全 文 ：收稿日期:2011-04-03
作者简介:姬丽婷(1988 －) ，女，从事食品科学与工程专
业方面研究。通讯作者:倪勤学(1983 －) ，女，讲师，从事天然
产物化学与功能性食品的研发。E-mail:niqinxue@ hotmail．
com
正交设计优化鸡毛竹叶子抗氧化物的提取工艺
姬丽婷1 刘 晔2 谢 洪1 倪勤学1
(1．浙江农林大学，农业与食品科学学院，浙江 临安 311300;
2．杭州市食品酿造有限公司，浙江 杭州 310019)
摘 要 探索一条高效的鸡毛竹叶子抗氧化物的提取工艺。以提取物清除 DPPH自由基的半抑制浓度
IC50为指标，在单因素试验的基础上采用 L9(3
4)正交试验法对鸡毛竹叶子抗氧化物质的提取工艺进行
优化。结果表明提取温度、料液比、乙醇浓度和提取时间对竹叶抗氧化物提取均具有显著影响，优化的
鸡毛竹叶子抗氧化物的提取条件为:提取温度 80℃，料液比 1∶ 20，乙醇浓度 90%，提取时间 80 min，提取
物清除 DPPH自由基 IC50为 0． 3098 mg /mL，提取物中含有总酚 3． 34%，总萜 2． 89%。为鸡毛竹叶的开
发利用提供理论依据。
关键词 正交实验法;鸡毛竹叶子;抗氧化物;DPPH自由基;总酚;三萜
Optimized Extraction Technology of Antioxidants from
Shibataea chinensis Leaves by Orthogonal Experimental Design
Ji Liting1 Liu Ye2 Xie Hong1 Ni Qinxue1
(1． Agriculture and Food Science School，Zhejiang Agriculture and Forestry University，Linan 311300，Zhejiang，China;
2． Hangzhou Food Fermentation Co．，LTD，Hangzhou 310019，Zhejiang，China)
Abstract To develop an efficient method to extract antioxidants from Shibataea chinensis
leaves，taking IC50，i． e． half inhibitory concentration for eliminating DPPH radical activity，as
response indicator，and the L9 (3
4) orthogonal test was made to optimize the extraction
technology． Results showed that the optimal extraction conditions were as follows:temperature
80℃，material / liquid ratio 1 ∶ 20，extraction duration 80 min and the ethanol concentration
90%，the IC50 of the extract was 0． 3098 mg /mL，including total phenolics 3． 34% and
triterpenoids 2． 89% ．
Key words Orthogonal experimental design;Leaves of Shibataea chinensis;Antioxidants;
DPPH radical;Total phenolics;Triterpenoids
竹 子 属 禾 本 科 (Gramineae)竹 亚 科
(Bambusoideae)的多年生木本常绿植物，其次
生代谢复杂，是当今最具有使用价值的植物分
类群之一。竹子以其独特的生物学、生态学及
多用途等特点，日益受到人们的重视。竹叶除
纤维素、半纤维素、糖类等物质外，还含有大量
对人体有益的黄酮酚酸类、氨基酸肽类、蒽醌
类、萜类内酯等活性物质［1 ～ 2］。其中竹叶黄酮
作为一种高效的生物抗氧化剂成为人们研究的
焦点，它具有类似超氧化物歧化酶(SOD)和谷
胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的作用，可清除体
