全 文 ：第 20卷　第 4期 　　　　　　　　　　　　　　云南农业大学学报　　　　　　　 Vo l. 20　No.4
2005年　8月 　　　　　　　　　　 Journa l o fYunnanA griculturalUniversity　　　　　 Aug. 2005
　收稿日期:2005 - 01 - 10　　　　*通讯作者
　作者简介:吴福川(1979 -), 男 ,山东鄄城人 , 在读硕士研究生 ,主要从事花卉生物技术与育种研究。
不同倍性金鱼草基因组 DNA
随机扩增多态性研究
吴福川 1 ,胡　秀2 , 郑思乡 1 , 3*
( 1. 云南农业大学园林园艺学院 , 云南 昆明 650201;　2. 西南林学院 ,云南 昆明 650224;
3. 云南玉溪雷森科技有限公司 , 云南 玉溪 650031 )
摘要:利用 25个 10碱基的引物 , 对金鱼草 3个不同花色品系的二倍体及其同源四倍体基因组 DNA进行随机扩
增(RAPD)。结果表明:二倍体与其同源四倍体金鱼草指纹图谱的差异 ,随不同花色品系及不同引物而变化;四
倍体金鱼草在诱导过程中除了染色体数目加倍外 ,基因组 DNA的核苷酸碱基序列也可能改变 , 这为培育四倍体
金鱼草新品种提供了丰富的育种资源。指纹图谱的建立为金鱼草新品种的鉴定提供分子水平的依据 ,为新品种
保护奠定初步基础。
关键词:金鱼草;RAPD;多倍体;指纹图谱
中图分类号:S 681. 9　　文献标识码:A　　文章编号:1004 - 390X(2005)04 - 0482 -04
Study on Random ly Amplified PolymorphicGenome
DNA ofD iploid and TetraploidAntirrihinum ma jus
WU Fu-chuan1 , HU X iu2 , ZHENG S i-x iang1, 3
( 1. Co llege o f Landscape and H orticu ltu re, Y A U, Kunm ing 650201, Ch ina;
2. Southwest Fo restry Co lleg e, Kunm ing 650224, China;
3. Yunnan Yux i Le isen Sc ience and Technology L im ited Com pany, Yux i 650031, China )
Abstract:W ith 25 10-basic prime rs, the genomes DNA o f three groupes of diploid and te trap lo idAn-
tirrhinum majus were random ly amp lified. The resu lts show ed the fingerp rinting o f diplo id Antirrh inum
majus and that of its autota trap lo id w ere d iffe rentw ith cultivars and primers;The DNA sequencesw ere
changed besides polyploided du ring polyp lo ided inducement on An tirrhinum majus. So the abundant
ge rm resourcew as offered for breed ing new cultivars. The fingerprinting can offermolecular evidence fo r
identifying new cultiva rs of Antirrhinum majus and establish the basis for p ro tec ting new cultiva rs.
Key words:An tirrhinum majus;RAPD;po lyploid;fingerp rinting
　　金鱼草 (Antirrhinum majus)为玄参科 (Scro-
phulariacea)金鱼草属 (Antirrhinum )植物又名龙头
花 、龙口花 、洋彩雀 、多年生草本 ,常做一二年生栽
培 ,是重要的盆栽花卉和切花材料 ,在国际花卉市
