全 文 ：浙 江 农 林 大 学 学 报， 2013， 30（6）： 844 - 851
Journal of Zhejiang A＆ F University
西洋杜鹃 SRAP体系优化及遗传多样性分析
吴月燕1， 陶巧静 1，2， 李 波 1，2， 许丹叶1
（1． 浙江万里学院 生物与环境学院， 浙江 宁波 315100； 2． 浙江大学 农业与生物技术学院， 浙江 杭州
310058）
摘要： 以西洋杜鹃 Rhododendron hybridum 功能叶片为试验材料， 采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取
西洋杜鹃基因组 DNA， 并且运用 L16（44）正交试验设计， 在 4个水平上对影响西洋杜鹃相关序列扩增多态性（SRAP）反
应的镁离子（Mg2+）浓度、 Taq 酶用量、 三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度、 引物浓度等 4 个因素进行了优化， 确
立了一套适用于西洋杜鹃的稳定可靠、 重复性强的 SRAP-PCR 反应体系。 实验发现， 其最佳反应体系（20.0 μL）为：
Mg2+浓度 1.750 mmol·L－1， dNTPs浓度 0.175 mmol·L－1， Taq酶 1.500 × 16.67 nkat， 引物 0.200 μmol·L－1。 利用该优化体
系对 24 个西洋杜鹃花品种进行遗传多样性分析。 从 88 对 SRAP 引物中筛选出 10 对扩增清晰且多态性高的引物，
共扩增出 217 条带， 其中多态性条带 212 条， 多态性比率达 97.35%。 24 个杜鹃品种的遗传相似系数变化范围为
0.591~0.708， 算术平均数的非加权配对算术平均法 （UPGMA ）聚类分析结果显示： 在相似系数为 0.590 处将 24 个
供试品种分为 2个类群， 在相似系数为 0.623处又可分为 2个亚群， 说明该优化体系可应用于西洋杜鹃花品种鉴定
及遗传多样性的研究。 图 3表 6参 19
关键词： 植物学； 西洋杜鹃； 遗传多样性； SRAP-PCR； 正交设计； 体系优化； 聚类分析
中图分类号： Q946； S685.21 文献标志码： A 文章编号： 2095-0756（2013）06-0844-08
An optimal SRAP-PCR system of Rhododendron hybridum and its genetic
diversity analysis with SRAP marker
WU Yueyan1， TAO Qiaojing1，2， LI Bo1，2， XU Danye1
（1. College of Biology and Environment， Zhejiang Wanli University， Ningbo 315100， Zhejiang， China； 2. College
of Agriculture and Biotechnology， Zhejiang University， Hangzhou 310058， Zhejiang， China）
Abstract： In order to find the optimal sequence-related amplified polymorphism （SRAP）-PCR system of
Rhododendron hybridum and analyse its genetic diversity， the functional leaves of Rhododendron hybridum
were used to extract its genome DNA， using an improved cetyl trimethyl ammonium bromide （ CTAB）
method. Concentrations of Mg2+， Taq polymerase， dNTPs and primer, which maybe affect the SRAP-PCR re-
actions， were optimized by L16（44）orthogonal design experiments to establish the SRAP molecular marker sys-
tem in Rhododendron hybridum. Then， an optimal, stable and repeatable SRAP-polymerase chain reaction
（PCR） of 20.0 μL containing 1.750 mmol·L－1 Mg2+， 0.175 mmol·L－1 dNTPs， 1.500 × 16.67 nkat Taq poly-
