全 文 ：吉 林 大 学 自然 科学学 报
1 4 9 6年 第 4 期
赤豆 P (ha e s0I招 a ng u a lr) i s蛋白鬓的研究
:a 一和价球蛋白制备方法的改进及其某些性质 ’
林 永 齐 陶 慰 孙 *
(1加 4年 9月4 2日收到)
本文报导 了用盐析和等电点沉淀柑桔合的方法制得电沐均一的 , 等电 点分 别分 p月 4 . 5和 石 . 9 的赤豆
。 一和归一球蛋白。 “ 一球蛋白的分子量为 : 1 3` , 0 0 : 月一球蛋白为 : 1 1 8 , O 0 . a 一球蛋白具有蛋白水解酶
的活力 , 舀一球蛋白无活力 . 碱中球蛋白在氨基酸粗成上有相似之处又有所不同 .
在前文 中川我们报导了用 J on 。 。法侧从赤豆提取 a 一和口一两种球蛋白的桔果和这两
种蛋白箕氨基酸定性粗成等数据 . 我们注意到了在赤豆 a 一和 刀一球蛋白中 , 都含有共
同的十八种氨基酸 . 此后 , 我俏又对 a 一和 刀一球蛋白在脉和氯乙醇溶液中的粘 度和旋
光性臂等 , 作了一些初步探甜 夕 注意到 a 一和声一球蛋白在这些性臀上有所不 同 .
为了进一步研究 a 一和 刀一球蛋白性臀上的特点 , 粘裤和性臀的关系 , 以及两种球
蛋白之简的联系等 . 在本文中 , 我俏对两种球蛋白电泳均一样品的制备 , 电泳性臀 , 分
子大小及氨基酸定量粗成等作 了探豺 .
实 欲 与 结 果
一 蛋白霄的制备 赤豆来自吉林大学农锡 , 人工选 出皮为紫杠色的赤豆 . 用石磨
磨碎通过 80 目筋孔筋下豆粉 .
豆粉先用 4 倍量的 5书 N aC I溶液提取 48 小时 , 然后趁滤 . 滤液稠至 0 . 3 硫酸按鲍和
度和 p H 4 . 5 , 沉淀是 a 一球蛋白 . 滤液再稠至 0 . 9硫酸按鲍和度和 p H S . 9 , 沉淀是 刀一球
蛋白 . a 一和 声一球蛋白都反复精制一次 . 对水透析除慎 . 冷冻干燥 .
赤豆粉含蛋白总量 27 呢 左右 . 其中 a 一球蛋白豹含 0 . 5 呢 , 户一球蛋 白在 8呱 以上
(制电泳种样品时 夕 精制损失蛟大 , 所以实际 a 一和 口一蛋白含量娅高 . )
二 扼度鉴定 按潘家秀等 3[] 方法用道脂凝谬平板电泳进行 ;榆查 . 电泳用 p H S . 8,
本文主要内容曾于 1 9 6 4年 8月在大速召开的全国生理科学会滋上报告 。
、 王治中 、 强德安 、 吴志奎 、 孙志肾 、 姚答智等同忐参加部分实啦工作。
吉 林 大 学 自 然 科 学 学 报 196 4年
离子强度. 05 0的巴比妥援冲液 . 电压 5 一 V 6/ “ 扭 ; 遭脂漠度 0. 8 另 ; 电泳时简为 1. 5 小
时 . 沉淀剂用 5 9务乙醇 电泳桔果兑图 1. a 一和 刀一球蛋白电泳速率分别为 4. 4一 5 . 4、
`。一份/ 秒 , ` · ” 一 , · 8 / 10 一 “ 。 m ’夕/秒 ·
用 Sm i t ih es 等 4[, 5〕淀粉凝腰电泳法 , 亦得到均一区带 .
采用 A o d r o w s等 6[J 翼脂凝月多过滤法 夕 得到翠一的攀 .
三 等电点的测定 将 l 毫升 0 . 5多蛋白溶液加 到不同 P n 的 6毫升援冲液中 (离子
强度 0 . 04 ) , 混匀后在光电此色言于上进行此渴 . 然后 夕 精确测定 PH 值 . p H 一镯度曲耪
觅 图五 1 . ’ a 一球蛋白等电点为 4 . 4士 0 . 3, 声一球蛋白等电点为 5 . 9士 0 . 3 .
