全 文 ：第 34卷　第 2期 西 南 师 范 大 学 学 报(自然科学版) 2009年 4月
Vol.34　N o.2 　　Journal of Southwest China Normal University (Natural Science Edition) A pr. 2009
文章编号:1000-5471(2009)02-0071-04
不同海拔高度的野古草的遗传多样性分析①
谭玉莲 , 　刘迎辉 , 　熊丽娜 , 　朱　智 , 　徐　伟 , 　曾　波
西南大学 三峡库区生态环境教育部重点实验室 ,
西南大学 重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室 , 西南大学 生命科学学院 , 重庆 400715
摘要:采用 SRAP(sequence-rela ted amplified polymo rphism)标记对 3 个不同海拔的 15 个野古草材料进行遗传多样
性分析.49 个 S RAP 引物组合共扩增到 207 个谱带 、 115 个多态性带 , 多态性带的比例为 55.56%.每对引物组合
的谱带数和多态性带数分别为 4.22 个和 2.35 个.UPMGA 聚类分析结果表明:15 个野古草材料可分为 I , Ⅱ , Ⅲ ,
Ⅳ , V 5个类群 , Ⅱ类又可分为2 个亚群 , Ⅲ类可分为 3 个亚群;不同海拔下的3 个野古草种群的遗传多样性存在较
大差异;低海拔种群内的野古草存在较大的遗传分化 , 具有更丰富的遗传多样性.
关　键　词:野古草;海拔:遗传多样性
中图分类号:Q948.1 文献标识码:A
野古草(Arundinella anomala)是多年生禾本科野古草属植物[ 1] , 根系发达 , 耐瘠薄土壤 , 自然分布在
嘉陵江沿岸.在三峡库区是一种很好的护坡 、水土保持和固沙植物 , 可以用于荒山荒坡改造 、人工草地建
植.三峡工程建成后 , 冬季蓄水发电水位为 175 m , 夏季防洪水位降至 145 m[ 2] , 其间 30 m 水位落差暴露
出来的土地被称为“消落带” .因此要求在该区域生长的植物必须具有能够承受氧含量减少 , 光照减弱 , 水
压增大等环境巨变的能力 , 而且是能适应淹没与干旱两种条件下生存的多年生植物.实验证明[ 3] , 经 60 d
的水淹处理后 , 水下 2 m的野古草仍具有较高的光合生产能力 , 具有较高的水淹耐受性 , 可以考虑将其列
为三峡库区消落带生态重建的重要植被物种之一.
相关研究表明 , 不同海拔下的野古草在形态 、繁殖方式以及一些光合指标上都有一些明显差异[ 3-4] .但
是 , 野古草作为三峡库区消落带生态重建的重要植被物种之一 , 极其缺乏分子生物学研究背景.SRAP 标
记 , 相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism , SRAP)是一种新型的基于 PCR的分
子标记技术 , 该标记通过独特的引物设计对 ORFs(open reading f rames)进行扩增 , 上游引物长 17 bp , 5
端前 10个碱基为“填充”序列 , 接着为 CCGG 序列 , 它们组成核心序列 , 3 端为3个选择性碱基 , 对外显子
进行特异扩增.下游引物长 18 bp , 5 端前 11个碱基为“填充”序列 , 紧接着是 AA TT , 它们组成核心序列 ,
3 端 3个选择性碱基 , 对内含子区域 、启动子区域进行特异扩增.因不同物种 、不同个体的内含子 、启动子
与间隔区长度不等而产生多态性[ 5] .该标记具有简便 、稳定 、产率高 、易于测序 , 便于克隆目标片段的特
点 , 并已被应用于图谱构建 、比较基因组学和遗传多样性分析.本研究运用 SRAP 标记从 DNA 水平研究
不同海拔野古草的遗传分化 , 为选育性状优良广泛地栽培种植的植株提供理论依据.
