全 文 ：收稿日期:2012-10-09
作者简介:曹阳阳(1988-) ，女(汉族) ，辽宁锦州人，硕士研究生，E-mail smile-8813@ 163． com;* 通讯作者:郭斌
(1969-) ，男(汉族) ，辽宁锦州人，副主任药师，博士，硕士研究生导师，主要从事海洋药用资源及活性成分开发研究，
E-mail jyguobin@ 126． com。
文章编号:1006-2858(2012)12-0959-04
Ⅱ型 ZTC1 + 1 天然澄清剂在萝摩多糖纯化中的应用
曹阳阳1，郭 斌2*
(1. 辽宁医学院 研究生院，辽宁 锦州 121000;2. 辽宁医学院 附属第一医院，辽宁 锦州 121000)
摘要:目的 考察Ⅱ型 ZTC1 + 1 天然澄清剂在萝摩多糖提取中的提纯效果。方法 以硫酸-苯酚法测
定含量，通过正交实验进行优化，确定理想的Ⅱ型 ZTC1 + 1 天然澄清剂处理工艺。采用Ⅱ型 ZTC1
+ 1 天然澄清剂对提取出的萝摩多糖复合物进行纯化得萝摩粗多糖。结果 Ⅱ型 ZTC1 + 1 天然澄
清剂能有效提高萝摩多糖的提取量，并与澄清剂 2 组份的比例，反应温度有关。结论 Ⅱ型 ZTC1 +
l天然澄清剂纯化萝摩总糖的最佳工艺为 A3B1C2D1，即 A、B 组分的体积分数分别为 1% 、2%，药
液的浓缩程度为 m(药物 /g)∶ V(水 /mL)= 1∶ 10，温度为 70 ℃，加热时间为 B组分加入后加热 1 h，
A组分加入后加热 1 h。
关键词:天然澄清剂;萝摩多糖;纯化
中图分类号:R 93 文献标志码:A
萝藦(Metaplexis japonica(Thunb．)Makino) ，
别名白环藤，来源于双子叶植物纲龙胆目萝藦科
萝藦属，为多年生缠绕草本，有乳汁，常以全草、块
根和果壳入药。萝藦在中医临床上具有一定的药
用价值，含有多糖、鞣酸、皂苷、蛋白酶等多种天然
活性有效成分［1］。粗多糖中通常含有无机盐、蛋
白质、色素及一些低聚糖杂质，除去这些杂质的方
法主要有透析法、酶解法、蛋白水解法、吸附澄清
法等方法。其中，透析法主要用于多糖和其它小
分子如无机盐、低聚糖等分离;酶降解或碱水解蛋
白质的方法常用于去除蛋白质;而吸附澄清法是
在提取液中加入一种吸附澄清剂，通过吸附方式
除去溶液中的粗颗粒的纯化技术，主要用于中药
精致，中药提取液澄清等。有实验表明 ZTC 1 + 1
天然澄清剂是一种很好的絮凝剂［2］，是由 A、B 2
组分组成的一类新型食品添加剂，主要去除鞣质、
蛋白质、树脂、蜡质等胶体不稳定成分，对中药有
效成分如黄酮、生物碱、甙类、皂苷类、萜类、多糖、
氨基酸、多肽、维生素、矿物质等不影响。对胶体
不稳定成份的一步清除率在 70% 左右，二步清
除率在 90%以上 ，因此特别适用于中草药制备
代替醇沉工艺，用于口服液、颗粒剂、洗剂、注射剂
等制备。ZTC 1 + 1 天然澄清剂澄清原理是第 1
组分加入之后，在不同的可溶性大分子之间“架
桥”连接使分子迅速增大［3］。第 2 组分在第 1 组
分所形成的复合物的基础之上再次“架桥”，使絮
状物尽快形成沉淀以便被除去。而天然吸附澄清
剂在保留药液中的多糖、高分子物质和可溶性固
体物方面优于传统的水提醇沉法，具有简便、有
效、价廉、稳定的优点［4］。作者将Ⅱ型 ZTC 1 + 1
天然澄清剂用于萝摩多糖的分离纯化工艺的研究
中取得了较好的效果。
1 仪器与材料
Sigma 1-15P小型台式离心机(湖南星科科学
仪器有限公司) ，TU-1800 SPC 紫外可见分光光度
计(北京谱析通用仪器公司)。
Ⅱ型 ZTC1 + 1 天然澄清剂(净质量为 500 g，
批号为 110928，天津正天成澄清技术有限公司) ，
D-无水葡萄糖标准品(批号为 C14027000，纯度质
量分数为 99. 5%，上海楚定分析仪器有限公司) ，
考马斯亮蓝 G-250(批号为 111006，天津市光复精
细化工研究所) ，其他所用试剂均为分析纯。
萝藦全草(河北安国药材市场)，由辽宁医学院生
药学教研室承伟老师鉴定为萝藦属植物萝摩(Meta-
plexis japonica(Thunb．)Makino)的干燥果壳。
2 方法与结果
第 29 卷 第 12 期
2 0 1 2 年 1 2 月
沈 阳 药 科 大 学 学 报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol. 29 No. 12
Dec． 2012 p. 959
DOI:10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2012.12.009
2. 1 澄清剂的配制
Ⅱ型 ZTC1 + 1 天然澄清剂由 A、B 2 种组分
组成。A组分:黄褐色可溶性固体粉末或浅褐色