merase， and 0.200 μmol·L －1 primer was established. Finally， genetic diversity and relationships of 24
Rhododendron hybridum cultivars were analyzed using an Unweighted Pair Group Method with Arithmetic
Mean （UPGMA） cluster analysis with this optimized system. Results revealed 10 highly polymorphic and sta-
ble primer pairs selected from 88 pairs of SRAP primers with a total of 217 bands being detected from these 10
primer pairs. Of the detected bands， 212 were polymorphic （a 97.35% average） having a genetic similarity
coefficient ranging from 0.591 to 0.708. The cluster analysis divided the 24 cultivars into two groups at a 0.590
similarity level， and these were further delineated into two sub-groups at a 0.623 similarity level. These results
收稿日期： 2012-11-14； 修回日期： 2013-05-22
基金项目： 浙江省重大科技专项重点农业项目（2009C12092）； 宁波市科技创新创业重点项目（2010C92021）
作者简介： 吴月燕， 教授， 从事园艺植物生理生化与遗传育种研究。 E-mail： wyy2000@zwu.edu.cn
第 30 卷第 6 期 吴月燕等： 西洋杜鹃 SRAP 体系优化及遗传多样性分析
demonstrated that this optimized SRAP-PCR system can be applied to cultivars identification and genetic di-
versity research on Rhododendron hybridum. ［Ch， 3 fig. 6 tab. 19 ref.］
Key words： botany； Rhododendron hybridum； genetic diversity； SRAP-PCR； orthogonal design； system
optimization； cluster analysis
西洋杜鹃 Rhododendron hybridum 简称西鹃， 别称比利时杜鹃 ， 是由皋月杜鹃 Rhododendron in-
dicum， 映山红 Rhododendron simsii及毛白杜鹃 Rhododendron mucronatum等反复杂交选育而成的杂交种［1］，
具有株型矮小， 树冠紧密， 花色丰富等特点， 在中国大都为盆栽［2］。 由于西洋杜鹃来自种间杂交， 类型
多， 形态特征丰富多样， 不同生境（居群）间变异相差较大， 品种之间的鉴别有一定困难， 如果仅仅依据
形态特征分类会引起很大争议， 会引起分类类群变更频繁 ［3］。 目前， 国内外主要对西洋杜鹃的化学活性
成分、 形态、 观赏、 种植、 栽培管理等方面进行了研究， 国外在分子水平方面的研究多见于分子连锁图
的构建、 不同环境的群居分析以及耐寒基因研究和转基因研究 ［4－5］， 而国内则较少。 相关序列扩增多态
性分子标记（sequence-related amplified polymorphism， SRAP）是由美国加州大学蔬菜作物系 Li 等 ［6 ］在
2001年首次正式提出的一种基于聚合酶链反应（PCR）的新型分子标记技术。 该标记具有多态性高， 信息
量丰富， 操作简便， 重复性好和成本低等特点。 SRAP 分子标记系统最早在芸薹属 Brassica 作物开发出
来［6］， 目前已在水稻 Oryza sativa， 番茄 Solanum lycopersicum， 棉花 Gossypium spp.， 黄瓜 Cucumis sativus
和柿属 Diospyros等多种植物中成功扩增［7－9］， 并应用于遗传图谱构建、 比较基因组学、 遗传多样性分析［10－12］。
