全 文 ：研究报告 中 国 酿 造 2009年 第 6期总第 207期 83
雀稗麦角菌原生质体诱变育种及发酵条件研究
韩增飞 ,刘志国＊ ,曾丽娟 ,房国梁 ,付云洁
(武汉工业学院生物与制药工程学院 ,湖北 武汉 430023)
摘 要:为获得麦角碱高产菌株,提高雀稗麦角菌(Clavicepspaspalistrain3103)发酵的产碱率, 用溶壁酶水解处理菌丝体、不同浓度
的亚硝基胍诱变处理制备的原生质体 ,经再生培养获得诱变菌株 ,再经紫外初筛后进行发酵复筛 , 采用 Van-Urk方法测定产碱量。
筛选得到的高产菌株进行二级发酵并优化其发酵条件。实验结果表明 ,经亚硝基胍诱变处理 ,麦角总碱的产率由 90mg/L提高到了
1600mg/L,增加了约 16倍;单位产碱率由 22.5mg/L/g提高到了 400mg/L/g,增加了约 17倍;连续传代培养可以得到稳定的高产菌
株 ,接种量为 20%时可有效缩短发酵周期。结果表明 ,用亚硝基胍对原生质体进行诱变处理可有效提高C.papspali的产碱率。
关 键 词:雀稗麦角菌;原生质体;亚硝基胍;诱变育种;发酵
中图分类号:Q933;TS201.3 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(2009)06-0083-04
ProtoplastmutagenesisofClavicepspaspaliandoptimizationoffermentationconditions
HANZengfei, LIUZhiguo＊ , ZENGLijuan, FANGGuoliang, FUYunjie
(SchoolofBiologyandPharmaceuticalEngineering, WuhanPolytechnicUniversity, Wuhan430023 , China)
Abstract:ThestrainofClavicepspaspaliproducinghigheryieldofergotalkaloidswasobtainedthroughprotoplastmutagensis, inwhichthemycelium
ofClavicepspaspaliwasfirsttreatedbylywallzymeandthedifferentconcentrationsofthenitrosoguanidine, andthestablemutantswasobtainedafter
theprimaryscreenofUVandsecondscreenoffermentation.TheproductivityofergotalkaloidswasmeasuredbythemethodofVan-Urk.Theresults
showedthattheproductivityofergotalkaloidswasincreasedby16folds(from90mg/Lto1600mg/L)andtheunitproductivityofergotalkaloidswas
increasedby17 folds(from22.5mg/L/gto400mg/L/g).Inoculumof20%couldshorttheperiodoffermentation.Theseresultsindicatedthatthe
protoplastnitrosoguanidinemutagenesiswasafeasibleapproachtoincreasetheproductivityoflysergicamidebytheC.papspalistrain.
Keywords:Clavicepspaspali;protoplasts;nitrosoguanidine;mutagenesis;fermentation
收搞日期:2009-02-26
