全 文 ：生物化学与生物物理进 展 l q 8 8 年 第 ” 卷 第 6 期
饭班豆凝集素等电点的快速测定
赵永芳 周济兰’ 叶明*
(武汉大学生物系 )
目前多数人采用凝胶等电点聚焦电泳法测定蛋白
质等电点 ( p l ) 。 此法受多种因素的影响〔 , , ” 月, ,加之所
用试剂 A m p ho lyt 。 价格昂贵 , 故使用不甚方便 。 根据
溶液 州 值大小直接影响蛋白质和离子交换剂束缚力
的原理 , Y a n g ( 1 9 5 5 ) 报道了一种 p l 测定方法 , 我们
参照这一方法对饭 虹豆 ( v i g n a C , l i n d r i c a ) 凝集素
(详见另文 )的 lP 值进行了测定 , 结果表明此法快速 、
准确 ( < 0 . 2 p H 单位 ) 、 成本低 (离子交换剂可反复使
用 )。
中带负电荷 ,不能被阳离子交换剂吸附 ; 第 ( 2 )段是等
电点区段 ,将该区段的首 、 尾 p H 值相加被 2除就可得
表 1 凝绍效价与 p H 的关系
方 法 与 结 果
一 、 方法
1
. 蛋白质含量的测定 : 用 A 。 。 , 消光值表示 ,
以牛血清白蛋白 (进 口产品 )作对照 ;
2
. 饭虹豆凝集素的制备及效价测定 : 按文献【5]
进行 ;
3
. 凝集素等电点的测定 : 选用 p H 变化范围在
斗 . 5一 6 . 0 的离子交换 剂 S p 一 S e ph a d e x C一 5 0 (进 口 产
品 ) , 饭豉豆凝集素用生理盐水稀释 , 其浓度为 2 119 /
n l l
。 操作步骤参照文献 〔3〕进行。
二 、 结果
用离子交换剂测 出饭 弧豆凝 集素的 等电 点 为
5
.
3
。 饭虹豆凝集素溶液在 p H 4 . 8一 6 . 0 时 , 用它与
sP 一 eP ha de x C一 50 交换后 , 其上清液的凝集效价列于
表 1( I ) 。 以表中所列效价数为纵坐标 , 以相应的 p H
值为横坐标即可绘出饭虱豆凝集素的等电点测定曲线
(图 1 中 A )。 从图看出 ,该曲线分为三段 : 第 ( l) 段是
饭愈豆凝集素被 S -P s e p h ad xe C一 50 所吸附 , 凝集效
价为 。 。 这表明饭虹豆凝集素在 p H 5 . 2 以下的溶液
中带正电荷 ,能被阳离子交换剂吸附 ; 第 ( 3 )段凝集效
价为 1 6 。 这表明饭虹豆凝集素在 p H S . 4 以上的溶液
沂 l 2 3 4 5 6 74 . 8 5 。 0 5 。 2 5 . 峪 5 。 6 5 。 8 6 。 0I* 0 0 0 l 6 16 l 6 l 6
11* 8 8 8 0 0 0 0
*
sP
一
s 。 p h o de : c 一 50 吸附饭虹豆凝集素后的上清液 。
*. s p
一
S e p h a d 。 二 C一 50 吸附饭弧豆凝集素后的沉积胶加
l m lo
·
4 m o l / L 磷酸缓冲液 (含 0 . 15 m o l / L N a C I ) ,
p H 7
.
0 , 充分洗涤 ,离心后收集的上清液。
(3)
B
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A
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4
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.
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.
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.
4 5
.
6 5
.
8 6
.
0
P H
图 1 饭弧豆凝集紊的等电点测定曲线
A
. 交换剂吸附凝集素后的上清液 ;
.B 交换剂吸附凝集素后的沉积胶再洗脱的溶液。 箭头
所指表示等电点处 。
* 湖北省肿瘤研究所 。
析结果获得用户满意 。 重复性 、 再现性均好 。 [ 2] M . s . 卡南高著 , 陆中定译 : 《 衰老生物化学 、 , 人民卫
生 出版社 ,北京 , 1 9 80 , 16 4 页 。
参 考 文 献 [ 3 」
〔曰 p · 卡尔森等著 , 张增明译 : 《病理生化学 》 , 科学出版
社 ,北京 , 19 8叮, 6 3页 。
一 呼7 0 .