SRAP 标记扩增结果易受镁离子（Mg2+）浓度、 三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度、 Taq 酶用量、 引物浓
度和模板 DNA 浓度等因子的影响， 且不同物种的反应体系也不相同。 本研究利用正交试验设计， 对西
洋杜鹃 SRAP 反应体系中的 Mg2+浓度、 引物浓度、 Taq 酶用量以及 dNTPs 浓度等主要影响因素进行了优
化分析， 建立了适合于西洋杜鹃的 SRAP-PCR 最佳反应体系， 并利用筛选的引物对 24 个西洋杜鹃品种
进行了遗传多样性分析， 从分子水平上探讨这些品种的遗传多样性， 对西洋杜鹃种质资源的鉴定、 利用
及其育种实践等具有一定的参考价值， 以期为西洋杜鹃品种的分子鉴定及连锁遗传图谱构建奠定基础，
为育种开发提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料及试剂
以‘霸王红’‘紫金冠’‘白佳人’等 24 个西洋杜鹃品种为试验材料（表 1）， 材料来源于浙江省宁波市
北仑区柴桥镇杜鹃花基地 ， 生长年龄均为 2 a。 用于 SRAP-PCR 反应的 Mg2+， Taq 酶 ， dNTPs 和
DL5000， DNA Marker均购于上海生工生物工程有限公司， 引物委托上海生工合成。
编号 品种名称 编号
1 ‘霸王红’ 7
2 ‘紫金冠’ 8
3 ‘绿牡丹’ 9
4 ‘鲜红宝石’ 10
5 ‘荷兰粉皇后’ 11
品种名称
‘荒狮子’
‘五宝绿珠’
‘粉天惠’
‘双花红’
‘西德一号’
编号 品种名称 编号 品种名称
13 ‘玉女’ 19 ‘银边牡丹’
14 ‘十二乙皇’ 20 ‘汶堡 1号’
15 ‘昔兰’ 21 ‘星光’
16 ‘白佳人’ 22 ‘四海菠’
17 ‘美人笑’ 23 ‘肯特’
6 ‘红双喜’ 12 ‘玉翠锦’ 18 ‘丹麦红’ 24 ‘杨梅红’
表 1 供试西洋杜鹃材料
Table 1 Tested materials of Rhododendron hybridum
1.2 试验方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取及检验 取各西洋杜鹃品种枝条上端的较幼嫩叶片， 采用改良的十六烷基三
甲基溴化铵（CTAB）法 ［13］提取其基因组 DNA。 10.0 g·L－1琼脂糖凝胶电泳（1×TBE）检测 DNA 提取质量，
紫外分光光度计检测其浓度和纯度， 并稀释到 50 mg·L－1， －20 ℃保存备用。
1.2.2 SRAP-PCR反应体系的优化 为了确定 PCR 反应中 4 个主要因素（Mg2+， dNTPs， Taq 酶和引物）
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的最佳水平， 以 2 年生的盆景西洋杜鹃花 ‘美人笑’ 为材料， me5 和 em7 为引物组合， 采用正交设计
L16（44）进行试验［14］， 选择 4 个因素， 浓度水平为 4 个·因素－1（表 2）， 共 16 个处理组合（表 3）。 试验设 3
次重复， 总反应体系为 20.0 μL， 其中模板 DNA 量为 1.5 μL， 10×PCR 缓冲液（不含 Mg2+）2.0 μL， 不足
部分用双蒸水补齐。 反应程序 ［6］为： 94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性 1 min， 37 ℃复性 1 min， 72 ℃延伸
1 min， 5 个循环； 94 ℃变性 1 min， 57 ℃复性 1 min， 72 ℃延伸 1 min， 35 个循环； 最后 72 ℃延
伸 10 min。 PCR产物使用 10.0 g·L－1琼脂糖凝胶电泳检测。
水平 Mg2+/（mmol·L－1） dNTPs/（mmol·L－1） Taq 酶/（×16.67 nkat） 引物/（μmol·L－1）
1 1.50 0.150 1.00 0.20
2 1.75 0.175 1.50 0.30
3 2.00 0.200 2.00 0.40
4 2.25 0.225 2.50 0.50
表 2 PCR反应的各因素水平
Table 2 Levels of parameters for PCR reaction
处理 Mg2+/（mmol·L－1） dNTPs/（mmol·L－1） Taq 酶/ （×16.67 nkat） 引物/（μmol·L－1） 清晰条带数（3次平均）
1 1.50 0.150 1.00 0.20 5
2 1.50 0.175 1.50 0.30 6
3 1.50 0.200 2.00 0.40 5
4 1.50 0.225 2.50 0.50 4
5 1.75 0.150 1.50 0.40 6
6 1.75 0.175 1.00 0.50 5