作者简介:韩增飞(1984-),男 ,山东临沂人 ,硕士研究生 ,研究方向为微生物生物技术;刘志国＊ ,教授 ,通讯作者。
雀稗麦角菌(C.paspali)属麦角菌属 ,其主要产生结构
简单的棒状麦角衍生物(如麦角酰胺),此类药物在临床
上用于治疗神经内分泌 、脑血管系统的疾病(如老年性痴
呆)以及产后止血或作为原料用于合成其他重要药物 [ 1] 。
因野生麦角产量不足 ,并受到自然条件的限制 ,麦角碱主
要依赖发酵生产。近几十年来 ,国外科研人员在菌种的选
育 、发酵技术及培养条件等方面进行了研究 [ 2] 。国内也有
利用麦角菌发酵生产麦角酰胺 、麦角新碱和麦角隐亭的报
道。由于雀稗麦角菌是多核细胞 ,一般培养条件下不易产
生分生孢子 ,发酵周期长 、麦角碱产率低 、生产成本高 ,因
此难以大规模应用于工业生产。至今国内的麦角碱类药
物仍然依赖进口。
本实验前期采用原生质体紫外诱变的方法对麦角
菌进行改造 ,麦角碱产率显著提高 ,从 20mg/L提高为
90mg/L[ 3] 。为进一步提高产碱率 ,在前期紫外诱变改
造的基础上 ,研究了亚硝基胍诱变方法 ,并对发酵条件
进行优化 ,为发酵生产麦角碱类药物奠定基础 。
1材料和方法
1.1 材料与仪器
雀稗麦角菌 (Clavicepaspalistrain3101):由国外收
集 ,本实验室保藏;原生质体高渗液:KCl0.7mol/L;溶壁
酶:广东微生物研究所生产;VAN-URK试剂:35mLH2O,
65mL浓 H2SO4 , 0.15mL10%(w/v)FeCl3 , 200mg对二甲氨
基苯甲醛。
斜面培养基:去皮马铃薯 200g,切块煮沸 0.5h后过
滤 ,加琼脂 20g,葡萄糖 20g,加水至 1000mL,用浓氨水调
pH值为 5.2。
液体菌丝体培养基 [ 3] :豌豆汁 0.3%,琥珀酸 1%,甘
露醇 4%, KH2PO4 1%, MgSO4· 7H2O0.03%。双蒸水配
制 ,用浓氨水调 pH值为 5.2。
黄豆汁再生培养基:黄豆粉 0.5%,葡萄糖 1%,甘露
醇 10%, ,琼脂 2%。双蒸水配制 ,浓氨水调 pH值为 5.2。
初筛培养基 [ 4] :甘露醇 5%, 琥珀酸 3%, KH2PO4
0.1%, 琼脂 2%, MgSO
4
·7H
2
O0.03%,双蒸水配制 ,用浓
氨水调 pH值为 5.2。
MYG培养基:麦芽糖 0.5%, 酵母膏 0.5%,葡萄糖
1%,甘露醇 0.6mol/L。
CYM培养基:蛋白胨 0.2%,酵母膏 0.5%, 甘露醇
0.6mol/L。
PDA培养基:土豆提取液 20% ,葡萄糖 20%,蔗糖
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0.6mol/L。
发酵复筛培养基:初筛固体培养基去掉琼脂。
RMYG、RCYM、RPDA分别为 MYG、CYM、PDA加上
2%琼脂。
高速离心机:上海安亭科学仪器厂;高速离心机
(CF-15R):日本日立;紫外可见分光光度计(WV8500):
上海精密仪器科学有限公司;三用紫外分析仪 (ZF-1):
江苏海门其林医用仪器厂;多用途微量检测仪(DNAEx-
pert):AustriaGmbH。
1.2 方法
1.2.1菌丝体培养
取适量于 27℃培养的菌种斜面幼嫩菌苔于研钵中研
磨 ,并接入菌丝体培养基中 , 27℃静置培养 3d～ 4d,用滤
网过滤收集菌丝体。
1.2.2原生质体的制备
菌体培养液 4000r/min离心 5min,收集菌丝体 ,先用无
菌水离心冲洗 1次 ,再用 0.7 mol/LKCl离心冲洗 2 ～ 3次 ,
按 0.2g∶1mg(菌丝体∶酶液)的比例加入含 10mg/mL溶壁酶
的高渗液中 ,在 28℃恒温水浴酶解 2h,每隔 15min振荡 1次
以利于细胞壁消化及原生质体的释放。酶解结束后 ,用无
