全 文 ：192
稻谷芒中羟甲香豆素的
鉴定及总香豆素提取工艺
段 红，翟科峰，曹稳根，严保培
(1.宿州学院特色种植业苗种生产工程技术研究中心，安徽宿州 234000;
2.宿州学院生物与化学工程学院，安徽宿州 234000)
摘 要:目的:确定稻谷芒中含有羟甲香豆素类成分，并研究稻谷芒中总香豆素超声波提取法的最佳工艺条件。方法:
采用 TLC、HPLC法对羟甲香豆素进行定性鉴别;以出膏率和总香豆素含量为参考指标，在单因素实验基础上，采用正
交实验优化乙醇浓度﹑料液比、提取温度和超声时间。结果:稻谷芒含有羟甲香豆素，总香豆素的最佳提取工艺条件
为乙醇浓度为 55%，料液比 1∶30，提取温度为 70℃，超声时间为 60min，功率为 96W。结论:明确了香豆素类成分是稻
谷芒活性物质基础，优化出总香豆素的提取工艺稳定可行，具有较高的经济价值与应用前景。
关键词:稻谷芒，香豆素，定性鉴别，正交实验法，提取工艺
Study on identification of hymecromone and total coumarin
in extraction process from orysan sativa
DUAN Hong，ZHAI Ke－feng，CAO Wen－gen，YAN Bao－pei
(1.Engineering Ｒesearch Center of Special Farm Seed Production，Suzhou University，Suzhou 234000，China;
2.School of Biological ＆ Chemical Engineering，Suzhou University，Suzhou 234000，China)
Abstract:The purpose of the paper was to confirm orysan sativa containing hymecromone and to use the ultrasonic
wave extraction in the total coumarin from orysan sativa trying to get the optimum extraction conditions.
Hymecromone in orysan sativa was identified by TLC and HPLC methods.The extract rate and total content of
coumarins as indexes，orthogonal experimental principle based on the single factor experiments was used to
optimize the concentration of ethanol，the ratio of material to liquid，temperature and ultrasonic time.The results
showed that hymecromone did exist in orysan sativa and the optimal extraction conditions of total coumarins of
material were as follows:ethanol concentration 55%，solid－ liquid ratio 1∶30，extraction temperature 70℃，extraction
time 60min，power 96W.The conclusion had reached that the coumarins were mainly active ingredients in orysan
sativa and the extraction process of total coumarins was stable and feasible，which had strong adaptability，high
economic value and wide application prospect.
Key words:orysan sativa;coumarin;qualitative identification;orthogonal experimental design;extraction technology
中图分类号:TS201.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2014)05－0192－04