场上占有重要地位 。国外对金鱼草的应用和研究
较早 ,涉及遗传[ 1 ～ 3] 、栽培[ 4, 5] 、病虫害防治 、离体
培养 [ 6] 、基因分离与转化 [ 7] ,并成为分子生物学研
究的良好模式材料 ,对花发育生物学有重要贡献 。
而国内的研究与国外差距很大 , 1990年以前主要
是关于一些栽培 、组织培养方面的探索 , 1995年金
波[ 8]作了金鱼草群体的单株选择异交系的培育 ,
1991年张效方 [ 9]作了金鱼草多倍体诱导的初步研
究 ,近年来一些学者开始用于进行分子生物学的研
究 [ 10 ～ 15] 。当今 ,国内栽培的切花 、盆花金鱼草都是
二倍体 ,且优良品种均源于国外 。为了培育具有自
主知识产权的金鱼草新品种 ,本研究的前期工作是
利用秋水仙素对 3个不同花色 (白色 ,黄红色 ,紫
红色)的优良品系二倍体金鱼草进行染色体诱导
处理 ,利用不定芽技术获得纯合的同源四倍体金鱼
草 [ 16, 17] 。本文为首次对二倍体与其同源四倍体金
鱼草进行分子标记的比较 ,有助于金鱼草新品种指
纹图谱的建立及金鱼草不同倍数体之间性状变异
与基因组 DNA变化的关系 ,为新品种尽快商业化
奠定品种权保护基础 ,同时也对金鱼草多倍体基因
组进化研究奠定初步的基础。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料为花色为白色 、黄红色 、紫红色 3个
不同花色品系的二倍体及其同源四倍体金鱼草
(以后简称白花二倍体为 B2,其同源四倍体为 B4;
黄红色二倍体为 H2,其同源四倍体为 H4;紫红色
二倍体 Z2,其同源四倍体 Z4)。二倍体金鱼草购
买于花卉市场 ,其同源四倍体为人工诱导而成 。
1.2　方法
用 SDS法对 3个不同花色品系的 6个品种的
组培苗分别进行基因组 DNA提取 ,提取的 DNA经
电泳及紫外光光度分析仪检测合格后 ,稀释到浓度
为 10 ng /μL,置于 4℃保存待用 。经过优化后的
RAPD反应体系为总体积为 25μL,其中含 2.5μL
10 ×PCR buffer , 2.5mmoL M g2+ , 0.2mmoL
dNTPs, 2.5U的 Taq酶(以上试剂为上海申能博彩
生物科技有限公司生产 ), 10 pmo l 10个碱基随机
引物 (北京赛百盛生产 ),约 60 ng模板 DNA ,其余
为 ddH2O。反应循环为先 94℃变性 3m in , 36℃
退火 1m in , 72℃延伸 2m in,然后 45个以下循环 ,
94℃变性 1m in, 36℃退火 1m in, 72℃ 延伸
2m in。最后 72℃延伸 10m in, 4℃保存。电泳检
测:1μL 10×溴酚蓝加 10μL扩增产物 ,混匀后在
2%的琼脂糖凝胶 (含 0.5μg /mL的溴化乙锭)进
行电泳 ,缓冲液为 1×TAB ,电压为 4V /cm。电泳
2 h后 ,将凝胶置于凝胶成象分析系统中观察照相 ,
然后进一步分析 。
2　结果与分析
2.1　不同引物对基因组 DNA多态性扩增的影响
试验所用 25个随机引物(见表 1)分别对 6个
品种的基因组 DNA进行扩增 。结果显示 ,所用引
物不同 ,扩增的 DNA的指纹图谱差异很大 ,例如以
Z2的基因组 DNA为模板 ,对应于不同引物扩增出
的图谱 ,最多的有 16条带如 T7 ,最少的 3条如 T3,
见图 1。所用引物均能够与基因组 DNA形成杂交
位点 ,所扩增出的图谱能够反映出一定的多态性 ,
所以这些适宜的引物扩增出的图谱可以作为新品
种鉴定的分子依据 ,也适宜不同倍数体之间 ,不同
品系之间的差异比较 。
2. 2　不同品系间的指纹图谱差异
不同品系间指纹图谱的差异表现在品系的特
异带上 ,该特异带的 DNA序列可能与有关花色的
基因相关 , 有待进一步的测序 ,比较。例如引物
S10能扩增出白色花品系的特异带 (图 2),引物
S12能扩增出紫红色花系的特异带(图 3),引物 T3
能扩增出黄红色花系的特异带 (图 4),箭头所示为
特异带 。金鱼草同一品系的特异带 ,在二倍体 、四
483第 4期　　　　　　　吴福川 ,等:不同倍性金鱼草基因组 DNA随机扩增多态性研究
倍体之间无差异 ,从而可以表明花色基因具有一定
程度上地稳定性 ,进化上保守性 。
2.3　不同倍性之间的 DNA指纹图谱比较
不同引物能扩增出倍性之间不同的差异 , T3