菌脱脂棉柱过滤 ,离心收集沉淀并用 0.7mol/LKCl洗涤离
心(4000r/min、5min)2 ～ 3次 ,最后得到的原生质体溶液在
血球计数板上进行计数 , 4℃冷藏待用 [ 5] 。
1.2.3原生质体的诱变与再生
在通风橱中用 pH6.0的 PBS将亚硝基胍的四氢呋喃
饱和液稀释成 1∶10、1∶20、1∶200、1∶2000的 4个不同浓
度。向盛有 0.5mL原生质体悬浮液的 EP管中加入 0.1mL
不同浓度的亚硝基胍溶液 ,于 27℃避光反应 30min。各管
分别加入 0.5mL0.7mol/L的 KCl溶液混匀 , 4000r/min离
心 5min,洗涤终止诱变 ,弃上清 ,重复洗涤 2次后用 0.5mL
0.7mol/L的 KCl溶液悬浮原生质体。
分别取未诱变和诱变后的原生质体 0.1mL涂布到黄
豆汁再生平板上 ,用黑布包裹平板在恒温培养箱中 27℃
静置培养 5d～ 7d后观察结果。
1.2.4高产菌株的筛选
将再生的单菌落接种到初筛培养平板上 ,于 27℃培
养 10d～ 13d。根据麦角碱类物质具有荧光反应的特性 ,
将菌株置于紫外灯下观察荧光 ,根据荧光强度差异筛选高
产菌株 ,如此反复筛选 2 ～ 4次。将初筛选出的菌株于盛
有 50mL发酵培养基的试管中发酵培养 , 27℃、180r/min
振摇培养 11d～ 15d后 ,取发酵上清液进行总碱测定。取
发酵复筛得到的高产菌株进行连续传代培养 ,选取稳定的
高产菌株 [ 6] 。
用 Van-Urk法测定总碱含量 ,取发酵菌液经 4000r/mim
离心 5min,取上清液 1mL,加 2mLVan-Urk试剂 ,室温静置
4h后 ,于波长 550nm处测定吸光度值 ,以麦角酰胺标准物
配制标准系列按上述同样方法检测并绘制标准曲线 ,得到
标准曲线方程为 y=0.0082x+0.001, y为波长 550nm处的
吸光度值 , x为麦角酰胺浓度 (μg/mL),此法测定的是胞
外的麦角碱含量。
菌丝体用 4%酒石酸与丙酮 (1∶1)的混和液浸提 ,用
匀浆机高速匀浆 , 4000r/mim离心 5min,取上清液同上测
定(细胞内麦角碱)[ 7] 。
1.2.5菌株的发酵研究
将雀稗麦角菌种接种到新鲜斜面培养基中 ,于 25℃～
26℃活化培养 7d。斜面培养后 ,用接种针挑取幼嫩菌丝
于研磨器中 ,加水研磨至看不到菌丝块为止 ,用吸管接入盛
有 100mL液体种子培养基的三角瓶(体积为 250mL)中 ,在
27℃、160r/min～ 180r/min避光振荡条件下培养 4d～ 5d,作
为一级种子。将一级种子以 20%接种量转接到新鲜液体培
养基中培养 3d～ 4d作为二级种子 [ 8] 。
将原始菌株和诱变菌株的二级种子以 20%接种量接
入发酵培养基中 , 26℃～ 28℃、160r/min～ 180r/min避光振
荡条件下培养 14d～ 15d。每 24h取发酵上清液测其产碱
量 ,确定原始菌株和诱变株的产碱规律。
将诱变菌株的二级种子分别以 10%、15%、20%、25%、
30%的接种量接入发酵培养基中 , 25℃～ 28℃、160r/min～
180r/min避光振荡条件下培养 14d～ 15d。每 24h取发酵
上清液测其产碱量。
2结果与讨论
2.1液体菌丝体培养基对菌丝体生长及原生质体形成的影响
在探索 Clavicepspaspalistrain3101的菌丝体培养条
件及在该条件下产生的菌丝体对原生质体形成的影响时 ,
使用了豌豆汁 、MYG、CYM、PDA4种培养基 ,结果见表 1。
表 1 液体培养基对菌丝体生长及原生质体形成的影响
Table1.Efectofliquidmediumonmyceliagrowthandprotoplast
formation
项目 豌豆汁液体培养基 MYG CYM PDA
菌丝体生长状况 ++++ ++ ++ ++
