全 文 ：大叶桉不同溶剂提取物的抑菌活性研究＊
吕东元 周玉成 张晶晶 李志强 刘 翔 刘 刚 赵 俊 吴虹丽 马 林(通讯作者)
(西南科技大学生命科学与工程学院 ,四川 , 绵阳 , 621010)
【摘要】 为探讨大叶桉不同溶剂提取物的抑菌作用 ,以大叶桉叶片为材料 ,采用琼脂平板打孔法对叶片不同溶剂提取物
进行了抑菌活性研究。结果表明 ,大叶桉不同溶剂提取物对供试细菌(金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌 、枯草芽孢杆菌)和真菌(绿
色木霉菌 、青霉菌)均具有不同程度的抑制效果 ,其中甲醇和 95%乙醇提取物的抑菌作用相对明显。
【关键词】 大叶桉;提取物;抑菌活性
【中图分类号】 R282.5 【文献标识码】 A 【文章编号】 1007-8517(2009)16-0001-01
AntimicrobialactivityofdifferentsolventextractsfromEucalyptusrobustaleaf
Lǜ Dongyuan, ZhouYucheng, ZhangJingjing, LiZhiqiang, LiuXiang, LiuGang, ZhaoJun, WuHongli, MaLin
(SchoolofLifeScienceandEngineering, SouthwestUniversityofScienceandtechnology, Mianyang, 621010)
【Abstract】　AntimicrobialactivitiesofEucalyptusrobustaSmithleavesextractwithsixorganicsolventsagainstthreebacteria
(Staphylococcusaureus, EscherichiacoliandBacilussubtilis)andtwofungi(TrichodermavirideandPenicilium)wasstudiedbyagar
-weldifusionmethod.Theresultsindicatedthatalsixextractsshowedsomeinhibitoryefectagainsttestedbacteriaandfungi, andthe
methanolaswelas95% ethanolcrudeextractshadhigherinhibitoryactivitythanothersolventsextracts.
【Keywords】　EucalyptusrobustaSmith;leafextracts;antimicrobialactivity
桉树是桃金娘科桉属植物的总称 , 主要分布于澳大利亚
等国家。桉树叶可提取桉叶油 ,是医药 、香料和化学工业的重
要原料 , 具有很高的药用价值 [ 1] 。国内外对桉叶油的抑菌作
用研究较多。 Ramezani等发现柠檬桉油有具有广谱抗真菌活
性 [ 2] , Oyedeji等报道了 5种桉叶油的抑菌活性 [ 3] , Sartorelli
等分析了两种桉树的精油成分并研究了其抑菌活性 [ 4] 。国
内对蓝桉油 、小叶桉油 、柠檬桉油等的抗菌活性均有一定研
究 [ 5, 6] 。除桉叶油外 , 施爱群等报道了南特桉煎剂的体外抑
菌作用 , 发现具有广谱抗菌作用 , 能抑制多种耐药菌株的生
长 [ 7] 。本文报道大叶桉叶片 6种溶剂提取物对绿色木霉 、大
肠杆菌 、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌实验结果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料及来源 大叶桉(EucalyptusrobustaSmith)
采自西南科技大学校园 ,经绵阳师范学院罗明华教授鉴定为
大叶桉 , 取叶片为供试材料。
1.1.2 供试菌种 绿色木霉 (Trichodermaviride)、青霉
(Penicillium)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌
(Staphyloccocusaureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis), 由
西南科技大学生物科学实验中心微生物实验室提供。
1.1.3 培养基 ①马铃薯 -葡萄糖琼脂培养基(PDA, 真菌