1　材料与方法
1.1　材料来源
野古草是样地内的单优势种 , 此样地在夏季汛期期间多次被淹没.样地内沿江岸海拔高程带分 3段:
① 收稿日期:2007-12-20
基金项目:国家自然科学基金资助项目(304400335, 30500041 , 30770406);教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-06-0773);国
家科技支撑计划(2006BAC10B01);重庆市科技攻关项目(CSTC2007AB7049);中国科学院西部行动计划(KZCX2-XB2-07).
作者简介:谭玉莲(1985-), 女, 重庆忠县人 , 本科生 , 从事生态学研究.
通讯作者:曾　波.
DOI :10.13718/j.cnki.xsxb.2009.02.007
海拔 179 ～ 181 m 段 , 为高强度水淹;海拔 181 ～ 183 m 与 183 ～ 185 m 段 , 分别为中强度水淹和低强度水
淹.不同海拔下植物的水淹状况不同 , 海拔越低 , 水淹强度越大 , 水淹时间也就越长.因此 , 不同的海拔样
带代表了不同的水淹强度.从 3个海拔样带中分别选取 5个样点 , 为防止采到同一个无性系的不同分株 ,
每个样点平均相隔 3 ～ 5 m.2007年 1月 28日 , 从 15个样点(编号 1 ～ 15 , 其中 , 低海拔:1 ～ 5;中海拔:6
～ 10;高海拔:11 ～ 15)分别随机采取 1株生长状况良好的植株 , 立即放入冰盒中 , -20 ℃冰箱中保存.
1.2　野古草基因组 DNA的提取
选取植株幼嫩叶片采用 CTAB法[ 6] , 并作了相应修改:其步骤如下:(1)野古草幼嫩叶片(浅绿色)0.5
～ 1 g 液氮下研成粉末(随时加液氮), 转入 10 mL 离心管 , 加入 3 mL 预热(65 ℃)2%CTAB 提取液(2%
CTAB , 4%PV P , 2%-巯基乙醇)快速混匀.(2)65 ℃水浴 45 ～ 60 min , 中间震荡 2 次以后加入 1 mL 5M
KAc , 冰浴 20 min.(3)加入等体积(4 mL)氯仿∶异戊醇(24∶1 , V∶V), 震荡混匀 , 6 000 r/min , 离心 15
min , 20 ℃, 取上清夜.(4)将上清夜吸入另一支 10 mL 离心管 , 加入 2/3体积(2.5 mL)预冷(-20 ℃)的
异戊醇 , 颠倒数次 , 直到产生絮状 DNA沉淀.(5)用细玻璃钩挑出 DNA , 放入盛有 1 mL 75%乙醇的 1.5
mL 离心管清洗 , 倾出乙醇 , 再加入 75%乙醇的清洗(直到 DNA为白色), 再加入 100%乙醇清洗 1次 , 风
干.(6)加入 0.5 mL TE溶解.(7)10%的聚丙稀酰胺电泳 , 检测 DNA 浓度.(8)-20 ℃保存备用.
1.3　SRAP分析
根据 Li和 Q uri ro s(2001)设计 SRAP 引物 , 引物 3 端使用 3个不同的选择碱基 , 由上海英骏生物技术
公司合成 , 扩增体系和程序参考(Li和 Q uriro s2001)提供的方法.10 μL 的反应体系:10×Buf fe r 1 μL ,
MgCl2(25 mM)1.5μL , dN TP(2 mM)0.2 μL , 引物(30 ng)0.5μL , R引物(30 ng)0.5μL , 1 U Taq酶(5
U)0.2μL , DNA 2μL , 蒸馏水 5.1μL.94 ℃预变性 5 min;94 ℃45 s , 35 ℃45 s , 72 ℃1 min , 5个循环;
94 ℃45 s , 50 ℃45 s.72 ℃1 min , 35个循环;72 ℃10 min.扩增产物检测参照张军等的方法 , 稍做修
改:采用 10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶 , 5×TBE 缓冲液 , 400 w 恒功率电泳 1 h , 银染检测电泳结果.
