形态分类群的遗传多样性分析
Ｔａｂｌｅ　５　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｇｒｏｕｐｓ
编号
Ｇｒｏｕｐ
多态性位点数
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｓｉｔｅ
Ｐ（％） ｎｅ　 Ｈ　 Ｉ　 ＧＳＴ Ｎｍ
ＳＳ　 ３４４　 ６９．４９　 １．４２３３　 ０．２４９９±０．１９０１　０．３７４５±０．２６９９
ＮＳ　 ４５５　 ９１．９２　 １．５１０１　 ０．３０３７±０．１５８９　０．４６０２±０．２０８２
ＳＮ　 ４２７　 ８９．２６　 １．４９３１　 ０．２９１２±０．１７０９　０．４３９７±０．２３００
ＮＮ　 ３９５　 ７９．８０　 １．４６５９　 ０．２７７２±０．１７６０　０．４１７８±０．２４４３
ＭＢ － － １ － －
组间水平
Ｖａｌｕｅ　ｉｎ　Ｇｒｏｕｐｓ
１００　 １．４０５１　 ０．２５１８±０．１６１２　０．３９６２±０．２０９２　 ０．２３８２　 １．５９９３
表６　形态分类群的遗传距离与遗传相似性
Ｔａｂｌｅ　６　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｇｒｏｕｐｓ
编号 Ｇｒｏｕｐ　 ＳＳ　 ＮＳ　 ＳＮ　 ＮＮ　 ＭＢ
ＳＳ － ０．９７４４／０．０２５９　 ０．９７８１／０．０２２１　 ０．９７５１／０．０２５２　 ０．８２３０／０．１９４８
ＮＳ － ０．９８３６／０．０１６５　 ０．９８０７／０．０１９５　 ０．８１９２／０．１９９４
ＳＮ － ０．９８１９／０．０１８３　 ０．８３３８／０．１８１７
ＮＮ － ０．８２６２／０．１９０９
ＭＢ －
分子为遗传相似性，分母为遗传距离
Ｎｕｍｅｒａｔｏｒ　ｖａｌｕｅ＝ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ，ｄｅｎｏｍｉｎａｔｏｒ＝ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ
６１
第２期 陈立佼，等：尖顶羊肚菌遗传多样性的ＡＦＬＰ分析
表７　聚类分析分类群的遗传多样性分析
Ｔａｂｌｅ　７　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｇｒｏｕｐｓ
编号
Ｇｒｏｕｐ
多态性位点数
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｓｉｔｅ
Ｐ　 ｎｅ　 Ｈ　 Ｉ　 ＧＳＴ Ｎｍ
Ｂ１　 ２７０　 ５４．５５％ １．４３６４　 ０．２４２４±０．２２１５　０．３４７２±０．３１７３
Ｃ１ － － － － －
Ｃ２　 １３４　 ２７．０７％ １．２７０７　 １．１３５４±０．２２２４　０．１８７６±０．３０８３
Ｃ３ － － － － －
Ｃ４　 １２８　 ２５．８６％ １．２５８６　 ０．１２９３±０．２１９２　０．１７９２±０．３０３８
Ｄ１　 ２７３　 ５５．１５％ １．３９４８　 ０．２３４９±０．１９０１　０．３５４４±０．２６９８
Ｅ１　 ３３７　 ６８．０８％ １．３６０１　 ０．２１２０±０．２００１　０．３１３４±０．２９０６
Ｆ１　 ２２５　 ４５．４５％ １．３３７１　 ０．１８８９±０．２１０９　０．２７４９±０．３０４３
Ｆ２　 １７３　 ３４．９５％ １．２１２１　 ０．１２７０±０．１８２０　０．１９０６±０．２６７４
Ｆ３　 ２３１　 ４６．６７％ １．３１８３　 ０．１８４２±０．２０４６　０．２７１２±０．２９６１
Ｆ４　 ３０９　 ６２．４２％ １．３４６９　 ０．２０８９±０．１８９５　０．３１７３±０．２７１８
组间水平
Ｖａｌｕｅ　ｉｎ　Ｇｒｏｕｐｓ
１００％ １．４９６７　 ０．２６３５±０．１６０２　０．４１１７±０．２０６８　 ０．５４６５　 ０．４１４９
表８　聚类分析分类群的遗传距离与遗传相似性
Ｔａｂｌｅ　８　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｇｒｏｕｐｓ
编号
Ｇｒｏｕｐ
Ｂ１ Ｃ１ Ｃ２ Ｃ３ Ｃ４ Ｄ１ Ｅ１ Ｆ１ Ｆ２ Ｆ３ Ｆ４
Ｂ１ －
０．７１９２
０．３２９６
０．８４６３
０．１６９９
０．６８８１
０．３７３８
０．７８４３
０．２４３０
０．８９４８
０．１１１２
０．８８２９
０．１２４５
０．８３０９
０．１８５３
０．７９６２
０．２２７９
０．８８２７
０．１２４８
０．８７３８
０．１３４９
Ｃ１ －
０．７３５６
０．３０７１
０．６３２３
０．４５８４
０．６３１６
０．４５９５
０．７１８５
０．３３０５
０．６９９５
０．３３０５
０．６８１６
０．３５７４
０．６５００
０．４３０８
０．６９２０
０．３６８２
０．７３５３
０．３０７５
Ｃ２ －
０．７４８０
０．２９０４
０．８４３７
０．１７００
０．８９０９
０．１１５５
０．８６６８
０．１４３０
０．８８２４
０．１２５１
０．８４４７