0,D网fl`爪|研扎.l时仁对lJ针l以引 .外|外
{
初 匀 向 ’ .’ 而 ’仔禅
圆 I 。 一球蛋白等电点 p H O 4 .狂 0 . 3 乃刃 4 0一: 。
圆盟 召一球蛋白等电点 p H~ 6 . 9士 0 .君
四 分子蛋测定 用渗透 压法侧 定分子量 . 渗透 压的侧 定和半透 膜的 制备 采用
A d a`· 法 〔 7· 8, . 平衡 。 度为 。 。士。 . 5 · 。 , 、 高仪最小、 数为矗毫米 . 用、 算和作图求得
分子量 . “ 一球蛋白为 1挺 , 0 仍 刀一球蛋白为 1 15 , 0 0 . 兑图界 、 V .
第 4 期 林永齐 、 陶慰孙 : 赤豆 ( P h a阳。 l哪 a n g时 a r i的蛋白鬓的研究 5 9
五 蛋白水解酶活力测定 用阿久根了等 [91 方法 . 以脉变性酪 蛋白为底物 . 侧定
时 p H 为 5 . 1 , 温度 3 6 O C , 保温一小时 . 以三氯醋酸招止反应用 fo l in 酚献剂显色 . 在分光
仇沱
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圆 F 赤豆 a 一 球三
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告 林 大 学 自 然 科 学 学 报 1 9 64 年
光度言仁L此色侧定 ( 6 0 m均 一 a一球蛋白比活力为 1 .邪 0, 刀一球蛋白此活力为 0 . 0 3 .
六 、 氨基酸分析 采用 M。 。 r e和 s et in 的离子交换柱上层析法 10[ ,川 并稍加改进 .
样品用 5 . 7 N 堕酸于 1 10 0 C 水解 胜 小时 . 酸性 , 中性氨基酸是在 15 0 厘米是柱上 , 先用
P H 3
. 邪 , 后用 P H 4 .邪的 0 . ZN 穆檬酸援冲液洗脱 . 洗脱液用荀三酮 一 K C N 一乙二醇 甲醚
显色液显色 , 在 7 2型分光光度舒上进行此色定量 .
将蛋白臀用过甲酸氧化 , 而后进行水解 , 用层析侧定半肤磺酸和 甲硫氨酸做的量 ,
由此得知在蛋白中胧氨酸和甲硫氨酸的含量 .
色氨酸用 G r a ha m法 1[ 幻侧定 . 酚氨用 C o n w a y法 〔13 侧定 .
层析图兑图狂 . 全部氨基酸 分析桔果 列于表 I 中 , 从表中可以看到 : 两种 蛋白臀
脚l’lō
振拼 。 ,。、 . _ 内华 r
了留 翼 邹 O。 2 日椒 拧檬 浏4乃 归 N 阵 柠雄酸浏次泣刁嗯 才加 君 . 烈梦_ 1耐千一州材 .03 州 点 打姗绷
幸元长 巧O溯 才主备. 巧切
圆矶 赤豆 a 一球蛋白永解液唇析圆槽
都含有共同的十八种氨基酸 . 其中以二魏基氨基酸含量蛟高 . 色氨酸 、 甲硫氨酸含量很
低 . 它们在林氨酸 、 丙氨酸 、 撷氨酸 、 甲硫氨酸含量上相近 ; 而在苏氨酸 、 胧氨酸 、 酪
氨酸 、 苯丙氨酸 、 具亮氨酸 、 帕氨酸等含量上差别较大 . 甜明两种蛋白臀在氨基酸粗成
上既有相似之处 , 又有差别 .
辞p J 箫
用腹析和等电点沉淀相拮合 的方扶从 赤豆制得 a 一和 户一球蛋白 , 样品 都是 电泳
均一未变性的白色粉末 . 在产量 、 色泽和天然性臀的保持上 , 都胜过 oJ en “ 的硫 酸按分
粗沉淀的方法 . 木文把董脂凝腰电泳 、 淀粉凝腰电泳引入赤豆球蛋白的研究中 , 得到较
好的分离和鉴定 .