液体，主要含淀粉酶;B 组分:浅黄色可溶性固体
粉末或褐色液体，主要含淀粉酶的复合酶。
A组份的配制:3 g A组分加 30 mL蒸馏水溶
解，搅成糊状加 270 mL蒸馏水不断搅拌，溶胀 24
h配成质量分数为 1%的溶液。B 组份的配制:先
配质量分数为 1%的乙酸(3 mL冰醋酸加 300 mL
蒸馏水搅匀)用 30 mL 质量分数为 1%的乙酸溶
解 B组分 3 g搅成糊状，加剩余 270 mL质量分数
为 1%的乙酸，溶胀 24 h，不断搅拌配成 1%的溶
液。备用。
2. 2 萝藦总多糖粗提物的制备
取萝藦 200 g，加入 12 倍量的水，浸泡 24 h，
提取 2 次(第二次加入等体积水浸提) ，每次 2 h，
温度为 80 ℃。滤过，滤液合并，减压浓缩至 m(药
物质量，g)∶ V(水的体积，mL)= 1∶ 2，备用。
2. 3 萝藦多糖的纯化
2. 3. 1 澄清剂法
取上述摩罗总多糖粗提物，分别加 5. 0、7. 5、
10. 0 倍量的水稀释制成 m(药物质量，g)∶ V(水的
体积，mL)= 1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20 的溶液各200 mL，备
用。按照正交实验法设计，考察反应温度和澄清
剂的加入量对萝摩多糖含量的影响。将 A、B 两
组分添加质量比［A:m(A组分)∶m(B组分) ］，药
液浓度［B:m(生药)∶ V(水) ］，加样温度(C:
θ /℃) ，加热时间(D:t /h)作为考察因素，每个因
素分别设立 3 个水平［5 － 6］(见表 1)。取每份
50 mL，水浴中加热到试验温度之后，首先加入 B
组分，每 30 min搅动 1 次，按正交设计时间加入 A
组分，30 min 后搅动 1 次，按正交设计时间后取
出，离心 10 min(4 000 r·min －1) ，倾出上清液，用
蒸馏水稀释至 50 mL 量瓶中，测定多糖与蛋白质
含量。
Table 1 Clarifying agent orthogonal experimental design
表 1 澄清剂法正交实验设计
No．
Factor
A B C D
1 8∶ 4 1∶ 10 60 1，1
2 4∶ 2 1∶ 15 70 2，1
3 2∶ 1 1∶ 20 80 2，2
实验结果(见表 2)表明，影响因素的大小依
次为 A ＞ D ＞ C ＞ B，影响纯化效果的最关键因素
是澄清剂的加入量;用蛋白质去除率为指标，最佳
纯化条件是 A1B1C2D3;用多糖保留率为指标，最
佳纯化条件是 A3B1C2D1。经综合评价，最佳纯化
条件是 A3B1C2D1，即 B 组分的加入量为药液体积
的 2%，药液的浓缩程度为 10 mL·g －1，B组分的加
入温度为 70 ℃，A组分的加入温度为 70 ℃。
Table 2 Clarifying agent orthogonal experimental results
表 2 澄清剂法正交实验结果
No．
Factor
A B C D
Removal rate
of protein /%
Retention rate of
polysaccharide /%
Integrated
evaluation
1 1 1 1 1 97. 65 58. 60 78. 13
2 1 2 2 2 95. 73 51. 90 73. 82
3 1 3 3 3 59. 60 39. 33 49. 47
4 2 1 2 3 97. 84 43. 36 70. 60
5 2 2 3 1 44. 48 62. 26 53. 37
6 2 3 1 2 56. 10 49. 72 52. 91
7 3 1 3 2 76. 19 84. 67 80. 43
8 3 2 1 3 99. 07 55. 23 77. 15
9 3 3 2 1 71. 85 96. 71 84. 28
K1(protein) 84. 33 90. 56 84. 27 71. 33
K2(protein) 66. 14 79. 76 88. 47 76. 01
K3(protein) 82. 37 62. 52 60. 09 85. 50
R(protein) 18. 19 28. 04 24. 18 14. 17
K1(polysaccharide) 49. 94 62. 21 54. 52 72. 52
K2(polysaccharide) 51. 78 56. 46 63. 99 62. 10
K3(polysaccharide) 78. 87 61. 92 62. 09 45. 97
R(polysaccharide) 28. 93 5. 75 9. 47 26. 55
K1(itegrated) 67. 14 76. 39 69. 40 71. 93