原生质体数量 ++++ ++++ ++ +
原生质体形态 正常 ,圆球形 小 ,畸形 正常 ,圆球形
正常 ,
圆球形
注:“ +”的多少表示生长状态或数量的多少 。
从表 1可见 ,用豌豆汁液体培养基培养的菌丝体长势
最好 ,用其制备的原生质体数量最多 ,形态最好 ,故选用豌
豆汁液体培养基培养菌丝体。
2.2 再生培养基对原生质体再生的影响
原生质体失去了细胞壁的保护 ,极其脆弱 ,因而其再
生条件十分苛刻。其中再生培养基是一个重要的方面。
研究报告 中 国 酿 造 2009年 第 6期总第 207期 85
在实验中 ,将原生质体接种到 RMYG、RCYM、RPDA、黄豆
汁培养基中 ,结果见表 2。
表 2 原生质体在不同再生培养基上的再生情况
Table2.Theregenerationofprotoplastsondiferentmediums
RMYG RCYM RPDA 黄豆汁培养基
+ - - ++++
注:“ +”的多少表示生长状态或数量的多少 , “ -”表示没有再生菌
落生成。
从表 2可见 ,由豌豆汁液体培养基制备的原生质体在
黄豆汁培养基上再生数量最多 ,再生效果最好 ,故再生培
养基应选用黄豆汁培养基。
2.3 不同浓度的亚硝基胍处理后的再生情况
A、B、C、D分别为用磷酸缓冲液将亚硝基胍的四氢呋喃饱和溶液按
1∶10、1∶20 、1∶200 、1∶2000梯度稀释诱变后在再生培养基上生长情况
图 1 原生质体在不同浓度的亚硝基胍处理后再生结果
Figure1.EfectsofthedifferentconcentrationNTGontheregenera-
tionofprotaplasts
实验用 4个浓度梯度亚硝基胍进行诱变 ,由图 1可以
看出 ,随着浓度的增加 ,再生的菌落急剧减少 ,表明亚硝基
胍对原生质体具有杀伤作用 ,取浓度为 2.5×108个 /mL的
原生质体悬浮液 0.1mL涂布平板 ,不同浓度的平板再生菌
落数量见图 2。
A、B、C、D分别为用磷酸缓冲液将亚硝基胍的四氢呋喃饱和
溶液按 1∶2000、1∶200 、 1∶20 、 1∶10进行梯度稀释后的浓度
图 2 原生质体在不同浓度的亚硝基胍处理后再生数量比较
Figure2.Comparisonofprotaplastsregenerationquantity
aftertreatedbydiferentconcentrationNTG
2.4发酵筛选结果
液体菌丝体培养基制备的原生质体悬浮液(数量级为
10
8)用不同浓度的亚硝基胍处理 ,将诱变后的原生质体涂布
到黄豆汁培养基上再生后 ,初筛选取荧光反应强的菌株进行
发酵复筛 ,结果(表 3)可见 ,亚硝基胍浓度为 1∶10时 ,经过多
轮诱变处理其高产菌株 A2-5的产碱率达到 1200.244mg/L。
经过连续传代培养 ,其麦角碱的产率较稳定。
表 3 亚硝基胍对麦角酰胺产生菌原生质体的诱变
Table3.EfectofNTGonmutationofC.paspaliprotoplastproducing
lysergicacidamide
NTG浓度 处理时间 /min
诱变存活率 /
% 菌株数 突变株
产碱率 /
(mg·L-1)
1∶2000 30 20.8 400 D1-2 667.073
1∶200 30 15.6 400 C1-3 751.22
1∶20 30 12.8 400 B2-4 775.61
1∶10 30 10.5 400 A2-5 1200.244
将得到的高产菌株 A2-5和原始菌株 B10的胞内 、胞
外和总碱产量变化进行比较 ,结果见图 3。
1为原始菌株;2为高产菌株
图 3 原始菌株和诱变菌株胞内 、胞外总碱产量比较
Figure3.Comparisonofintracelularandextracelularergotalkaloid
