全 文 ：第 1 1卷
10 99年
弟 1期
3月
赞 南 大 学 学 报
JO UR N 人L OF J IN AN UN IV R E S IT Y
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窝二 二 二 , , 二二 刁 .——
王瓜根杭癌糖蛋白的生理生化特征及
其对肺腺癌细胞杀伤作用初步研究
吴伯 良 王 漩 , 杨 文 染
(生物系 )
黄冉阳 料 万江欣 来
罗玉香 ` 刘杰森
〔生殖免疫研究中心 )
摘 要
f
经 电泳分析 , 王瓜根活性蛋 白可 分为两种 、 : 其叮是酸性蛋白 , . 具 细胞毒作用 ,
等 电点测定 P , 为 3 . 2 , P A G E 电泳测定分子量为 6 . 76 义 1 0 `道 尔顿 ;其二是碱性蛋 白 ,等
电点 为 9 . 3 , P A G E 电泳测定分子量为 1 . 58 又 1 0 `道 尔顿 , 微具 细胞毒作 用 : 王瓜根活
性蛋 白属糖蛋 白 , 经 纸层析和薄层硅胶 H层析证实含半 乳糖和木糖 。 扫描卑镜观察和
光 镜连续观察 , 显示 酸性 蛋白村肺腺疮细胞的体欢培养有声伤作 用 , 当菇养液含 120 _
阵g
m/ 1时杀伤率澳移% , 对平常肺细胞作 用弱 ;碱性蛋 .白对肺腺癌细咚杀伤作用较差 ,
在同样剂量时只 有 47 . 6写杀伤率 ·新鲜王瓜根原汁有很强的杀伤肺睐癌钾胞作用 , 补
量在 “ 6 9 / m l时 , 杀伤率 达“ ” % , 当提 高到 `” 5 “ /m l时 , _ :杀伤舟达 7 4肠了试脸结果提
示 : 王瓜根 活性杭癌物质 , 除指三 枯一葫芦素之玲 , 可 能还存在 另一种 活性物质 ·
这种活性杭癌物质对肺腺癌 细胞表面微绒毛 无作月, 、 经处理“ 4小 时后 : 癌坤胞开丧“
变形 , 表现 为不 同程度内陷 , 32 小 时癌 细胞膜开始 溶解 , 侣 小 时癌 细胞溶成 因块 。
关键词 : 肺腺癌 细胞 ; 糖蛋 白 , 杭癌活性物质 ; 肺 成纤维 细胞 ; 等电点聚推、 ; 薄层
层析
天花粉作为抗癌药最早见于 《本草纲目》 , 治 “ 痛肿疮毒 ” ; 王瓜作抗癌药物则见 《名
医别录 》 ; “ 疗诸邪气热结 , 散痈肿留血 ” 。 夭花粉于 1 9 8 7年制成 `嘎方夭仙丸” ; , 经 2 0多
收稿日期 : 1 9 8 9一 1 0一 2 1
州与文和万江欣为本校 8 届毕 丛仁生 ; . 余黄冉阳为 86 届毕业生
个医疗单位对 27 8例消化道官雇临床观察有效率达1 8%。 王 )氏至今 长见大规漠应用于 临 床 ,
但有报道王瓜根作为鼻咽癌 、 胃癌 、 `肠癌以及其它晚期癌症的镇痛剂 3 。 无论夭花粉或王瓜
根的抗癌制剂 , 都采用 7 5 % 乙醇浸提 , 或煎服 , 或烧灰存性 , 这都会破坏葫芦素和存在葫芦
科植物中的糖蛋 自 。 由此 , 我们认为天花粉 、 王 瓜根抗癌活性物质有待进一 步证实 。 木文采
用体外培养癌细胞技术 , 筛选抗癌新药物 , 希望通过试验 , 得到抗癌活性成分的直接证据 。
1 材料 、 试剂 、 仪器
1
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1 王 瓜根为 自己种植 , 秋冬采集 , 一 20 C 低温保存备用 : 人肺腺癌细胞 , 由臀大医 学 院
病理室提供 ; 正常人胚肺成纤维细胞奋由广东省老年病研究所细胞室提封: 。
1
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2 主要试 剂有小牛血清 , 由广州燕塘畜牧公司购入 ; 1 6 4 0细胞培养基 、 E A G L E细胞培养
基 、 胰蛋白酶均为进 口分装 ; 鼠李糖 、 甘露糖 、 木糖 、 半乳糖为国产标准品 , 葡萄糖和阿拉
伯糖为进口分装 ; 硅胶 H 、 SeP h a d ex G 75 为进 口产品 ; g e a v a g e 和 sc h ; f f试剂按常规办 法 配
制 ; 电泳用 S D S和蛋 白质分子量标准品均为进 口 品 。
1
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3 主要仪器有高速冷冻离心机 , 为湘仪厂制造 ; 板电泳装置为瑞典制造 ; 紫外分光 光 度
计为日立公司制造 。
2
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]
2
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2
后 ,
用 。
2
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3
2
。
4
方法
王瓜根糖蛋白提取按前文 仁“ 三方法 。 _
王瓜根 乙醇浸提液 : 取新鲜王瓜根 1 09 切碎 , 浸入 75 % 乙醇 25 ml , 加蒸馏水 25 m l , 三夭
用外布过滤去渣 , 加入甘油 Z om l 一 , 然冶加入蒸馏水稀 释 至 4 m g厂m l , 灭 菌 , 置 冰 箱 备
王瓜根糖蛋白分级沉淀物分子量测定 , 按常规 SD S一 P A G E电泳方法进行 牡“
王瓜根糖蛋 白等电点测定 , 按 常规 IE F方法 〔 6 〕 。
2
.