用培养基):200g马铃薯浸出液 , 20g葡萄糖 , 20g琼脂 , 水
1000ml,调至 pH至 7.2 ～ 7.5。 ②牛肉膏 -蛋白胨培养基(细
菌用培养基):牛肉膏 3g, 蛋白胨 10g, NaCl5g, 琼脂 20g, 水
1000ml,调至 pH至 7.4 ～ 7.6。
1.1.4 试剂 盐酸特比萘芬凝胶(太极集团绵阳制药有限
公司);注射用硫酸链霉素(华北制药股份有限公司);甲醇 、
95%乙醇 、无水乙醇 、乙酸乙酯 、丙酮 、石油醚 、二甲基亚砜均
为分析纯。
1.1.5 主要仪器 超净工作台(SW-CJ-1F型)、电子天平
(FA1104)、恒温培养箱(KXE-13A)、立式自动电热压力蒸汽
灭菌锅(LDZX-40Ⅱ)、旋转蒸发仪(SENCOR-201)。
1.2 试验方法
1.2.1 材料处理与供试药液制备 取大叶桉新鲜叶片 , 洗
去叶面杂物 , 待自然风干后用植物粉碎机粉碎。称取叶片粉
末 50g共 6份 , 分别用甲醇 、95%乙醇 、无水乙醇 、乙酸乙酯 、
丙酮 、石油醚冷浸 4d, 然后置于超声波清洗器中进行超声提
取 20min(30℃, 150W), 然后继续冷浸 48h。真空抽滤得提取
液。用旋转蒸发仪减压浓缩干燥 , 所得浸膏用二甲基亚砜溶
解 ,配制成质量浓度为 50mg/ml的药液备用。盐酸特比萘芬
凝胶用二甲基亚砜溶解成质量浓度为 10mg/ml作为真菌抑
菌活性测试的阳性对照。注射用硫酸链霉素用二甲基亚砜溶
解 ,质量浓度为 2mg/ml,作为细菌抑菌活性测试的阳性对照。
真菌及细菌抑菌活性测试均以二甲基亚砜作阴性对照。
1.2.2 菌悬液制备 在无菌条件下 , 用接种环刮取菌种转
入无菌水中 , 振摇均匀制成菌悬液备用。
1.2.3 抑菌活性测试 ①真菌:采用琼脂打孔扩散法测定
提取液的抑菌圈直径 [ 6] 。将培养基倾注在直径为 90mm培养
皿中并摇匀 , 厚度约为培养皿 l/3深度。待培养基凝固后 , 加
入 0.5ml菌悬液 ,用灭菌玻璃涂棒涂布均匀 , 静置片刻。在培
养皿中用直径为 6mm的灭菌不锈钢打孔器均匀打 4个圆孔 ,
吸取 0.25ml供试药液注入圆孔 , 同一药液滴加两孔 , 另外两
个孔分别加入阳性和阴性对照药液。置于 28℃培养箱中培
养 60h。每个试验重复 4次 ,每次试验做 3个平板。用十字交
叉法测量抑菌圈直径 , 求平均值即为抑菌圈直径。 ②细菌:采
用与真菌测试同样的方法作好涂布了菌悬液的培养基 , 用直
径为 9mm的灭菌打孔器均匀打 3个圆孔 , 吸取 0.25ml药液
注入一个圆孔 , 另外两个孔分别作为阳性和阴性对照。置于
37℃培养箱中培养 24h。每个试验重复 4次 ,每次试验做 3个
平板。抑菌圈测定方法同真菌。
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药 物 研 究　　　　　　　　　　　　　　中国民族民间医药
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＊ 基金项目:西南科技大学实验室开放基金(西科大发 [ 2007] 198号文件)
1.2.4 桉叶提取物的最低抑菌浓度测定 将 95%乙醇提取
液采用 2倍稀释法 [ 7]测定最低抑菌浓度(MIC), 培养条件同
琼脂平板打孔法。以完全没有菌生长的最低提取物浓度作为
最低抑菌浓度。
2 结果与分析
2.1 不同溶剂提取物对细菌的抑制 大叶桉叶片 6种溶剂
提取物对大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌
测定结果见表 1。可以看出 , 除石油醚外 , 5种溶剂提取物对
大肠杆菌都有一定的抑菌效果 ,但抑菌效果差异不大;而对金
黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果存在着明显的差
异 , 其中甲醇和 95%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌 、甲醇和
丙酮提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果较为明显 , 抑菌圈直
径均达到 25mm以上。甲醇和丙酮提取物对枯草芽孢杆菌的
抑制效应也比阳性对照硫酸链霉素明显。
2.2 不同溶剂提取物对真菌的抑制 乙酸乙酯和石油醚提
取物对青霉和绿色木霉均无抑菌效果 , 但 95%乙醇和丙酮提
取物对青霉具有较好的抑制效应 , 抑菌圈直径分别为 12.