收稿日期:2013－08－20
作者简介:段红(1981－) ，女，硕士，研究方向:天然活性成分提取分离
及活性研究。
基金项目:安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2012A264) ;宿州
学院特色种植业苗种生产工程技术研究中心开放课题
(2013YKF11、2010YKF27、2013YKF13、2010YKF25)。
稻谷芒，为禾本科植物稻的果实上的细芒刺，资
源丰富，我国南北地区的水稻栽培区均能采摘。《本
草拾遗》:“主黄病身作金色，稻谷芒炒令黄，细研作
末，酒服之。”，具有清热利湿、除黄等功能，主治黄
疸。稻谷芒中含有的主要药用化学成分为香豆素、
黄酮类化合物、有机酸、内酯、强心苷和皂苷等［1］。羟
甲香豆素为香豆素衍生物，羟甲香豆素制剂能松弛
奥狄括约肌，具有较强的解痉、镇痛作用，同时也能
温和、持续地促进胆汁分泌，加强胆囊收缩和抑菌作
用，具有明显的利胆作用［2］。羟甲香豆素与稻谷芒利
胆的功能主治一致，稻谷芒含有香豆素类成分，是否
也含有羟甲香豆素，即稻谷芒中羟甲香豆素是稻谷
芒发挥利胆的主要活性成分，这是亟需确定的问题。
由于羟甲香豆素是合成香料、医药、农药及染料
的重要中间体［3］，国内外需求量较大。目前羟甲香豆
素来源主要是通过化学合成，但传统化学合成方法
具有易腐蚀设备、环境污染较大等缺点［4］。因此，从
植物中提取羟甲香豆素是绿色环保的有效途径
之一。
本文首先采用 TLC、HPLC 法对稻芒中羟甲香豆
素进行定性鉴别，并以羟甲香豆素为对照品，建立
UV法测定总香豆素含量的方法。在此基础上，进一
步优化稻谷芒中总香豆素的提取工艺参数，为稻谷
193
芒中香豆素类成分的开发和工业化生产提供实验
依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
稻谷芒、稻糠 巢湖地区稻子上收集;羟甲香豆
素对照品 中国药品生物制品鉴定所;水为超纯水;
其他试剂均为分析纯。
U－3310 紫外可见光谱仪 日本 Hitachi 公司;
LC－20AT 高效液相色谱仪 日本岛津;KQ5200DB
型数控超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司;
BP211D型十万分之一电子天平 Sartorius;WD－
9403B紫外仪 北京市八一仪器厂;ＲE－52 旋转蒸
发仪 上海洪纪仪器设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液配制 对照品溶液配制:精密称取
4.83mg羟甲香豆素对照品，加甲醇适量，配成浓度为
193.2μg /mL母液。
样品溶液制备:精密称取稻谷芒粗粉 2.0g 置于
烧瓶中，按实验设计进行超声波提取。定性分析样
品液用无水乙醇超声提取［5］，浓缩到原体积的 1 /5，
用等体积乙酸乙酯反复萃取 3 次，取上层部分，再将
其浓缩，定容，过滤。
1.2.2 稻谷芒中羟甲香豆素定性鉴别 在硅胶薄层
板上点上样品和对照品［5］，置于展开剂(正己烷∶乙酸
乙酯 = 1∶1)中展开，将展开好的薄层板烘干置于三
用紫外分析仪中，365nm 下观察。HPLC 色谱条件
为［6］:Shim － pack VP － ODS C18(150mm × 4.6mm ×
5um)柱;流动相为甲醇 ∶ 水 (25 ∶ 75) ;流速为
1.0mL /min;检测波长为 320nm;柱温 30℃;进样
20μL。测定对照品与样品中羟甲香豆素 Ｒf 值与 TＲ
是否一致，从而确定稻谷芒中有无羟甲香豆素。
1.2.3 羟甲香豆素标准曲线绘制 精密吸取上述母
液，稀释成浓度分别为 19.32、38.64、57.96、77.28、
96.60μg /mL 溶液。在 320nm 分别测其吸光度［7－9］，
以对照品浓度 X为横坐标，吸光值 Y为纵坐标，绘制
标准曲线，羟甲香豆素的回归方程为 Y = 0.0072X +
0.026，r = 0.9990。表明羟甲香豆素浓度在 19.32 ～
96.60μg /mL范围内线性关系良好。
1.2.4 总香豆素的得率 将各提取样品的吸光度代
入标准曲线，计算其浓度。根据样品定容的体积，计
算总香豆素含量，总香豆素的得率(%)=(提取总香
豆素质量 /稻谷芒质量)× 100。
1.2.5 总香豆素的出膏率 将坩埚干燥至恒重，精
密称定 m1，精密移取 25mL 提取液(相当于 0.5g 药
材)置坩埚里水浴蒸干，置干燥箱中烘至恒重 m2，总
香豆素的出膏率(%)=(m2－m1)/0.5 × 100。