5 全、主瓜根多糖的分离纯化 . 采用 Sve a g e 仁 7” ’ 法和分子筛除去蛋白质 。 其过程如下 : 取分
级沉淀王瓜根蛋 白 , 用 se v a g e试剂放在分液漏 斗中激烈振荡 , 离心 3 0 0 0 , p m ls 分钟 , 收集上
部水层 , 弃去蛋白层和有机相 , 如是重复 7次 , 直至有机相与水层之间透明 无 蛋 白 质 层 为
止 。 取丢蛋白质的水层 部分 , 用兮D S一 P A G E 电泳法查证完全除蛋白质之后 , 随即放入透 析
袋进行透析 , 连续搅拌 36 小时 , 每 6小时换蒸馏水一次 , 直 至完全除去小分子及色素 为 止 。
取出透析袋 , 埋藏在分子 髦 2 0 0 0 0的聚乙二 醇中浓缩 , 约浓缩 6倍之后 , 按 体积加入 4倍无 水
乙醇沉淀王瓜多糖 , 用 3 0 0 o r p m 离心 1 5分钟 , 沉淀物用无水 乙醇洗三次脱水后 , 用 P Z O S干燥
器抽真空千燥 , 得到黄褐色的王瓜多糖 。 按投料 12 0 9带皮王瓜鲜根 , 可获 s m g王 瓜 多 糖 干
口口口 。
取 _ L述 sm g王 瓜多糖粗品溶于 2 m l蒸馏水中 , 」: g e帅 a d o x G 75 柱 ( 1 . 5 火 5] 〔 m l ) , 用蒸馏
水洗脱 , 、流速为 0 . 3班 ! n/ im , 用蕙酮法检测多糖部分 , 发现多糖集中在第 1 4一 20 管 , 集 中得
到 1天 6 m l纯化的王瓜多糖溶液 。
2
.
6 王瓜多糖的鉴定 二” 一 ’ 2 二 , 我们采用纸层析和硅胶簿层 层析两种方法相互引证 , 多 糖 首
先经过酸水解 , 具体方法如下 : 取 上述 1 7 . 6ml 王瓜多糖溶液 , 加入 浓 硫 酸 l m l , 放在 10 ℃
水浴 中水解 3小时 , 然后加入饱和 l m o l / L B a ( O H ) : 水溶液 , 离心除去 B a SO 、 沉淀 , 上清液放
入沸水浴 中蒸发除去水分至 Zm l , 存放 4℃的冰箱各用 。
8 0
纸层析采用新华 1号滤纸上行法 , !灵层剂采 用正丁醉 : 毗 咤 : 水一 3 : l : ! . 5系 统 。 ’层
析 10 小时 , 用硝酸银显色 。
硅胶簿层层析采用硅胶 H 径向层析 : 取 s x 15 c m 玻璃板 , 洗净后烘千 , 放 在 水 平 台 而
上 。 称取 g4 硅胶 H , 研 钵 磨 碎 , 加入 O。 5% C M C 1 3 . 6 m l , 再加入 20 滴 95 % 乙醇 , 研 磨 10 分
钟 , 即成均匀浆糊状 , 铺板 , 稍候巧分钟 , 放 10 5 c 烘箱中活化 30 分钟 , 板层厚约为 0 . 25 m m
展层剂采用乙酸乙酚 : 甲醉 : 乙酸 : 水 二 12 : 3 : 3 : 2系统 , 显色剂采用苯胺一二苯胺磷酸试
剂喷雾后于 85 ℃烘烤 10 分钟 , 各种糖显出不 同颜色 : 鼠李糖显橙黄色 , 甘露糖显绿色 , 木糖
和半乳糖显兰色 , 葡萄糖显兰紫色等等 。
2
.