7 1.75 0.200 2.50 0.20 8
8 1.75 0.225 2.00 0.30 5
9 2.00 0.150 2.00 0.50 5
10 2.00 0.175 2.50 0.40 6
11 2.00 0.200 1.00 0.30 2
12 2.00 0.225 1.50 0.20 6
13 2.25 0.150 2.50 0.30 3
14 2.25 0.175 2.00 0.20 3
15 2.25 0.200 1.50 0.50 4
16 2.25 0.225 1.00 0.40 2
表 3 SRAP-PCR正交实验设计及结果统计
Table 3 Orthogonal design and results statistic of SRAP-PCR
1.2.3 SRAP 多态性引物筛选 选择形态差异明显， 具有代表性且 SRAP 结果好的 3 个西洋杜鹃品种
（‘霸王红’‘紫金冠’‘白佳人’）提取的 DNA 为模板， 对 SRAP 引物组合进行筛选， 从中选出带型清晰、
重复性高、 多态性较好的引物。
1.2.4 SRAP 数据处理与统计 对供试的 24 份材料扩增的电泳谱带总数和多态性带的数目进行统计，
将 SRAP扩增产物每个条带视为 1 个位点， 具有相同迁移率的条带视为同一条带。 胶上相同迁移率的条
带均来自同一位点上的同一等位基因， 用数字 1 和 0 分别表示供试材料某一等位基因的有无， 即根据
各多态性引物扩增条带的有无分别赋值， 有记为 1， 无记为 0， 建立 “1-0”数据库。 利用 NTsys 2.1 软件
进行 Jaccard（J）遗传相似性系数分析。 在此基础上， 利用非加权配对算术平均法（unweight pairgroup
method using arithmetic averages， UPGMA）建立所有供试品种的聚类树状图［15］。
2 结果与分析
2.1 SRAP-PCR反应体系优化结果
根据正交设计表进行 SRAP-PCR反应， 所得 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳， 电泳结果如图 1， 记录
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第 30 卷第 6 期
清晰条带数（表 3）。
图 1 西洋杜鹃 SRAP-PCR正交试验结果
Figure 1 Result of Rhododendron hybridum SRAP-PCR by orthogonal design
1~16为 16个处理组合， 重复 3次·处理-1， M为标记物， 引物组合 me5-em7
bp
2.1.1 正交试验结果直观分析 对正交试验结果进行直观分析， 由图 1 显示， 16 个处理均可以扩增出
条带来， 但是不同的组合， 由于各因素的浓度不同， 各处理间存在着较明显的差异。 处理 11， 处理 13，
处理 14， 处理 16 扩增效果较差， 扩增出的条带数较少， 通过比较发现， 这 4 个处理中 Mg2+浓度均较
高， 说明 Mg2+浓度不宜过高。 处理 2， 处理 3， 处理 7， 处理 8， 处理 10， 处理 12 扩增效果较好， 以处
理 7 为最好， 扩增条带最多， 亮度最高， 且条带清晰， 因此初步确定处理 7 为西洋杜鹃 SRAP-PCR 较佳
的反应体系。
2.1.2 正交试验结果统计分析 对各组浓度搭配的正交试验结果进行了直观统计分析（表4）。 T 值代表
为某因素在某水平下的得分之和； K 值代表某因素在某水平下的得分平均值， 而 R 值为该因素的极差，
即该因素在不同水平下得分的最大、 最小平均值之差。 R 值越大， 说明该因素对实验结果影响越大， 即
该因素的作用就越大。 由表 4 知： 4 个因素对试验的影响程度大小依次为 Taq 酶用量＞Mg2+浓度＞引物
浓度＞dNTPs 浓度。 K 值反映了因素各水平对反应体系的影响情况， K 值越大， 反应水平就越好。 从表
看出， Mg2+ 浓度、 dNTP浓度及 Taq 酶均以水平 2 最好， 引物浓度以水平 1 最好， 即 Mg2+1.75 mmol·L－1，
dNTPs 0.175 mmol·L－1， Taq酶为 1.50 × 16.67 nkat ， 引物 0.20 μmol·L－1的组合为最好， 且 10×缓冲液的
定值量为 2.0 μL， 基因组 DNA 定值为 1.5 μL， 双蒸水补足至 20.0 μL， 将此组合作为西洋杜鹃 SRAP-
PCR反应的最佳体系。
项目 Mg2+ dNTPs Taq酶 引物
T1 22 18 14 21
T2 22 20 25 18
T3 17 17 17 17
T4 12 18 17 17