０．１６８８
０．８８５３
０．１２１８
０．９５１７
０．０４９５
Ｃ３ －
０．７２５３
０．３２１２
０．７２９３
０．３１５７
０．７３０７
０．３１３７
０．７８２２
０．２４５６
０．７３２５
０．３１１３
０．７６６６
０．２６５８
０．７８０５
０．２４７８
Ｃ４ －
０．８３４１
０．１８１４
０．８４４９
０．１６８６
０．８８５７
０．１２１４
０．８４３５
０．１７０２
０．８６６６
０．１４３２
０．８６６５
０．１４３３
Ｄ１ －
０．９０１８
０．１０３４
０．９０４６
０．１００３
０．８６３５
０．１４６８
０．９１５９
０．０８７９
０．９３７９
０．０６４１
Ｅ１ －
０．８９９０
０．１０６４
０．８７６８
０．１３１４
０．９０９８
０．０９４５
０．９３２７
０．０６９７
Ｆ１ －
０．８８７０
０．１１９９
０．９２３８
０．０７９３
０．９４３４
０．０５８３
Ｆ２ －
０．８８６５
０．１２０５
０．８９４３
０．１１１８
Ｆ３ －
０．９５４７
０．０４６４
Ｆ４ －
分子为遗传相似性，分母为遗传距离
Ｎｕｍｅｒａｔｏｒ　ｖａｌｕｅ＝ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ，ｄｅｎｏｍｉｎａｔｏｒ＝ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ
７１
食　用　菌　学　报 第２０卷
Ａ：Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｇｒｏｕｐｓ
Ｂ：Ｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｇｒｏｕｐｓ
图２　形态分类群及聚类分析分类群的聚类分析
Ｆｉｇ．２　Ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ
ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ
３　讨论
　　食用菌的形态生理生化研究是该领域科学家
的重要基础研究，对于羊肚菌，其基于遗传和培养
条件而多变的菌丝菌核形态，一直是研究的热点
和瓶颈。我们对尖顶羊肚菌的单孢和多孢进行
ＡＦＬＰ遗传多态性分析，多态性比例为１００％，可
见其形态上的多态性来源于孢子形成过程中遗传
物质的分配和组合，但目前没有相关的规律的研
究，其它多态性分析数据能符合其来自同一子实
体这一相同的遗传背景差异。对于实验样品群
体，遗传分化越大，在 ＡＦＬＰ分子标记中群体在
酶切位点上的变异就越大，具有的特有谱带更
多，所以表现出高多态性比例。
供试的尖顶羊肚菌的单孢和组织分离菌株的
形态聚类结果符合最初的形态分类。将５０株菌
株个体进行１～１０ｂｐ分辨率的ＵＰＧＭＡ聚类后，
除个别单一菌株外，能得到９组较保守的聚类组，
且各聚类组进行遗传距离及多样性分析后，符合
ＵＰＧＭＡ聚类组等级。此外，菌丝颜色均一，是否
有斑纹这一性状在分子分类上符合形态分类。但
菌核产生性状的相似系数分类不太显著，说明与
产菌核相关的基因及其表达比较复杂，也可能在
该性状表达的每个过程中有很多相关的基因相互
影响，这可以在基因表达水平上进行更深入研究。
辜运富等对双孢蘑菇种内进行多态性的
ＡＦＬＰ分析，菌株之间的相似程度在７９％以上，证
明双孢蘑菇在遗传关系上差异不大，但不同菌株
具有自己独特的ＡＦＬＰ指纹图谱，说明ＡＦＬＰ技
术能够有效揭示双孢蘑菇菌株之间微弱的遗传多
态性［１８］。卓英等对香菇主要栽培菌株也进行了
遗传多样性的ＡＦＬＰ分析，通过构建的不同菌株
的指纹图谱的不同能够有效分辨其基因型，可为
香菇的栽培菌株质量监测和菌种鉴定提供快速有
效的技术手段［１９］。
本实验中尖顶羊肚菌四对引物扩增结果中，
特征峰多位于１４０～４４０ｂｐ之间，峰数量大小位
置在该范围内多变，但各菌株也具有自己独特的
ＡＦＬＰ指纹图谱（可根据０、１矩阵图统计得出，结
果未显示），可以作为羊肚菌分子多样性研究的理
论依据。
本实验中形态分类聚类结果与聚类组聚类结
果并无直接相关性，且各聚类组的产菌核及产菌
丝斑性状并不完全符合形态分类，说明羊肚菌菌
丝这两种形状的产生和变化不是单纯由基因控
制，特别是产菌核特性易受到环境因素的影响，也
有可能是在遗传座位上与其它基因连锁作用，使
得这些特性的多变，从而造成羊肚菌从基础研究
到栽培研究结果的不稳定。
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ＰＯＰＧＥＮＥ，ｔｈｅ　ｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ　ｓｈａｒｅｗａｒｅ　ｆｏｒ　ｐｏｐｕｌａ－
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Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｌｂｅｒｔａ，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，