7 王瓜根原汁及王瓜根糖蛋白杀伤癌细胞试验 。 取人肺腺癌细胞 , 用 6] 切培养基培养 , 添
加2 %小牛血清 、 双抗 , 37 ℃恒温箱培养 , 将生长成单层的肿瘤细胞用 0 . 4% 胰酶消化 2 ~ 3 分
钟 , 均匀分装成 3 瓶 。 培养 2 4小时之后 , 弃旧培养液 , 加入含不 同浓度药注 ( 下 瓜 限 原 汁
和王 瓜根糖蛋 白 ) , 继续培养 4 8小时 , 进 行细胞计数 , 统计杀 i’h 率 。
杀伤百分率 ~ (对照组癌细胞数 / m l) 一 (实验组癌细吻数
` 。 1)
对照组癌细胞数 / m l
又 1 0 0%
正常人胚肺成纤维细胞 , 按上述癌细胞培养方法培养和统计杀伤百分率 。
2
.
8 电镜连续观察 , 从培养瓶中定 时 取 出小飞片 , 即 梦、 培 牛2 4小时 、 3 2小时 、 4 0小 时 、
4 8小时的培养瓶中各取出二片小飞片 , 放在 H a 二 k s液中漂洗数次 , 用戊二醛固定 , 脱水 , 再
用醋酸正戊醋处理 、 干燥 、 喷金 , 观察拍 片 。
2
.
9 H E染色光镜观察 , 按上述方法定期从培养瓶中取出小飞片 , 在日 a 、: ls< 液中漂洗数次 ,
用 B 。 ” 弓” 氏液固定 , H E 染色 , 脱水干燥 , 观察拍 片 。
3 结果
3
.
1 王瓜根糖蛋 白进行 S D s一 P A G E 电泳 , 每次电泳结果略有差异 , 经反复多 次 试 驮 , 仍
步证实王瓜根糖蛋 白主要有两种成分 : 即分子量为 6 . 76 又 1 0 雄道尔顿的 酸性蛋 白和分子量 为
1
.
58 义 1 0 ` 道尔顿的碱性蛋白 。 但王瓜根糖蛋 白很不稳定 , 即使 在常温也很快降解成多个 片
段 , 其分子量分另lJ是 4 2 0 0 0 、 2 4 0 0 、 1 9 70 0和 1 7 8 0 0道尔顿 , 见图 } 。 夏冬两季采集的王瓜根
其糖蛋 白也略有差异 , 一般以秋冬季含量较高 , 这提示药用价值较好。 _ 「 ` 一 ’
3
.
2 主瓜根糖蛋 白的等 电点聚焦电泳可以明显地得出酸性塘蛋 白与碱性糖蛋 白的区带 ,如图
2所示 。这显示 王 瓜根糖蛋白的组成比较简单 。 其酸性蛋白的等 电点是 P I 3 ` 2 ; 其碱性蛋白 的
等电点1P .93
。 _
:
.
3 王瓜根多糖的鉴定结果姐图 3所示 . 从显色及 R王两个方而考虑 , 王瓜根多糖含半乳糖 ;
但另一种单糖的 fR 值近木糖 ,故拟为 木糖 。 径向硅胶簿层层析显示 了同样结果 , 从层析斑点
显色与 R f值比较的结果 , 王瓜根多糖中含木糖的可能性进一步得到证实 。 , 分别见图 3和图 3, 。
3
. “ 王瓜根酸性蛋白对肺 腺癌细胞的作用相当明显 , 尤其是细袍的外部形态即使在 普 通 光
境条件下放大 3 0 0 0倍也能看到显著变 化 。但 王瓜根原汁的作用更为显著 。 现分另lJ用电子 显微
精连续观察拍片与光镜结合 H E染色 , 连续观察拍片说 明如图 J 。



4 讨论
根据实验结果 , 刊步证明王瓜根原汁存在抗肺腺癌细胞作 旧 , 其杀伤率与王瓜根原汁的
新鲜度有关 , 这提示药物有效成分并不十分稳定 ; 其次是与别昼有关 , 随着剂量增大而杀伤
率增加 。
实验又初步证实王瓜根的糖蛋白有杀伤肺腺癌细胞作用 , 其中酸性蛋白较为明显 , 但不
及原 汁 , 这提示王瓜根抗癌有效成分可。能不只一种 。
据抗癌木草 一 3 称王瓜根抗癌有效成分是葫芦素 , 而天花粉抗癌有效成分是糖 蛋 白 。 其
中糖蛋白的 作用有较 多的论证 ’ 3 一 ’ 5 ; 葫芦素的抗癌作用至今尚缺 艺直接论据 , 很值 得 进
一步深入研究 。
葫芦素属四环三帖类 ’ 目 , 或称之为三菇皂试 、 ’ 月 。 据国外研究报导菇类化合物具有不
少显著抗肿瘤活性成分 ` ’ 7 ,其抗癌作用包括对鼻咽癌 、 于仕 ’ a 细胞 、 艾 氏腹水癌 、 w al k e 、 v 肉
噜 , 小鼠白血病 P一 。8 等。 同时 ,砧类化屠物的水解产物呈现抗菌和细胞毒的活性 , 这提示
王 瓜和天花粉类的有效抗癌制剂可能是三菇皂试的水解产物作用 ’ “ 一’ , 因为 在 制 剂 中 , 糖
蛋白遭到破坏是无疑的了 , 只有糖蛋 白的针剂才真正是糖蛋白的作用 。 由于过去混为一谈 ,
故有误用的可能 。