K1 5.50 4.50 3.50 5.25
K2 5.50 5.00 6.25 4.50
K3 4.25 4.25 4.25 4.25
K4 3.00 4.50 4.25 4.25
R（极差） 2.50 0.75 2.75 1.00
表 4 正交试验结果分析
Table 4 Analysis of orthogonal experiment results
2.2 SRAP多态性分析
从 88 对 SRAP 引物（表 5）中共筛选出 10 对多态性好、 条带清晰的引物（me3-em8， me4-em2， me4-
em4， me5-em7， me5-em10， me6-em1， me6-em7， me7-em1， me8-em5 和 me8-em7）。 将筛选到的 10 条
引物用于 SRAP-PCR 反应， 图 2 为 me7-em1 引物组合对 24 个西洋杜鹃品种的扩增结果。 经统计分析可
知， 10 条引物共扩增出 217 条带， 其中多态性条带 212 条， 平均多态性位点百分率为 97.35%（表 6）。
单条引物之间的扩增结果存在一定的差异， 最少 14 条， 最多有 25 条， 平均带数为 21.2 条。 引物扩增
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长度为 500~5 000 bp， 其中以 750~3 000 bp 居多。 可见， SRAP 在杜鹃种植资源里的多态性位点较多，
也表明杜鹃的遗传多样性较为丰富。
引物名称 引物序列 5′→3′ 引物名称 引物序列 5′→3′
me1 TGAGTCCAAACCGGATA em1 GACTGCGTACGAATTAAT
me2 TGAGTCCAAACCGGAGC em2 GACTGCGTACGAATTTGC
me3 TGAGTCCAAACCGGAAT em3 GACTGCGTACGAATTGAC
me4 TGAGTCCAAACCGGACC em4 GACTGCGTACGAATTTGA
me5 TGAGTCCAAACCGGAAG em5 GACTGCGTACGAATTAAC
me6 TGAGTCCAAACCGGTAA em6 GACTGCGTACGAATTGCA
me7 TGAGTCCAAACCGGTCC em7 GACTGCGTACGAATTCAA
me8 TGAGTCCAAACCGGTGC em8 GACTGCGTACGAATTCTG
em9 GACTGCGTACGAATTCGA
em10 GACTGCGTACGAATTCAG
em11 GACTGCGTACGAATTCCA
表 5 SRAP引物序列
Table 5 Primer sequences used for SRAP analysis
引物组合 扩增总带数 多态性条带数 多态性位点百分率/%
me3-em8 20 19 95.00
me4-em2 25 24 96.00
me4-em4 14 13 92.86
me5-em7 22 22 100.00
me5-em10 23 23 100.00
me6-em1 24 24 100.00
me6-em7 25 25 100.00
me7-em1 25 25 100.00
me8-em5 18 17 94.44
me8-em7 21 20 95.24
总计 217 212 97.69
平均 21.7 21.2 97.35
表 6 10对 SRAP引物组合及其扩增结果
Table 6 10 SRAP primer combinations and the results of amplification
说明： 统计方法见试验方法 1.2.4 SRAP 数据处理与统计。
图 2 引物组合 me7-em1 对 24 个西洋杜鹃品种的 SRAP扩增结果
Figure 2 Result of SRAP-PCR for 24 Rhododendron hybridum varieties using primer combination me7-em1
1~24 为 24 个西洋杜鹃花品种， M为标记物
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2.3 西洋杜鹃遗传相似性及聚类分析
根据 PCR 产物电泳结果， 记录扩增位点建立数据矩阵， 利用 NTsys 2.10e 软件计算 24 个品种间的
遗传相似性指数。 24个杜鹃品种的遗传相似系数变化范围为 0.591~0.708。 在这些杜鹃品种中，‘绿牡丹’
和‘美人笑’的遗传相似系数最小， 为 0.182，‘紫金冠’和‘粉天惠’以及‘荷兰粉皇后’和‘杨梅红’的遗传相
似系数最大， 达到 0.783 和 0.782， 大多数品种的相似系数为 0.590~0.800。 遗传相似系数越大， 表示亲