内自由基，具有防止血管硬化、血栓形成，及调
节血脂、抗炎、抗菌、增强免疫力的功效［3 ～ 5］。
2004 年，来源于竹叶酚性部位的竹叶抗氧化物
(Antioxidant of Bamboo Leaves，AOB)被批准列
第30卷 第3期
2 0 1 1 年 8 月
竹 子 研 究 汇 刊
JOURNAL OF BAMBOO RESEARCH
Vol． 30，No． 3
Aug．，2 0 1 1
入《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标
准》(GB 2760)［6］，并作为天然抗氧化剂在食品
行业中得到越来越广泛的应用。但目前，人们
对竹子有效成分的研究主要集中在以刚竹属品
种为代表的经济竹种上，从其叶的生物量和采
集的难易程度看，并没有太大的优势。地被竹
种由于其秆形矮小、叶子密集、生物量大，适于
机械化采摘。而我们课题组实验证明地被竹中
倭竹属鸡毛竹(Shibataea chinensis)叶子的总
酚、总黄酮及三萜含量较高，且清除 DPPH自由
基的能力和还原铁离子的能力显著高于其它的
地被竹种，尤为值得关注。故本实验以倭竹属
鸡毛竹叶子为实验对象，采用回流提取法，以提
取物清除 DPPH 自由基的 IC50为指标，以提取
温度、料液比、提取时间和乙醇浓度为参考因
素，通过正交设计优化鸡毛竹叶子抗氧化物的
提取工艺，为竹叶新资源的开发及竹叶抗氧化
物的进一步开发利用提供试验依据。
1 材料与方法
1． 1 材料、试剂与仪器
叶样的采集:倭竹属鸡毛竹(Shibataea
chinensis)叶样于 2010 年 8 月采自浙江省临安
市浙江农林大学的翠竹园。
主要试剂:对羟基苯甲酸、熊果酸、DPPH
(2，2-二苯基-1-苦味酰苯肼)、香草醛购自
Sigma公司，纯度均大于 98%;福林试剂购自上
海鼎国生物科技有限公司;甲醇、乙醇、冰醋酸，
高氯酸、碳酸钠等为分析纯，水为去离子水。
主要仪器设备:DGG-9053AD 电热恒温鼓
风干燥箱，T6 新世纪紫外可见分光光度计，R-
201 旋转蒸发仪，红外线快速水分测定仪等。
1． 2 方法
1． 2． 1 叶样预处理 新鲜鸡毛竹叶子清洗干
净，沥干，立刻用微波杀青(WD800 G 微波炉，
640 w，间隙加热 2 ～ 3 次，每次 60 s) ，然后置于
烘箱(60℃ ± 1℃)中干燥 2 h，粉碎，过 40 目
筛，测定水分含量。试样抗氧化性能及有效成
分含量均折合成叶干基计。
1． 2． 2 竹叶抗氧化物的提取工艺 工艺流程:
准确称取鸡毛竹叶子粉末 1． 00 g→在一定条件
下回流提取→趁热过滤→少量提取溶剂洗渣→
旋转蒸发仪浓缩至膏状→蒸馏水定容到 50 mL
→待测液。
设置其他条件一致的基础上，分别研究提
取温度(40、60、70、80、90 ℃)、料液比(1∶ 10、1∶
15、1∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35)、乙醇浓度(40%、
60%、70%、80%、90%、100%)和提取时间
(20、40、60、80、100、120 min)4 个因素对竹叶
抗氧化物提取的影响。在单因素试验结果的基
础上，以清除 DPPH自由基的 IC50为指标，选取
提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度为考察
因素，各取 3 个水平，选用 L9(3
4)正交试验设
计对竹叶抗氧化物提取工艺进行优化。每组平
行 3 次。
为进一步考察上述优选工艺的稳定性，以
优化的工艺条件提取竹叶抗氧化物，测定其清
除 DPPH自由基能力及其总酚和总萜含量。试
验重复 3 次。
1． 2． 3 DPPH 自由基清除试验 准确称取
DPPH试剂 0. 02 g，用甲醇溶解至 500 mL 容量
瓶中，摇匀得 0. 101 mmol·L －1。分别取 0. 1
mL待测样液和 3. 9 mL DPPH 溶液混合摇匀，
在室温下反应 1 h，在 517 nm 波长下测定吸光
度［7 ～ 8］。以甲醇为空白对照。
抑制率(%)=(A空白0 － A样品)/A空白 × 100
以待测样品溶度为横坐标，抑制率为纵坐
标得待测样品清除 DPPH自由基的曲线。根据
回归方程，计算得到 DPPH 自由基清除率的半
抑制溶度(IC50)。