1.2.6 总香豆素提取效率的综合评分 为了保证总
香豆素有较好的提取效果，要求提取结果既要体现
提取物的出膏率大，又要体现提取物中总香豆素的
含量高。所有以出膏率和总香豆素含量为综合考察
指标优选提取工艺，权重系数为 0.3 ∶0.7。综合评分
(OD)公式如下:OD =(出膏率 /最大出膏率)× 30%
+(总香豆素得率 /最大总香豆素得率)70%。
1.2.7 稻谷芒中总香豆素提取工艺优化
1.2.7.1 超声时间的影响 超声法提取，料液比为
1∶25，温度为 50℃，功率为 128W，乙醇浓度为 75%，
设置超声时间为 50、60、70、80min，测定并计算每组
提取效率的综合评分(n = 3)。
1.2.7.2 超声功率的影响 超声法提取，料液比为
1∶25，超声时间为 70min，温度为 50℃，乙醇浓度为
75%，设置超声功率为 80、96、112、128W，测定并计
算每组提取效率的综合评分(n = 3)。
1.2.7.3 料液比的影响 超声法提取，超声时间为
70min，功率为 96W，温度为 50℃，乙醇浓度为 75%，
设置料液比为 1∶25、1∶30、1∶40、1 ∶50，测定并计算每
组提取效率的综合评分(n = 3)。
1.2.7.4 超声温度的影响 超声法提取，时间为
70min，功率为 96W，总料液比为 1 ∶ 40，乙醇浓度为
75%，设置超声温度为 50、60、70、80℃，测定并计算
每组提取效率的综合评分(n = 3)。
1.2.7.5 乙醇浓度的影响 超声法提取，时间为
70min，功率为 96W，总料液比为 1∶40，温度为 70℃，
设置乙醇浓度为 15%、35%、55%、75%，测定并计算
每组提取效率的综合评分(n = 3)。
1.2.8 正交实验优化总香豆素提取工艺 单因素实
验分别考察超声时间、超声功率、料液比、超声温度、
乙醇浓度五个因素及水平对总香豆素提取效果的影
响［10－11］，并确定四因素三水平的最佳参数进行正交实
验。正交设计的因素水平见表 1。
表 1 正交实验因素和水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水 平
因素
A乙醇浓度
(%)
B料液比
(g /mL)
C提取温度
(℃)
D超声时间
(min)
1 35 1∶30 60 60
2 55 1∶40 70 70
3 75 1∶50 80 80
1.2.9 数据统计分析 采用 Microsoft office Excel
2003 软件绘制表格和图形，采用 SPSS 17.0 进行方差
显著性分析。
2 结果与分析
2.1 稻谷芒中羟甲香豆素定性鉴别结果与分析
TLC结果见图 1，样品与对照品在同一 Ｒf 值处
出现蓝色荧光，表明稻谷芒和稻糠中含有羟甲香
豆素。
HPLC结果见图 2，在 22.00min 时，样品与对照
品中出现羟甲香豆素峰，表明稻谷芒中含有羟甲香
豆素。
2.2 超声时间对总香豆素提取效果影响
超声时间对总香豆素提取效果影响如图 3 所
示，随着超声时间延长，总香豆素提取效率先增加后
减少，70min 时提取效率最高，原因可能是提取初期
细胞内外溶质具有浓度差，一段时间后，达到平衡，
再延长时间溶质易分解导致提取效率降低，故后续
实验选定提取时间为 70min。
194
图 1 羟甲香豆素薄层色谱图
Fig.1 Thin－layer chromatogram of hymecromone
图 2 羟甲香豆素色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of hymecromone
注:a.对照品，b.稻谷芒样品。
图 3 超声时间对稻谷芒活性成分提取效率的影响
Fig.3 Influence of extraction time on
extraction rate of orysan sativa
2.3 超声功率对总香豆素提取效果影响
超声功率对总香豆素提取效果影响结果如图 4，
随着超声功率的增加，总香豆素提取效率总体变化
不大，96W 时稍好，后续实验中固定超声功率
为 96W。
2.4 料液比对总香豆素提取效果影响
料液比对总香豆素提取效果影响结果如图 5，随
图 4 超声功率对稻谷芒活性成分提取效率的影响
Fig.4 Influence of ultrasonic power
on extraction rate of orysan sativa
着料液比的减小，总香豆素提取效率逐渐增加，原因
可能是增加的溶剂量，增大细胞内外的浓度差，促进