缘关系越近， 相似系数小说明种质间遗传变异较大， 多态性较高。
基于遗传相似系数， 利用 UPGMA方法对 24份供试材料进行聚类分析（图 3）。 聚类结果显示， 在相
似系数为 0.590处将 24个供试品种分为 2个类群， 第 1类包含 2个品种， 在相似系数为 0.623 处又可分
为 2个亚群， 第 1亚群包括 ‘霸王红’‘汶堡一号’‘星光’‘四海菠’‘肯特’‘丹麦红’‘紫金冠’‘粉天惠’‘玉
女’‘荒狮子’‘五宝绿珠’‘玉翠锦’‘西德 1号’， 第 2亚群包括鲜‘红宝石’‘红双喜’‘十二乙皇’‘荷兰粉皇
后’‘杨梅红’‘昔兰’‘白佳人’‘双花红’和‘银边牡丹’。 该聚类分析表明， 不同西洋杜鹃品种间遗传差异
明显， 这可能与西洋杜鹃是由皋月杜鹃、 映山红及毛白杜鹃等反复杂交选育而成的杂交种从而导致其遗
传背景复杂有关。 不同类群内的品种表明它们具有相同的最原始的杂交亲本， 且由于后面亲本及杂交次
数不同又逐次形成了不同的品种， 这可由聚类图中明显看出。 同时， 由于西洋杜鹃遗传复杂导致命名混
乱， 常会出现重名现象。 结果中‘汶堡一号’和‘星光’2 个品种不能区分开， 其有可能是同种异名， 但需
要进一步验证。
图 3 基于 SRAP-PCR的 24个西洋杜鹃品种的聚类树
Figure 3 Cluster analysis of 24 Rhododendron hybridum cultivars based on SRAP-PCR
相似系数
3 结论与讨论
作为新发展起来的一种遗传标记形式， SRAP 分子标记技术， 将扩增片段长度多态性（amplified
fragment length polymorphism， AFLP）和随机扩增多态性 DNA 标记 （random ampli fied polymorphic DNA，
RAPD）两者的优点有机结合在一起， 高频率共显性明显优于 AFLP， 且比 AFLP， RAPD 和简单重复序列
（simple sequence repeat， SSR）等方法更能反映出表型的多样性及进化历史 ［16－17］。 同时 SRAP 技术弥补了
常用分子标记技术的一些不足， 如 RAPD 技术稳定性和重复性差； AFLP 成本较高、 操作复杂； SSR 检
测位点少， 成本高， 因此， SRAP标记技术是目前一种较理想的分子标记技术， 具有广泛的前景。
本实验所采用 SRAP标记进行正交设计试验不但可以弥补其他标记技术的不足之处， 也避免了进行
单因素试验获得的信息量少和完全组合设计工作量大的缺点， 此方法完全可用于 SRAP-PCR 反应体系的
优选和建立， 但此方法具有局限性， 即科研工作者目前一般是根据电泳条带的数量和清晰度来判断试验
结果的优劣， 因此这种判断带有一定的主观性。
有关 SRAP反应体系和程序的优化在很多植物中均有报道， 但是不同的植物， 所用的试验方法以及
所需的扩增条件也不一样， 会影响 SRAP 的图谱。 该试验采用了 L16（44）正交设计， 共对 16 个反应组合
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进行了扩增， 考察了 4种组分 4种浓度的综合影响， 通过统计分析和检测验证， 迅速筛选出稳定、 重复
性好的 SRAP 反应体系， 且该体系可以很好地用于种间聚类分析， 适用于西洋杜鹃的遗传多样性分析。
且得知在本试验中 Taq酶对 PCR反应的影响最大， dNTPs 影响最小。 这与袁菊红等［18］对石蒜 Lycoris ra-
diata SRAP 反应的影响为 Mg2+最明显， dNTPs 最不明显的研究结果有所不同， 表明不同植物间的 SRAP-
PCR反应体系存在明显差异 。 同苏家乐等 ［19 ］报道的20.0 μL杜鹃花属 SRAP反应体系相比较， 本体系
dNTPs 和引物浓度等都有所减少， 大大降低了试验成本， 因此， 本研究优化的 20.0 μL 反应体系更为经
济高效， 可广泛应用于西洋杜鹃的 SRAP-PCR反应。
本研究应用 SRAP 分子标记技术对 24 个西洋杜鹃品种的遗传多样性进行研究， 10 对引物扩增出
217条清晰的用于多样性分析的谱带， 其中多态性条带就有 212条， 多态性比率为 97.35%。 这一方面说
明了西洋杜鹃不同品种间存在着丰富的遗传变异， 为西洋杜鹃优良品系选育、 开发和利用提供了空间；
同时也说明了 SRAP分子标记技术在西洋杜鹃遗传多样性研究中有较高的检出效率， 这对西洋杜鹃品种
的鉴定、 利用及其育种实践等具有一定的参考价值。 总之， 本试验为今后利用 SRAP 标记对西洋杜鹃花
品种的分子鉴别、 多样性研究等奠定了良好的基础。
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