concentrationbetweenoriginalstrainandmutagensisstrain
由图 3可见 ,诱变后得到的高产菌株胞外的麦角碱产
率比原始菌株提高了约 19倍 ,胞内的产碱率提高了约 12
倍 ,麦角总碱产率为 1.6g/L左右。
2.5原始菌株 B10与诱变菌株 A2-5发酵曲线比较
用亚硝基胍对雀稗麦角菌的原生质体进行诱变筛选
得到的高产菌株胞外总产碱量和单位产碱量都比原始菌
株有了明显的提高 ,结果见图 4。
2.6不同接种量对诱变菌株 A2-5胞外产碱率的影响
麦角菌发酵周期较长 ,合适的接种量可以在提高产量
的前提下有效地缩短发酵周期。在实验室前期工作确定
的最佳发酵条件 [ 3]基础上 ,着重对接种量进行了研究。由
图 5可以看出 , 接种量为 20%、发酵第 12d时产碱率达到
最大值且发酵周期最短 ,在保证产碱率前提下可以缩短发
酵时间。
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图 4 原始菌株与诱变菌株胞外(A)胞外单位产碱量(B)产碱量
Figure4.Curvesof(A)、extracelular(B)ergotalkaloidproductionby
originalstrainandmutagensisstrain
1为 25%接种量 , 2为 30%接种量, 3为 10%接种量 ,
4为 15%接种量 , 5为 20%接种量。
图 5 不同接种量对菌株 A2-5产碱率的影响
Figure5.Efectsofdiferentinoculumsonproductivityofergot
alkaloidsbystrainA2-5
3讨论
雀稗麦角菌细胞是多核的 ,一般培养条件下不易产生
分生孢子 ,本文用溶壁酶处理菌丝体制备原生质体 ,然后
以不同浓度的亚硝基胍对原生质体进行诱变处理 ,通过初
筛和复筛选出高产碱量的菌株。
进行菌丝体培养时 ,雀稗麦角菌在豌豆汁培养基中菌
丝体生长情况较好。实验以豌豆汁培养基在 27℃、180r/
min摇床避光振荡培养菌丝体 7d～ 8d,将其作为一级种
子转接到新鲜豌豆汁培养基中继续培养 2d～ 3d,发现菌
丝体连在一起呈放射状 、长势好 ,由其制备的原生质体呈
圆球形 、体积大 、数量多 ,在黄豆汁培养基上再生效果好 ,
故实验菌丝体的培养选取豌豆汁液体培养基 ,以其培养的
二级种子作为原生质体制备的材料。
影响原生质体形成的因素很多 ,如培养基成分会直接
影响菌丝细胞壁的构成 ,从而使细胞壁对酶的敏感性发生
相应的变化 ,影响原生质体的释放。此外菌丝体的菌龄 、
渗透压稳定剂的种类 、pH值 、酶解温度和酶解时间等因素
及渗透压稳定剂的种类和 pH值也是影响原生质体释放
的重要因素 [ 9] 。
影响原生质体诱变后再生的因素主要是再生培养基
的成分 ,有些研究表明用 RMYG培养基本再生可得到大
量再生菌落 ,但实验用 RMYG培养基未得到再生菌落。
在探索再生培养基的条件时 ,尝试了几种再生培养基
(RCYM、RPDA、黄豆汁再生培养基 ),发现原生质体在黄
豆汁再生培养基上再生效果最好。
接种量的选择对缩短麦角菌的发酵周期非常重要 ,即
在不影响产碱量的前提下如何使菌体密度在最短时间内
达到最大 ,从而缩短麦角菌的发酵周期。本实验表明 ,当
接种量为 20%时 ,麦角碱达到最大产量所用的时间最短 ,
且产碱量最高。因此本实验选择 20%的接种量。
不同浓度的 NTG进行诱变处理均能得到稳定的高产
菌株 ,国内用麦角菌的原生质体进行诱变育种的报道较
少 ,通过上述研究 ,找到了一条快速 、有效提高麦角酰胺产
率的途径。在对得到的高产菌株的发酵条件进行优化后 ,
麦角碱的总产碱量达到 1.6g/L左右 ,为工业发酵生产麦
角碱类药物奠定了基础。
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