从电泳速率 、 等电点 、 渗透压行为 、 酶活力等可以 看到两种球 蛋白尽管 分子量相
近 , 但它们的一系列化学 、 物理化学和 生物学性臀是很不相同的 . 尤其 a 一球蛋白具有
突 出的特征 .
从表 亚中的 a 一和 刀一球蛋白在 自由搜基和碱基的含量上来看和 它俏的等电点的高
低是不对应的 ; 甚至有些反常 , 郎碱基含量高 , 自由竣基含量低的 蛋白臀等 电点应当
高 , 郎。 一蛋白等电点应高于刀一蛋白 . 这里相反 . 我 f凹韶为这可 能是因为蛋白臀的等
电点不只与其离解基的数目有关 夕 同时也和离解基的离解常数有关系 . 因为每一个离解
第 4 期 林永齐 、 陶慰孙 :赤豆 ( rh a 台e o王 u公 a n g n l a r i日 )蛋白臀的研究 61
表 I 赤豆球蛋白氨基酸粗成
a 一球蛋白 分子量 1 34 , 0 0 0 刀一球蛋白 分子量 2 1 5 , 0 0 0
氨 基 酸 残 基
(呱 )
9
.
7 5
4
.
3 4
5
.
1 3
(呱 )
基团 /
/ 分
感 其 } N I其 田 / 基
(呱 )
团声
/ 分
N { 习丰闭 /
子
086036飞ùn乃阿才91`ú匕71上天尸弓冬氨酸
14 0 1 8 5
ó口1.一25间`4ù口5snonZn打870Qù
1`一491
上
52
2八ho
,184t了691538
1 .介0842
1 3
.
4 7
3
.
0 5
3
.
2 2
3
.
1 6
3
.
3 7
5
.
0 5
1
.
4 5
2
.
8 2
7
.
2 7
5
.
4 1
N H 3
7
.
6 0
3
.
8 3
5
.
2 6
9
.
3 5
2
.
8 1
5
.
0 8
4
.
0 0
2
.
7 3
4
.
5 7
0
.
9 9
2
.
2 4
5
.
7 6
2
.
9 9
3
.
0 2
1 0
.
1 8
5
.
1 3
1 2
.
6 0
0
.
2 0
6
.
8 3
2
10 2
10
.
5 0
2
.
5 7
4
.
8 8
2 0
.
2 3
3
.
7 2
2
.
4 4
3
.
1 6
0
.
8 7
4
.
7 8
1
.
4 7
4 7 0
8
.
8 0
2
.
6 6
7
.
2 7
6 , 0 0
2
.
2 7
欣 . 0 0
0
.
3 0
7
.
8 2
2
.
2 0
4
.
8 0
1 3
.
4 1
3
.
2 7
3
.
6 6
3
.
8 1
0
.
7 4
4
.
1 3
0
.
9 6
3
.
5 5
6
.
6 9
1
.
3 8
4
.
2 3
7
.
4 5
4
.
1 3
1 4
.
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.
2 4
9
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扩酸翻氮氨海痛ùù、己一己.`一硫亮。、丙。`乙.声勺、阵队睽降嘛叹阴肺肚撇.用.屡l流邵苯属粗精巨
1 3 2
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” · 0 9
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总 箭 】 9 2 . 3 6 9 5 . 1 7 1 0 3 9 9 4 . 6 8 9 6 . 2 9 9 5 4
苏氨酸 、 林氨酸分另撇正 6 % , 10 % .
注 : 粗氨酸 , 甲硫氨酸款差稍大于 5 % , 其余均刁汗 5 % .
表 亚 a 一和 户一球蛋白某些基团比较
下二二
基团墓搜基由性
基团
自
钾荟、擎\ a 一球 蛋 白 吞一球 蛋 白
氨
极 性
14
.
5
1 5
.
1
9
.
8
1 3
.
1
3 5
.
5
1 6
.
9
1 2
.
8
1 3
.
8
1 0
.
1
3 7
.
8
碱酚翔非
吉 林 大 学 自 然 科 学 学 报 1 96 4年
基的离解受到其郝近的离解基的静电吸引的影响 , 所以蛋 白臂等电点和它的碱基 、 自由
淡基含量不一定有一个固定关系 . a 一球蛋 白含有校高 的眯氨酸含量可 能也是 a 一球蛋
白等电点偏酸的一个原因 .
a 一和 刀一球蛋 白在其氨基酸粗成 _仁的具同 , 必然和性 育上的具同有联系 . 从两种
球蛋白在种籽中的含量及酶学性臀上来看 , 似乎是催化与储藏的关系 . 至于进一步知致
工作本实舫室正在进行 .