B e e k m a n I n s t r u m e n t I n e : T r 画伟孚 . 9 C o t ` r ` c f“
I Z IM B A那 . 0 A e i` A . 口 ry 名 e r , 1 97 9 ·
[本文于 19 8 7 年 10 月2 8 日收到 ]
出饭虹豆凝集素的等电点为 5 . 3 。 即
P I ~
5
。
2 十 5 。 斗
2
为了证实本试验所测数据的准确性 , 曾把上述各
管中吸附凝集素后的交换剂分别进行离心 ,弃上清液 ,
尔后在每管沉积胶中加入 l m l 0 . 4 、 i/ L P sB 溶液
充分洗涤 , 再离心收集上清液测定其效价 (见表 1 中
1
)
。 从表中数据看出 ,在每个 州 值范围内 ,由离子交
换剂洗脱出溶液的效价与其吸附后上清液的效价正好
相反 。 即前者为高效价时 ,后者则为无效价或低效价 ;
反之 ,前者为无效价或高效价时 ,后者则为高效价 。 由
表 1 中 il 所列数据绘出的曲线 (图 1 甲 B )也正好与图
1 中人相反 。
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.
25
日.0。z阅
0
.
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.
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讨 论
1
. 用离子交换剂测定蛋白质等电点是一种可靠 、
快速 、 经济的方法 。 我们曾用此法分别测定了国产和
进 口的两种牛血清白蛋白的等电点 ,其结果 ( lP 二 5 . 2 )
与文献「3 !报道一致 , 与进 口样品 p l ~ 5 . 3 相近 。 依
照本法测出的饭虹豆凝集素等电点值是 lP ~ 5 . 3 , 对
该物质的盐析液进行了离子交换层析分离 , 结果较为
满意 (另文报道 ) 。 本法测定蛋白质的等电点时 , 1一 2
小时可得到结果 ,所用的试剂也较普通 ,被检测的样品
不一定提纯 (如有特异测定方法时 ) 。 可见用离子交换
剂测定蛋白质等电点可能是一种有实用意义的方法 。
2
. 强性离子交换剂用于测定蛋白质的等电点 较
为适宜 。 离子交换剂吸附蛋白质的数量与溶液的 PH
值关系密切。 强阳性离子交换剂 ( sP 石 e户ad xe C一 5 0)
或强阴性离子交换剂 ( Q A E一 se 曲 ad xe A一 5 0) 在 较广
的 p H 范围有较大的解离度闭 , 对带同样电荷蛋白质
的吸附量趋于一致 , 可减少测定误差 。 但用此法测定
牛血清白蛋白的等电点时产生了异常的第 (劝 段曲线
(图 2) 。 这可能是由于牛血清白蛋白 ( lP = 5 . 2 ) 在
声 < 4 · 6 的溶液中带较多正电荷导致交换剂的交换容
量增大或产生非特异吸附现象而引起的 。
图 2 牛血清白蛋白的等电点测定曲线
箭头所指表示等电点处
3
. 用离子交换剂测定蛋白质的等电点时 ,离子交
换剂与蛋白质用量的比例要适当。 一般用分光光度法
测得蛋白质的浓度为 3 m g /。 l , 离子交换剂 (沉积胶 )
为 l . o m l 时 , 测出的 lP 值较为理想 。 若交换剂量加
大到 1 . 5功 l 时 ,可使 州 5 . 2 以下的蛋白质均被吸附 ,
而在 p H S . 4 以上不出现水平线 (出现梯度线 ) , 致使 mlj
出蛋白质的等电点偏高 ,甚至测不出来 。
致谢 : 王微勤副教授帮助鉴定饭弧豆特此致谢 。
[ 3 ]
[ 4 ]
参 考 文 献
A n D e r l a n
.
B
.
: A r e h
.
B匆 c方e 份· 斤i P入y : . , 19 80 ,
2 0 0 ( 1 )
, 2 0 6
·
赵永芳编 : 《生物化学技术》 , 武汉大学印刷厂 。 19 8 2 ,
P
·
2 1 7
,
Y a n g
, v
·
C
·
a n d L a n g e r
, R
·
: A . 口 l
· 召勿 c几亡份 . , 19 8 , ,
14 7 ( l )
, 1 4 8
·
I` o 亡 l亡 c t r i c F o c r` 5 1 , g PI 该几 c i P I亡 5 a . d M 亡 t人。击 . ,
p h a r m a e i a f i n e C h e m i C a l s
.
I J p p s a l今 s w e d e n , 、
1 9 8 2
-
L本文于 1 9 8 7 年 10 月 12 日收到]
品、