香豆素类成分溶出，在料液比为 1∶40 时，提取效率趋
于稳定，故 1∶40 为最优料液比。
图 5 料液比对稻谷芒活性成分提取效率的影响
Fig.5 Influence of solid－liquid ratio
on extraction rate of orysan sativa
2.5 超声温度对总香豆素提取效果影响
超声温度对总香豆素提取效果影响结果如图 6，
随超声温度的升高总香豆素提取效果逐渐增加，主
要原因是温度升高加速分子运动，促进有效物质溶
出。但 70℃以上温度可能会使总香豆素不太稳定，
故后续单因素实验选定 70℃的超声温度。
图 6 提取温度对稻谷芒活性成分提取效率的影响
Fig.6 Influence of temperature
on extraction rate of orysan sativa
2.6 乙醇浓度对总香豆素提取效果影响
乙醇浓度对总香豆素提取效果影响结果如图 7，
随着乙醇浓度升高，总香豆素提取效率先升高后降
低，35%乙醇浓度提取效率最高，原因可能是稻谷芒
中总香豆素极性较大，偏亲水性，故后续实验选择乙
195
醇浓度为 35%。
图 7 乙醇浓度对稻谷芒活性成分提取效率的影响
Fig.7 Influence of ethanol concentration
on extraction rate of orysan sativa
2.7 正交实验优化提取条件
根据单因素实验结果知，超声功率对整体提取
效果有一定影响，但不太明显。因此，固定超声功率
为 96W。对其余四个因素水平，采用正交实验 L9(3
4)
进一步优化其交互影响。正交实验设计与结果见表
2，方差分析见表 3。
表 2 正交设计及结果
Table 2 Design and experimental results of orthogonal test
实验号 A B C D 综合评分
1 1 1 1 1 91.45
2 1 2 2 2 99.48
3 1 3 3 3 96.75
4 2 1 2 3 98.32
5 2 2 3 1 98.12
6 2 3 1 2 95.57
7 3 1 3 2 92.14
8 3 2 1 3 87.05
9 3 3 2 1 92.53
K1 95.893 93.970 91.357 94.033
K2 97.337 94.883 96.777 95.730
K3 90.573 94.950 95.670 94.040
Ｒ 6.764 0.980 5.420 1.697
表 3 方差分析表
Table 3 Ｒesults of variance analysis
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 76.128 2 42.317 19.000 *
B 1.799 2 1.000 19.000
C 49.206 2 27.352 19.000 *
D 5.735 2 3.188 19.000
误差 1.80 2
注:F0. 1(2，2)= 9.00，F0. 05(2，2)= 19.00，F0. 01(2，2)= 99.00。
对正交实验结果进行极差分析，各因素对提取
效果影响主次顺序为 A ＞ C ＞ D ＞ B，最优水平为
A2B3C2D2。方差分析如表 3，四个影响因素中乙醇浓
度(A)和提取温度(C)影响显著(p ＜ 0.05) ，而料液
比(B)和超声时间(D)不显著。考虑到料液比的减
小会使浓缩成本增加，超声时间的延长会延长生产
周期，故采用 A2B1C2D1 工艺，即 55%乙醇浓度，1∶30
液料比，提取温度为 70℃，提取时间为 60min，提取功
率为 96W 为超声提取稻谷芒中总香豆素的最佳
工艺。
3 结论
本文通过 TLC、HPLC手段初步鉴定了稻谷芒和
稻糠中都含有羟甲香豆素成分，并通过单因素实验
和正交实验优化稻谷芒总香豆素提取工艺参数，即
55%乙醇浓度，1∶30 液料比，提取温度为 70℃，提取
时间为 60min，提取功率为 96W。在此工艺条件下，
提取 3 份稻谷芒和稻糠样品，进行含量测定，稻谷芒
和稻糠中总香豆素及羟甲香豆素的平均含量分别
为:2.33、0.57mg /g;1.95、0.44mg /g。并代到正交实验
数据中进行综合评分，稻谷芒中总香豆素的综合评
分为 91.97、99.52 和 93.88，与预测值接近。本研究为
稻谷芒和稻糠工业化生产提供实验依据，也为稻谷
芒和稻糠变废为宝指明了方向，研究具有较高应用
价值与经济价值。
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