1. 2. 4 总酚含量的测定 标准曲线的制作:用
去离子水配制 0. 250 mg·mL －1的对羟基苯甲
酸标准溶液。准确吸取对羟基苯甲酸标准溶液
0、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、1. 20 mL，至 25
mL具塞试管中，分别用水稀释至 10. 0 mL;各
加入 1. 0 mL 福林试剂和 2. 0 mL 20% 的
Na2CO3水溶液，试管在沸水浴上加热 1 min，然
后用水冷却并稀释至 25 mL。室温放置 30
min。以零管为空白，在 745 nm 的波长处测定
吸光度。以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标绘
制标准曲线，得到标准曲线方程为 y = 1. 6982x
+ 0. 1111(r2 = 0. 9929)。
样品总酚的测定:取待测液 0. 2 mL，按制
45 竹 子 研 究 汇 刊 第 30 卷
作标准曲线的方法在 745 nm 的波长处测定吸
光度，并根据对羟基苯甲酸的标准曲线按照公
式 1 计算待测样的总酚含量。
总酚含量(%)=
m1 × V2
m × V1
× 100 (1)
式中:m1 －依据标准曲线计算出被测液中
对羟基苯甲酸的质量数(mg) ;m －供试样品取
样量(mg) ;V1 －待测液分取的体积(mL) ;V2 －
待测液总体积(mL)。
1. 2. 5 三萜含量的测定 标准曲线采用文献
［9］的方法，略作调整。用无水乙醇配制 0. 1
mg /ml熊果酸标准品溶液。吸取熊果酸标准品
溶液 0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 mL，于加热状
态下氮气吹干溶剂，分别加入 5%香草醛 －冰
醋酸 0. 5 mL，然后加入高氯酸 0. 8 mL，混匀后
于 65 ℃水浴反应 15 min，取出放置冰水中冷
却，加冰醋酸 5 mL，在 548 nm 处测定吸光度。
以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲
线，得到标准曲线方程为 y = 5. 6997x － 0. 0183
(r2 = 0. 9950)。
样品中总萜含量的测定:取待测液 0. 15
mL，按制作标准曲线的方法在 548 nm 处测定
吸光度，并根据熊果酸的标准曲线按照公式 2
计算待测样的三萜含量。
总萜含量(%)=
m1 × V2
m × V1
× 100 (2)
式中:m1 －依据标准曲线计算出被测液中
熊果酸的质量数(mg) ;m － 供试样品取样量
(mg) ;V1 －待测液分取的体积(mL) ;V2 －待
测液总体积(mL)。
1． 2． 6 数据处理 正交试验结果采用 SPSS
16． 0 统计软件进行方差分析。
2 结果与分析
2． 1 单因素试验结果与分析
2． 1． 1 提取温度对竹叶抗氧化物提取的影响
在乙醇浓度为 70%，料液比 1 ∶ 20，提取时间
为 80 min 的条件下，设计提取温度为 40 ℃、
50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃提取竹叶抗氧
化物质。考察提取温度对竹叶抗氧化物提取的
影响。结果见图 1。
图 1 不同提取温度竹叶提取物的抗氧化性
Fig． 1 Effects of temperature on the antioxidative
activity of extraction from bamboo leaves
由图 1 可知，在一定范围内，随着提取温度
的增高，IC50随之降低，即竹叶提取物的抗氧化
能力增强，在 80 ℃左右出现峰值。在 80℃之
后，IC50略有所升高。原因可能是随着温度的
逐渐升高，溶液扩散速度加快，溶剂对抗氧化物
质的溶解度逐渐增加，但是超过一定温度后，部
分抗氧化物质被破坏，从而降低了竹叶提取物
的抗氧化性能。故选择提取温度 70 ℃、80 ℃、
90 ℃进行正交实验。
2． 1． 2 料液比对竹叶抗氧化物提取的影响
在提取温度为 80℃，乙醇浓度为 70%，提取时
间为 80 min的条件下，设计料液比为 1∶ 10、1∶
15、1∶ 20、1∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35 提取竹叶抗氧化物