赤豆种籽含蛋白量蛟高 , 声一球蛋白是 主要粗成部分 . 其在动 物所 必须 的氨基酸
如 : 精氨酸 、 粗氨酸 、 撷氨酸和林氨酸等含量上是丰富的 . 因此韶为赤豆是具有蛟高营
养价值的食品 . 作为生产这些氮基酸的原料亦颇有希望 .
在氨基酸分析过程 中夕 发现按 M o o r 。 法用 PH o . 2 8 援冲液在 15 厘米柱上洗脱碱性氨
基酸时 , 粗氨酸的位置很不稳定 , 易与棋氨酸和氨的攀混在一起 , 产生很大靛差 . 当改
用 0 . 35 N P H 4 . 4的援冲液洗脱时 , 使粗氨酸攀的位耀呈移至氨和精氨酸之简 , 并较稳定 .
这样就使得蛾氨酸 、 氨 、 粗氨酸 、 精氨酸四个攀分离很清楚 , 因而减小簇差 .
总 结
1
蛋白 .
2
3
4
5
用顺析和等电 』点沉淀相精合的分 粗精制法 , 得到 电泳均一的赤豆 a 一和 刀一球
“ 一和刀一球蛋白等电点分别为 P H 4 . 4士 0 . 3和 5 . 9士 0 . 3 .
用渗透压侧得 a 一和刀一球蛋白分子量分别为 1 34 , 0 0和 1 1 8 , 0 0 .
a 一球蛋白具有蛋白水解酶活力 , 刀一球蛋白无活力 .
用柱层析法定量侧定了 a 一和 刀一球蛋白的氨基酸粗成 . 它仲显的共同 特点是二
穆基氨基酸多 ; 色氨酸 、 甲硫氨酸很少 . 在其他氨基酸含量上 , 有相似之处又有差具 .
中国科学晓生物化学研究所任梅开等同志在氨基酸分析等技术方面抬予很大帮助特此致榭 .
参 考 文 献
梁杉垣 、 林永齐 、 陶慰孙 , 吉林大学自然科学学报 , 总 13 期 , 1 15 l( 9 6 2)
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第 4 期 林永齐、 陶慰孙 :赤豆 (p b “ e ol创 。遇g 恤缸招)蛋白置的研究 6 3
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B y u s i n g O o m b i n e d s a l t i n g o u七 a n d i s o一 e l e c t r i o p , e “ i P i t a t i n g 功 e七h o d , . n
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2
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T h` i s o e l e o 七r i o p o i n t o f a一 a n d 刀一 G l o b u l i n s a , e p H 4 . 4 士 0 . 3 a n d
5
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9士 0 . 3 r e s P e o t i v e l y .
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T h e 扭 o l e o u l a : 刃 e i g h t s d e t e : m i n e d b y u s i n g o s m o t i o P r e s s u r e 功 e t b o d o f
a一 a n d 、 声一 G l o b u l i n s a r e 1 3 4 , 0 0 0 a n d 2 1 5 , 0 0 0 r e s P e o t i v e l y .
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I t h a s b e e n f o u n d t h a t t h e a一 G l o b u l i n h a s a p r o t e o l y 七i c a o t i v i t y ,
w h i l e 刀一 G l o b u l i n h a s _ n o n e .
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T h e a功 i n o a o i d o o n t e n七5 o f b o七h 七b e G l o b u l i n s h a v e b e e n d e t e : 血 i n e d
b y o h r o m a t o g : a p h y o n o o l u m n s o f i o n一 e x c h a n g e r e 日i n s . I t h a s b e e n f o u n d t h a t
t h e D i o a : b o x y l i o a功 i n o a o i d s a r e r i c h i n b o t h o f t b o G l o b u l i n s , b u七 l e s s i n
T r y p t o P h a n a dn M
e t h i o n i n e
.
T h e q u a n t i t i e s o f o t h e r a功 i n o a o id s a : e o i t h o r
日i m i l a r o r d i f f e r o n七 .