K2(itegrated) 58. 96 70. 49 76. 23 69. 05
K3(itegrated) 80. 52 62. 22 61. 09 65. 74
R(itegrated) 21. 56 14. 17 15. 14 6. 19
069 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 29 卷
分别取 3 份药液的浓缩程度为 m(药物 / g)∶
V(水 /mL)= 1∶ 10 的药液，于 70 ℃恒温水浴中加
入质量分数为 2%的 B 组分，1 h 后 70 ℃加入质
量分数为 1%的 A 组分，1 h 后离心。结果:蛋白
质去除率分别为 84. 5%、82. 3%和 83. 2%，RSD
为 1. 3% (n = 3) ;多糖保留率分别为 94. 6%、
92. 3%和 93. 2%，RSD为 1. 3%(n = 3)。结果表
明此工艺稳定可行。
2. 3. 2 Sevag 脱蛋白法
将萝藦总多糖粗提物稀释 5 倍，取 50 mL 进
行脱蛋白处理。脱蛋白 6 次，每次加氯仿-正丁醇
(体积比为 4∶ 1)的混合液 10 mL，充分振荡 30 ～
40 min 后，离心 10 min(4 000 r·min －1) ，使分层，
分取上层水相，备用［7］。
2. 4 蛋白质含量的测定
采用考马斯亮蓝 G-250 染色法测定可溶性蛋
白［8］。
2. 4. 1 标准曲线的绘制
取牛血清白蛋白 25. 0 mg，置 100 mL 量瓶
中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成牛血清白
蛋白贮备液(250 mg·L －1)。吸取贮备液 40 mL，
置 100 mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即
得 100 mg·L －1蛋白标准溶液。另取考马斯亮蓝 G
-250 100 mg，置 1000 mL 量瓶中，加体积分数为
95%的乙醇 50 mL溶解(蓝色) ，加入质量浓度为
85 g·L －1的磷酸溶液 100 mL(血红色) ，最后用蒸
馏水稀释至刻度，摇匀，作为显色剂(褐色)。精
密量取蛋白标准溶液 0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 mL，
分置 10 mL 试管中，各加水稀释至 1 mL 后，向各
管中加入显色剂(考马斯亮蓝 G-250 溶液)5 mL，
混匀后，在 30 ℃水浴中保温 5 min，用蒸馏水为空
白，在 595 nm的波长处测定吸光度 A。以蛋白质
质量浓度(ρ)作为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，
得标准曲线，得回归方程 A = 1. 802 × 102ρ － 11. 54
(r = 0. 999 3) ，表明蛋白质溶液在 20 ～ 100 mg·
L －1内有良好的线性关系。
2. 4. 2 样品测定
取经 ZTC1 + 1 处理之后的溶液和未经处理
的粗提液，按照上述蛋白质的测定方法，测定样品
中蛋白质的含量并计算出去除率。
2. 5 多糖含量的测定
多糖含量采用苯酚 －硫酸法测定［9］。
2. 5. 1 标准曲线的绘制
标准曲线的绘制:精密称取 105 ℃恒重的葡
萄糖标准品 20 mg，加蒸馏水溶解并且稀释到
500 mL量瓶，配制成 40 mg·L －1多糖标准溶液，分
别精密吸取标准溶液 1. 0、2. 0、4. 0、6. 0、8. 0、
10. 0 mL 定容到 10 mL 量瓶制备标准系列溶液。
分别精密吸取 1. 0 mL，然后再加入质量分数为
6%的苯酚溶液 1. 0 mL，摇匀，立刻加浓硫酸
5. 0 mL，冷却至室温后，以水作为空白对照，在
490 nm 处测定其吸收度，以吸光度 A 为纵坐标，
多糖质量浓度 ρ(mg·L －1)为横坐标，绘制标准曲
线，得回归方程为:A = 9. 460ρ － 8. 07 × 10 －2，r =
0. 999 3，多糖含量采用苯酚 －硫酸法测定［9］。取
经 ZTC1 + 1 处理后的溶液和未处理的水提液各
1 mL，按照上述多糖测定方法，测定样品中多糖
的含量并计算提取率。
2. 5. 2 样品测定
取经 ZTC1 + 1 处理后的溶液和未处理的粗
提液各 1 mL，按照上述多糖测定方法，测定样品
中多糖的含量并计算提取率。
2. 6 纯化效率的比较
在多糖的纯化处理过程中，纯化效率与处理
次数有关，多糖粗提物中蛋白的去除率随处理次
数的增加而提高，同时多糖的损失率也随之提高。
对 2 种纯化多糖方法脱蛋白方法的蛋白去除率和
多糖损失率的结果进行了综合比较:进行了 6 次
Sevag 法经 6 次处理后，除蛋白处理进行 6 次后，