质。考察不同料液比对竹叶抗氧化物提取的影
响。结果见图 2。
图 2 不同料液比竹叶提取物的抗氧化性
Fig． 2 Effects of material / liquid ratio on the antioxidative
activity of extraction from bamboo leaves
结果表明:IC50在实验设定的料液比中始
终呈现下降趋势，即竹叶提取物的抗氧化性能
随着料液比的增加而增强，但在料液比 1∶ 25 之
后下降相对缓慢，故再增加提取液对提高竹叶
提取物抗氧化性能的意义不大，出于节约溶剂、
降低成本的考虑，料液比不宜太高。故选择料
液比 1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30 进行正交试验。
2． 1． 3 乙醇浓度对竹叶抗氧化物提取的影响
55第 3 期 姬丽婷等 正交设计优化鸡毛竹叶子抗氧化物的提取工艺
在提取温度为 80 ℃，料液比为 1∶ 20，提取时
间为 80 min的条件下，设计乙醇浓度为:40%、
60%、70%、80%、90%、100%提取竹叶抗氧化
物。考察不同乙醇浓度对竹叶抗氧化物提取的
影响。结果见图 3。
图 3 不同乙醇浓度竹叶提取物的抗氧化性
Fig． 3 Effects of ethanol concentration on the antioxidative
activity of extraction from bamboo leaves
由图 3 可知随着乙醇浓度的提高，IC50减
小，即竹叶提取物的抗氧化性增强，在乙醇浓度
为 80%左右竹叶抗氧化性能出现峰值。当乙
醇浓度大于 80%时，IC50增大，即竹叶抗氧化性
能减弱。随着乙醇体积分数的提高会使一些醇
溶性杂质、亲酯性强的成分溶出量增加［10］，但
是竹叶抗氧化物的溶出逐渐达到饱和，出于节
约溶剂、降低成本的考虑，乙醇浓度不宜太高，
故选用乙醇体积分数 70%、80%、90%进行正
交试验。
2． 1． 4 提取时间对竹叶抗氧化物提取的影响
在提取温度为 80 ℃，乙醇浓度为 70%，料液
比为 1 ∶ 20 的条件下，设计提取时间为 20、40、
60、80、100、120 min 提取竹叶抗氧化物质。考
察不同提取时间竹叶抗氧化物提取的影响。结
果如图 4。
图 4 不同提取时间竹叶提取物的抗氧化性
Fig． 4 Effects of extraction time on the antioxidative
activity of extraction from bamboo leaves
由图 4 可知，当提取时间在 70 min 时，提
取物 IC50较低，抗氧化能力较强。在 20 ～ 70
min之间，竹叶提取物抗氧化能力增强;在 70 ～
120 min 之间，提取物的抗氧化性呈减弱趋势。
其原因可能是加热时间过长，部分抗氧化物分
解。故选择提取时间 60 min、80 min、100 min
进行正交试验。
2． 2 正交试验结果
在单因素试验的基础上采用乙醇回流提取
法，选择影响提取效率的主要因素:提取温度
(A)、料液比(B)、乙醇浓度(C)和提取时间
(D) ，以提取物清除 DPPH 自由基的 IC50为指
标，采用 L9(3
4)正交表进行实验。结果列于表
1。并对结果进行方差分析见表 2。
表 1 L9(3
4)正交试验设计及结果
Tab． 1 Design and result of L9(34)orthogonal experiment
水平
Level
因素 Factor
A提取温度
Temperature(℃)
B料液比
Material / liquid ratio
C乙醇浓度
Ethanol concentration(%)
D提取时间
Extraction time (min)
半抑制
浓度 IC50
1 1 1 1 1 0． 322 9
2 1 2 2 2 0． 320 3
3 1 3 3 3 0． 335 3
4 2 1 2 3 0． 408 4
5 2 2 3 1 0． 419 9
6 2 3 1 2 0． 391 7
7 3 1 3 2 0． 406 7
8 3 2 1 3 0． 343 6
9 3 3 2 1 0． 346 4
Ti1 0． 978 5 1． 138 0 1． 058 2 1． 089 2