能扩增出这 3个不同品系倍性之间的差异 (见图
4), B4比 B2减少一条带 , Z4比 Z2增加一条带 ,而
H4与 H2之间无差异 , S10只能扩增出 B2与 B4
之间的差异 , B4比 B2减少一条带 (图 2),能扩增
出 B4与 B2之间的差异的引物为 S10 , S20, T3,
S15, S16, S14,均表明 B4比 B2的图谱减少 1或 2
条。而对于 H2和 H4及 Z2和 Z4,不同引物扩增
出的不同倍性的差异表现在图谱的消失或增加上 。
金鱼草二倍体通过秋水仙素诱导成同源四倍体过
程中 ,可能引起基因组 DNA的核苷酸碱基序列的
改变 ,或同源四倍体的等位基因发生漂移 ,形成引
物杂交位点的增减 ,而表现出多倍体染色体的进化
及 DNA的多态性 。
表 1　金鱼草 RAPD多态性引物及其序列
Tab.1　The RAPD po lym orphic prim e rs o f Antirrhinum m a jus and the ir sequences
编号 序列 编号 序列 编号 序列 编号 序列
S1 CTACTGCGCT S2 CCTCTGACTG S3 CAGAGGTCCC S4 CACCCCCTTG
S5 TTTGGGGCCT S6 GATACCTCGG S7 TCCGATGCTG S8 TTCAGGGTGG
S9 TCCTGGTCCC S10 ACCGTTCCAG S11 AGTCGGGTGG S12 CTGGGTGAGT
S13 GTCGTTCCTG S14 AAAGGGGTCC S15 CAGTTCACGG S16 AGGGGGTTCC
S17 TGGGGACCAC S18 CTGGCGAACT S19 GAGTCAGCAG S20 TCTGGACGGA
A1 CAGGCCCTTC T3 TCCACTCCTG T6 CAAGGGCAGA T7 GGCAGGCTGT
T9 CACCCCTGAG
2. 4　指纹图谱差异对品种性状分析的影响
前期工作四倍体与二倍体的快速繁殖研究发
现同一花色品系不同倍性金鱼草的最适培养条件
不同[ 16] 。在同样的组织培养条件下 , H4较 H2褐
化严重 ,这可能因为四倍体金鱼草的染色体数量较
二倍体的染色体数量多一倍 ,有多套基因 ,新陈代
谢旺盛 ,有机物合成速率增加 ,能够产生较多的酚
类物质 ,酚类物质氧化成醌 ,出现褐化现象;总体看
来 , H4与 H2之间图谱差异不如 B4与 B2, Z4与
Z2之间差异明显 , H4的 DNA序列改变相对较小 ,
这也可能为褐化严重的原因之一。 B2基部的愈伤
组织化严重影响不定芽的增殖 ,而 B4基部并未出
现愈伤组织 ,这可能为 B4的核苷酸碱基序列改变
的结果。从同一品系不同倍性之间的指纹图谱差
异表现上 ,可以判定褐化 、愈伤组织化受基因型的
影响 。同源四倍体金鱼草观赏性状除了具有叶大 、
叶厚 、叶色深及花大 、花瓣厚 、质感厚重 、不易萎蔫 、
有乳突等多倍体优良性状外 ,并未因与优良二倍体
金鱼草图谱存在差异即分子水平的差异而明显表
现出不良变异 ,避免了进一步地选择育种 ,可以快
速形成品系进入市场 。
3　讨论
从分子水平上 ,比较二倍体与同源四倍体植株
之间的差异 ,本研究同前人在桑树 [ 18, 19] ,西瓜[ 20, 21]
上的研究相似 ,大部分引物扩增出的图谱在不同倍
484 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第 20卷
性之间差异不明显 ,仅有少数引物扩增出的图谱在
不同倍性之间有所差异 ,从而表明秋水仙素在诱导
染色体加倍过程中 ,引起了 DNA分子遗传结构上
一定程度的改变 。这种改变可能会使加倍的核遗
传物质与未加倍的细胞质物质之间趋向于更加平
衡 ,协调 。 DNA分子遗传结构上的改变 ,可能会使
植株的观赏性状有所改变 ,从而丰富了育种资源 ,
为进一步培育新奇花卉奠定初步基础 。
通过比较金鱼草不同花色品系 、不同倍数体之
间的指纹图谱 ,可以看出在诱导染色体加倍过程
中 ,所引起的 DNA分子遗传结构上的改变位点是
不相同的 ,这些位点是不是属于易变基因 、还是随
机发生 、还是取决于什么 ,还有待进一步研究。
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