2mm和 13.1mm, 95%乙醇对绿色木霉也有较好的抑菌效果 ,
与甲醇和丙酮提取物相比 ,抑菌效果均显著性差异(表 2)。
表 1 大叶桉 6种溶剂提取物对细菌的抑制活性
提取溶剂 抑菌圈直径(mm)大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌
甲醇 21.8 ±1.0bc 26.7 ±0.5a 25.8 ±0.4a
95%乙醇 22.0 ±0.9b 25.2 ±0.9b 21.7 ±0.5c
丙酮 21.3 ±0.7bcd 21.2 ±0.3c 26.2 ±0.8a
石油醚 0 22.0± 0.6c 21.7± 0.7c
无水乙醇 20.5± 1.3cd 24.9± 0.7b -
乙酸乙酯 20.3± 0.9d 20.3± 0.4d -
硫酸链霉素 25.6± 0.3a - 24.7±0.5b
二甲亚砜 0 0 0
注:表中数据为平均值 ±SD,同列数据后不同字母表示差异达 0.
05显著水平;“-”表示未测定。
表 2 大叶桉 5种溶剂提取物对真菌的抑制活性
提取溶剂 抑菌圈直径(mm)青霉 绿色木霉
甲醇 10.4± 0.4c 9.7± 0.6
95%乙醇 12.2± 0.7b 12.7± 0.6b
丙酮 13.1± 0.9b 9.9± 0.5 c
乙酸乙酯 0 0
石油醚 0 0
盐酸特比萘芬 16.1± 0.3a 18.0± 0.3a
二甲亚砜 0 0
注:表中数据为平均值 ±SD,同列数据后不同字母表示差异达 0.
05显著水平。
2.3 最低抑菌浓度(MIC) 以 95%乙醇提取物为测试样
品 , 采用二倍稀释法 , 测试了对金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌和
绿色木霉的最低抑菌浓度。抑菌圈直径小于 10mm的药液浓
度视为无抑菌效果 , 抑菌圈直径大于 10 mm的最低药液浓度
为 MIC, 结果见表 3。结果表明 , 95%乙醇提取物对金黄色葡
萄球菌的 MIC为 0.31 mg/ml, 对大肠杆菌和绿色木霉的 MIC
均为 0.63 mg/ml,可以看出 95%乙醇提取物对金黄色葡萄球
菌的抑菌效果相对要好一些。
表 3 不同浓度 95%乙醇提取物的抑菌效果
供试菌种 药液浓度(mg/ml)
5.00 2.50 1.25 0.63 0.31 0.16
金葡菌 +++++++ +++ ++ + -
大肠杆菌 +++++++ ++ + - -
绿色木霉 +++++++ ++ + - -
注:“ -”表示抑菌圈直径小于 10mm;“ +”表示抑菌圈直径为 10
-12mm;“ + +”表示抑菌圈直径为 13-14mm;“ + + +”表示抑菌
圈直径为 15-16mm;“ + + + +”表示抑菌圈直径大于 16mm;表中
数据均为 3次重复试验平均值。
3 讨论
国内外研究桉树的抑菌活性以桉叶油居多 , 已发现对多
种细菌及真菌具有抑制活性 [ 2 , 4] 。大叶桉分布广泛 , 取材容
易 ,对其研究利用已引起人们的重视。叶舟比较了 4种植物
精油的抑菌活性 , 发现大叶桉精油对大肠杆菌的抑菌活性显
著高于其它精油。曾荣等研究了大叶桉 、柠檬桉和尤曼桉叶
的乙醇提取物的抗菌活性 ,结果表明大叶桉提取物对金黄色
葡萄球菌的抑菌效果最好 , 抑菌圈直径达到 23.3mm。王岳
峰等发现大叶桉黄酮类化合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌
的抑制效应明显优于土霉素。目前 , 研究桉叶不同溶剂提取
物的抑菌活性较少。本试验发现 , 6种溶剂提取物对不同菌
种具有不同的效果。除石油醚提取物对大肠杆菌 、青霉和绿
色木霉 ,以及乙酸乙酯提取物对青霉和绿色木霉没有抑菌效
果外 , 6种溶剂提取物对供试菌种都有一定的抑菌作用。 其
中甲醇和 95%乙醇提取物的抑菌作用相对明显 ,甲醇提取物
对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 , 95%乙醇提取物对金黄
色葡萄球菌 ,丙酮提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径均在
25 mm以上 , 95%乙醇对绿色木霉也显现了较好的抑制作用 ,
青霉则对丙酮提取物较为敏感。本试验仅采用了 3种细菌和
2种真菌作为供试菌种 ,不完全具有代表性 , 同时也仅研究了
不同溶剂粗提物的抑菌活性 , 对其化学成分还缺少了解 ,有待
于今后作更深入的研究。
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(收稿日期:2009.06.30)
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