表 1　研究采用的 SRAP引物名称及序列
正向引物 正向引物 反向引物
M E1　TGAGTCCAAACCGGAAA ME18　TAGGTCCAAACCGGCAC EM21 GACTGCGTACGAATTCCA
M E2　TGAGTCCAAACCGGAAC ME19　TAGGTCCAAACCGGCAG EM22　GACTGCGTACGAATTCCC
M E3　TAGGTCCAAACCGGAAG ME20　TAGGTCCAAACCGGCAT EM31　GACTGCGTACGAATTCTG
M E4　TAGGTCCAAACCGGAAT ME21　TAGGTCCAAACCGGCCA
M E5　TGAGTCCAAACCGGACA ME22　TAGGTCCAAACCGGCCC
M E6　TGAGTCCAAACCGGACG ME23　TAGGTCCAAACCGGCCG
M E7　TAGGTCCAAACCGGACC ME25　TAGGTCCAAACCGGCGA
M E8　TGAGTCCAAACCGGACT ME27　TAGGTCCAAACCGGCGG
M E9　TGAGTCCAAACCGGAGA ME28　TAGGTCCAAACCGGCGT
M E10　TAGGTCCAAACCGGAGC ME29　TAGGTCCAAACCGGCTA
M E11　TGAGTCCAAACCGGAGG ME32　TAGGTCCAAACCGGCTT
M E12　TGAGTCCAAACCGGAGT ME56　TAGGTCCAAACCGGTCT
M E14　TAGGTCCAAACCGGATC ME57　TAGGTCCAAACCGGTGA
M E15　TAGGTCCAAACCGGATG ME58　TAGGTCCAAACCGGTGC
M E16　TAGGTCCAAACCGGATT ME60　TAGGTCCAAACCGGTGT
M E17　TAGGTCCAAACCGGCAA
1.4　SRAP数据处理
对各材料各引物扩增情况做记录 , 有带记为 1 , 无带记为 0 , 采用 DPS 3.01软件应用类平均法(UPG-
MA)进行聚类分析 , 建立聚类图.
2　结果分析
2.1　野古草 SRAP标记多态性
49对 SRAP 引物(所用引物见表 1)对 l5个材料进行扩增 , 共扩增到 207个谱带 、 115 个多态性带(图
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1);多态性带的比例为 55.56%.每对引物组合的谱带数和多态性带数分别为 4.22个和 2.35个.
M 为标准分子量 DNA , 1～ 15为供试材料编号
图 1　引物 Me07-Em22 、Me09-Em22 、Me10-Em22扩增的 SRA P图谱
图 2　15株野古草的 SRAP 标记聚类图
2.2　遗传距离及聚类分析
从图 2可看出 , 在遗传距离约为 0.67的位置 , 可以
将 15个野古草材料划分为 5个类群:属于第 Ⅰ类群的只
有低海拔种群的 1 号材料;第 Ⅱ类群包括 6 , 9 , 10 , 8 , 12
等 5份材料 , 其中 6 ,9 , 10 , 8均选自中海拔种群;第Ⅲ类
群包括 4 ,7 , 14 ,5 ,11 , 13 ,15等 7份材料 , 其中 14 ,11 ,13 ,
15均选自高海拔种群;低海拔种群的 2 , 3号材料分别被
划分为第Ⅳ类群和第Ⅴ类群.在遗传距离约为 0.63 的位
置 , 第Ⅱ类群可被划分为 2个亚群 , 第 1亚群包括 6 , 9
和 10号 3 份中海拔种群的材料 , 第 2 亚群包括 8和 12
号;第Ⅲ类群也可被划分为 3 个亚群 , 第 1 亚群包括 7 ,
14和 5号 , 第 2亚群只有 11号材料 , 第3亚群包括13和
15号 2份高海拔种群的材料.
3　讨　　论
不同海拔种群间的遗传多样性:不同野古草样本 SRAP 标记聚类分析结果与海拔分布基本一致 , 样带
的6 ,9 ,10 ,8四个样点的野古草 , 第三类中包括了高海拔种群的14 ,11 ,13 , 15四个样点的野古草 , 而低海拔
种群各个样点植株虽没有聚类 , 但也与中 、高海拔种群的植株存在较大差异 , 这主要是因为种群间基因交
流较少所致[ 7] .