蛋白去除率为 87. 3%，随着除蛋白次数的增加，
药液中多糖的损失也逐步增加，6 次除蛋白处理
后药液中同时多糖损失率高达 35. 5%;而Ⅱ型
ZTC1 + 1 澄清剂法一次性处理所得的蛋白去除率
为 83. 3%，相当于 Sevag 法处理 6 次的结果，但其
多糖的损失率仅为 6. 63%。再者，Sevag 法脱蛋
白使用的试剂是氯仿和正丁醇，氯仿的残留具有
肝损伤毒性。相对于 Sevag 法除蛋白消耗大量正
丁醇和氯仿试剂，既增加成本又具有毒性的缺点，
澄清剂法除蛋白效率较高。
3 讨论
Ⅱ型 ZTC1 + 1 天然澄清剂的纯化工艺通常
是先加 B 组分，加入 1. 0 ～ 2. 0 h 后再加入 A 组
分，A组分的加入量一般是 B 组分的 50%。温度
对澄清剂的纯化效率有一定的影响，温度低，絮凝
作用不充分;在确保药物稳定性的前提下，宜在较
高的温度下使用，但温度过高，使絮凝剂高分子老
化，也将影响其絮凝作用。澄清剂的加入量和药液
169第 12 期 曹阳阳等:Ⅱ型 ZTC1 + 1 天然澄清剂在萝摩多糖纯化中的应用
浓度直接影响多糖的提取率和蛋白质的去除率，应
通过综合指标分析，权衡澄清剂最佳的加入量。
Ⅱ型 ZTC1 + 1 天然澄清剂具有高效、低毒、
成本低、操作方便等优点，在多糖的保留率和除蛋
白方面优于传统的 Sevag 法。本文作者对Ⅱ型
ZTC1 + 1 天然澄清剂应用于萝摩多糖的絮凝精制
工艺的条件进行了优化，确定了最佳提取条件。
经过天然澄清剂处理的提取液较澄清，更容易后
期处理，如能结合大孔吸附树脂、超滤法等先进精
制技术对萝摩多糖进行提取纯化，对萝摩多糖的
进一步开发利用将有良好的前景。
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Application of type ⅡZTC1 + 1 natural clarifying a-
gent in the purification of Japanese metaplexis poly-
saccharide
CAO Yang-yang1，GUO Bin2*
(1． Graduate School，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China;2． The First Affiliated Hospital，
Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China)
Abstract:Objective To study the effect of type ⅡZTC1 + 1 natural clarifying agent used in the purification
of Japanese metaplexis polysaccharide．Methods The content of Japanese metaplexis polysaccharide was de-
termined by phenol-sulphuric acid． The method was optimized by orthogonal experiment． Type Ⅱ ZTC1 +
1 natural clarifying agent was used to refine the extracted Japanese metaplexis polysaccharide compound to
get crude polysaccharide． Results The result showed that type ⅡZTC1 + 1 natural clarifying agent could ef-
fectively improve the content of Japanese metaplexis polysaccharide，the effect was relates to the proportion
of two components and temperature． Conclusions The optimal condition of Type ⅡZTC1 + 1 natural clarif-
ying agent used in Japanese metaplexis polysaccharide is A1B3C1D2 ．
Key words:natural clarifying agent;Japanese metaplexis polysaccharide;purification
269 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 29 卷