Ti2 1． 220 0 1． 083 8 1． 075 1 1． 118 6
Ti3 1． 096 7 1． 073 4 1． 161 9 1． 087 4
Xi1 0． 326 2 0． 379 3 0． 352 7 0． 363 1
Xi2 0． 406 7 0． 361 3 0． 358 4 0． 372 9
Xi3 0． 365 6 0． 357 8 0． 387 3 0． 362 5
R 0． 082 0． 022 0． 044 0． 015
65 竹 子 研 究 汇 刊 第 30 卷
表 2 正交试验方差分析表
Tab． 2 Variance analysis of orthogonal experiment
方差来源
Source
离均差平方和
Sum of squares
自由度
df
均方差
Mean square F值
显著性
Sig．
提取温度
Temperature 0． 029 2 0． 015 205． 927 0． 000
＊＊
料液比
Material / liquid ratio 0． 002 2 0． 001 16． 978 0． 000
＊＊
乙醇浓度
Ethanol concentration 0． 006 2 0． 003 43． 703 0． 000
＊＊
提取时间
Extraction time 0． 001 2 0． 000 4． 329 0． 029
*
误差 Error 0． 001 18 0． 000
总和 Total 3． 659 27
由表 2表 3可知，提取温度、料液比、乙醇浓
度和提取时间对竹叶抗氧化物提取均具有显著
影响，各因素的影响次序为:提取温度 ＞乙醇浓
度 ＞ 料液比 ＞提取时间。优化的各因素最佳工
艺条件为 A2B1C3D2，即提取温度为 80 ℃，料液
比为 1∶ 20，乙醇浓度 90%，提取时间为 80 min。
3． 3 验证实验
为检验正交试验法的可靠性，采用上述优
化的条件提取竹叶抗氧化物，实际测得的 IC50
值为 0． 3098 mg·mL －1，按照方法1． 2． 4和1． 2． 5
测得最优条件下提取的竹叶提取物中含有总酚
3． 34%，总萜 2． 89%。文献记载竹提取物中总
酚含量平均在 2%左右［4］，因此正交设计确定
的最佳条件下提取的鸡毛竹叶子提取物中含有
较高的总酚。说明采用正交设计优化得到的回
流提取条件参数准确可靠，具有实用价值。
4 小结与讨论
用正交设计优化鸡毛竹叶子抗氧化物的提
取工艺，提高了从鸡毛竹叶子中提取抗氧化物
的效率。优化的提取条件为:提取温度 80 ℃，
料液比 1∶ 20，乙醇浓度 90%，提取时间 80 min，
提取物清除 DPPH 自由基 IC50为 0． 3098 mg·
mL －1，含有总酚 3． 34%，总萜 2． 89%。
随着经济的发展和人民生活水平的提高，
消费者对食品安全和自身健康的关注程度不断
提高。天然抗氧化剂将势必会受到人们越来越
多的关注。作为我国本土丰富资源的竹叶抗氧
化物越来越被人们青睐。绿化效率高，耐寒冷，
病虫危害少，养护成本很低的地被竹，因其叶面
系数高，还具有减少尘土与病菌的传播、净化空
气、降低气温、改善空气湿度、减少地面辐射等
保健作用，是定向培育叶用竹林的优良选择。
鸡毛竹作为地被竹的一种，具有较强的抗氧化
性能。对其抗氧化物提取工艺的优化为竹叶新
资源的开发和竹叶提取物的进一步开发利用提
供了科学的实验依据。
参 考 文 献
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中黄酮类和酚酸类成分［J］．中草药，2010，41(1) :63 ～ 65
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展［J］．生物质化学工程，2008，42(3) :31 ～ 37
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竹叶中关键气味活性物质［J］． 竹子研究汇刊，2009，28
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究进展［J］．安徽农业大学学 报，2007，34(3) :328 ～ 333
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