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［１７］ＷＲＩＧＨＴ　Ｓ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
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Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＤｉｖｅｒｓｉｔｙＡｍｏｎｇＭｏｒｃｈｅｌｌａ　ｃｏｎｉｃａ
Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＡＦＬＰ　Ａｎａｌｙｓｉｓ
ＣＨＥＮ　Ｌｉｊｉａｏ１，２，ＣＨＡＩ　Ｈｏｎｇｍｅｉ　２，ＨＵＡＮＧ　Ｘｉｎｇｑｉ　２，ＺＨＡＯ　Ｙｏｎｇｃｈａｎｇ２＊
（１　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｙｕｎｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ　６５００９１，Ｃｈｉｎａ；
２　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｙｕｎｎａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ　６５０２０５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｏｒｔｙ－ｎｉｎｅ　ｓｉｎｇｌｅ　ａｓｃｏｓｐｏｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ａｎｄ　ｏｎｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆｒｕｉｔ　ｂｏｄｙ　ｏｆ
Ｍｏｒｃｈｅｌａ　ｃｏｎｉｃａ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｆｏｕｒ　ｇｒｏｕｐｓ　ｂａｓｅｄ　ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｃｏｌｏｎｙ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｇｅｎｅｔｉｃ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ＡＦＬＰ　ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｌｏｃｉ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｂｙ　４８８ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｂａｎｄｓ　ｒａｎｇｉｎｇ　ｉｎ　ｓｉｚｅ
ｆｒｏｍ　１００ｔｏ　６００ｂｐ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｆｏｕｒ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｅｓ．ＵＰＧＭＡ－ｂａｓｅｄ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｔｈｅ　５０ｔｅｓｔ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｉｎｔｏ　１１ｇｒｏｕｐｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ
ｆｉｖｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｇｒｏｕｐｓ （ＳＳ，ＮＳ，ＳＮ，ＮＮ，ＭＢ）ａｎｄ　ｔｈｅ　１１ ＵＰＧＭＡ－ｂａｓｅｄ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗａｓ
ｕｎｄｅｒｔａｋｅｎ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　１．３２ｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　ＰＯＰＧＥＮＥ　ｓｏｆｔｗａｒｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｏｒｃｈｅｌａ　ｃｏｎｉｃａ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＡＦＬＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ
［本文编辑］　曹　晖
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