同一海拔种群内的遗传多样性:低海拔种群的 5个样点中 , 只有 4和 5两样点的植株可以聚类 , 1 ,2 ,3
三样点的植株分开各成一群 , 说明低海拔种群内的野古草存在较大的遗传分化 , 具有更丰富的遗传多样
性.原因可能是低海拔植株被水淹的频率及强度都比中 , 高海拔大.已有研究表明 , 在一定的水淹范围内 ,
随水淹强度增加 , 野古草无性生殖在适度的水淹后呈加强的趋势 , 而有性生殖呈减弱趋势[ 3] .一方面 , 由
于生长季节经常性水淹使植物器官重建频繁发生 , 用于生殖的物质减少 , 使生殖分配在水淹逆境下具较强
的可塑性[ 8-9] , 消耗物质更少的无性生殖增强 , 使个体更加适应其生存环境;另一方面 , 由于汛期主要是在
夏秋季 , 也是野古草有性生殖的开花和结实期.然而 , 野古草即使开花了 , 在水淹条件下也不能传粉;或能
形成种子 , 也是无效种子.这样也会导致低海拔的野古草有性繁殖的几率下降 , 种群内植株的基因交流严
重降低 , 从而产生较大的种群内遗传分化和较丰富的遗传多样性.种内遗传多样性或变异越丰富 , 物种对
环境变化的适应能力就越强 , 其进化的潜力就越大 [ 10] .而且最大限度地维持种内遗传多样性水平 , 是持续
利用遗传资源的前提和基础[ 11] .低海拔种群内含有本物种丰富的遗传资源 , 为选育稳定高产的标准化种植
品种提供了丰富的育种材料.因此在物种资源的保护和利用方面 , 应该对其加以重视.另外 , 丰富的遗传
73第 2期　　　　　　　　　谭玉莲 , 等:不同海拔高度的野古草的遗传多样性分析
多样性也是对恶劣环境的一种适应 , 进一步说明野古草能成为三峡库区消落带生态重建的重要植被物种.
本研究从分子水平上说明了野古草的遗传分化不仅是发生在种群间也出现在种群内.
致谢:本论文涉及的实验得到了西南大学农业与生物科技学院农业部生物技术与作物品质改良重点实
验室的帮助 , 论文写作中还得到了张正圣老师给予的大力支持和指导 , 在此一并深表感谢.
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Genetic Diversity of Arundinel la Anomala at Different Altitudes
TAN Yu-lian , 　LIU Ying-hui , 　XIONG Li-na ,
ZH U　Zhi , 　XU 　Wei , 　ZENG 　Bo
Key Laboratory of Eco-Environment in Three Gorges Reservoir Region(MOE), Southwest University;
ChongqingKey Laboratory of Plant Ecology and Resources Research in Three Gorges Reservoir Region ,
Southwest University;School of Life Science , Southwest University , Chongqing 400715
Abstract:SRAP (sequence-related amplified polymorphism)was used to detect DNA po lymorphisms a-
mong the 15 Arundinella anomala plants at three dif ferent alt itudes.49 SRAP primer combinations to tally
produced 207 ampli fled f ragments , among which 115(55.56%)were polymorphic , w ith an average of 4.
22 po lymo rphic bands and 2.35 bands per primer combination.T he dendrog ram generated by UPMGA
show ed that 15 plants were divided into f ive g roups.Meanwhile , g roup Ⅱ could fur ther be divided into
tw o subg roups and g roup Ⅲ could be divided into three subg roups.There w ere obvious dif ferences among
the Arundinel la anomala populations at three dif fe rent al titudes;there w as much mo re obvious genet ic di-
ve rsity in the population at low al titude.
Key words:Arundinella anomala;alt itude;genetic diversi ty
责任编辑　陈绍兰　　　　
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