至于作用的靶位 , 可以从电镜连续观察拍片得到初步了解 : ’ 王瓜根原汁或酸性蛋 白对肺
腺癌细胞表面的微绒毛没有明显的作用 , 可见药物作用靶位不在细胞膜 ; 相反 , 一可以好容易
发现靶细胞的 变形 、 发生内陷现象 , 说明药物的作用在于靶细胞内部染色体 。 其次 , 我们还
可以观察靶细胞的核中出现空泡 . 进而发生靶细胞溶解并放出大量颗粒 。 药物的作用与细胞
处于分裂期更敏感一些 , 这都证明药物叩作用与染色体有关 。
最近国外文献报导木聚糖有较显著的抗癌活性 , 对鼻咽癌有效 ’ 日 并有较强的抑制癌细
胞的 代谢作用 “ 。 , 这一点与糖蛋 ,白中的本糖是否相关乡有待进一步探讨 。
参 考 文 献
吴泊良等 . 暨南理医学报 , 1 9 5 7 ; l : 1 0 7一 1 1 2
吴伯 良等 。 暨南理医学报 , 1 9 8 8 ; 3 : 80 一 85 ’
常故毅 . 抗癌本草 . 湖南科学出版社 , 1 9 8 7
李时 :tJ . 木草纲 目 . 上海商务印书馆 , 195 1
P }l a r m a e i a F i n e C ll e rn i e a ] s
.
P o l y a e a r y l a m id e G e l E l e e 才r o p h o : e s : 5 l a l; o : a 飞o r y
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, P : I n z e d i n S w e P e n b y R a 卜m s l L u o d J t l , l e 1 9 8 0
P h a r m a e ; a F i n e C h e m i e a l s
.
Js e e ] e e士r i e F o e u s i n g P r j n e i p l e s & M e t ll c d s , P : -
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, 1
9、 、 e d 。 。 b y l i t , , l g f。 ,
·
e l a g e n A B
, O ,
一
e l) 1 0 : 。 P , 1 9 8 2一 1
S l a , 、 b A 入I 。 M 。 }卜。 d s i: · ’ C a r b o h了d ,: C卜。 m , 1 9 C5 ; 5 : 5
8 田庚元 等 .生物化学与生物物理学报 , 1 9 8 5 ; 1 7 : 5 8 2~ 5 8 6
9 肖崇厚 。 中草药提取鉴定原理 . 上海科技出版社 , 1 9 8 3
10 北京医学院等 . 中草药成分化学 . 北京人民卫生出版社 , 1 9 8 5
n 沙世炎等奋中草药有效成分分析 . 上册 , 北京人民卫生出版社 , 1 9 8 5
12 中国科学院药物研究所 . 薄层层离及其在中草药分析中的应用 . 北京 : 科学出版社 ,
1 9 8 7
13 杨今祥 . 抗癌中草药制剂 。 北京人民卫生出版社 , 1 9 8 4
14 王辉武等 . 中药新用 . 科学技术文献出版社重庆分社 , 1 9 7 6
15 马卓隆 . 抗癌中草药秘方 . 台南新时代映版社
16 南京药学院中草药学编写组 . 中草药学 . 江苏科学出版社 , 1 9 8 7
1 7 K t一1: e h a n 5 M . R e e e n t A d v a , l e e s i n p l z y t o e }z e m i s l r y . N e W Y o r k一 L o 一l d o l l :
P l e n u m P x e s s
, 19 7 5
18 1
. 瓦格纳等 ( 西德 ) , 中国科学院上海药物研究所译 . 生物活性天然产物 . 北京 :
科学出 J饭社 , 1 9 8 1
1 9 K u p e h a n M S
, e t a l
.
S l e g a
n
i e a n a
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,
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.
1 9 7 3 ; 9 5
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