全 文 ： 药理药化
收稿日期:2005-01-31;　修订日期:2005-07-06作者简介:胡　卫(1977-),女(汉族),湖北通城人 ,现任三峡大学医学院教师 ,硕士学位 ,主要从事中药治疗肝癌的实验研究工作.
珠子参抑制小鼠肝癌及诱导细胞凋亡的研究
胡　卫 , 陈　涛
(三峡大学医学院 ,湖北 宜昌　443002)
摘要:目的:观察珠子参对小鼠 H22肝癌的抑制作用及其机理。方法:建立小鼠肝癌实体瘤和腹水瘤模型 , 观察珠子参对
荷瘤小鼠抑瘤率和生命延长率 , 放免法(RIA)检测实体瘤小鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量 , 流式细胞仪技术
(FCM)检测肿瘤细胞凋亡并进行周期分析。结果:珠子参能显著抑制肿瘤生长 ,抑瘤率达 44. 89%,且能明显延长荷瘤小
鼠生命;珠子参组小鼠血清中 TNF-α浓度高于正常对照组 , 而比模型对照组低(P<0. 05);FCM 分析显示 , 珠子参各组
G 0 /G 1 期和 S 期细胞(%)减少 , 而 G2 /M 期细胞和凋亡细胞(%)增加。结论:珠子参对 H22肝癌小鼠具有良好的抑瘤作
用 ,其作用机制可能与珠子参阻止 G 2 /M 期细胞转换而影响癌细胞在细胞周期中的进程 ,干扰 S 期 DNA 合成以及诱导
小鼠肝癌细胞凋亡有关;此外珠子参能明显抑制荷瘤小鼠 TNF-α水平的异常增高 ,使其维持在一定水平而发挥抗肿瘤 、
调节机体免疫力等作用。
关键词:珠子参;　肝癌 H 22细胞株;　凋亡;　肿瘤坏死因子
中图分类号:R285. 5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2005)10-封 3-02
Studies of PJ on Inhibition of Proliferation of H22 Cell in mice and Induction of Apoptosis
HU Wei , CH EN Tao
(Medical Col lege o f Three Gorges Universi ty , Yichang , Hubei 443002 , China)
Abstract:Objective:To obser ve the anticancer action of Panax japlcus var (PJ) on mice live r cance r and its mechanism.
Methods:Mouse models of the solid tumo r o f liv er cance r and ascitic liver cancer wer e established. The inhibito ry ra te of
so lid tumo r and the life pr olongation rate we re obse rved. The ce ll cy cle and apoptosis of the cells w ere measur ed by F low
Cy tometr y (FCM). Radioimmunoa ssay (RIA) examined the content of TNF-αin se rum. Results:PJ could obviously inhibit
the g row th o f tumo r , the life o f ascitic cancer bearing mice w as also pr olonged. FCM analy sis show ed:PJ could decrea se
the number of cells in G0 /G 1 and S phase and increase the numbe r o f cells in G2 /M phase and apopto sis cells . The content
of TNF -αin serum of PJ g roup w as highe r than tha t of normal control g roup , but low er than that o f model contro l g roup.
Conclusion:PJ could suppress live r cancer in mice. The anticancer mechanism was probably a ssocia ted with the arre stment
of cell cy cle f rom G2 /M phase to G1 pha se transitio n , interference o f DNA synthesis in S phase , and the induction o f canc-
er cell apopto sis. Besides , PJ could inhibit the abnorma l eleva tion of TNF-αo f tumo r-bearing mice , and TNF-αw ould
maintain at a ce rtain lev el to take the effect in antitumor and regulation o f immunity .
Key words:Panax japlcus va r (PJ);　Hepatocarcinoma 22 cell line;　Apoptosis;　TNF-α
　　珠子参 Pana x japlcus var , major(Burk)C. Y. Wuetk. M .
Feng , 为五加科人参属植物 ,具有活血散瘀 、补血止血 、消肿止痛
之功。20 世纪 80 年代以来对其有效成分和药理作用开展了研
究 ,但珠子参在治疗肿瘤方面的报道尚属空白。根据珠子参民间
应用的经验及其成分和药理作用的分析 ,我们率先开展了珠子参
抗肿瘤作用的实验研究 ,结果显示该药具有较好的抑瘤功效。在
珠子参治疗肝癌的实验中 ,观察到珠子参对体外培养的人肝癌细
胞(SMMC-7721)有良好的抑制作用 ,并且形态学观察显示该药
能明显诱导肝癌细胞凋亡。在此基础上 ,我们进一步研究了珠子
参对肝癌 H22荷瘤小鼠的抑瘤效应和诱导肝癌细胞凋亡的作用 ,
并通过分析细胞周期来揭示其抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细
胞凋亡的可能机理。
1　材料
1. 1　实验动物与细胞株 昆明种封闭群小鼠:雄性 , 质量(22±2)
g , 共110 只。购自湖北省实验动物中心。(许可证号:SCXK(鄂)
2003 - 0005)
H22细胞株:华中科技大学同济医学院药学系曾凡波老师惠
赠 ,接种于 Km 小鼠腹腔内传代保。
1. 2　主要药品与试剂 珠子参 :购于宜昌市久康药房 , 经宜昌市
药检所鉴定;产地:神农架;批号:200201
5-氟尿嘧啶(5-FU)(天津氨基酸公司人民制药厂):针剂 ,
250mg /支 ,灭菌生理盐水稀释至一定浓度 , 避光常温保存 , 用作
阳性对照物。
肿瘤坏死因子(TNF-α)放免分析药盒:购自北京北方生物技
术研究所;Coulter DNA-Prep Reagents K it:购自 coulter公司 , 批
号:760204K 。
1. 3　主要仪器 DFM-96 型 10 管放射免疫计数器;流式细胞仪
(EPICS 型):美国 Beckman coulter 公司;自动平衡离心机
(LDZ5-2型):北京医用离心机厂;电子天平(M P200A 型):上海
良平仪器厂。
2　方法与结果
2　药物和小鼠肿瘤模型制备
2. 1. 1　药物制备 珠子参水煎液:珠子参根茎烘干称重 ,研磨成
粗粉 ,装入圆底烧瓶内加 10 倍体积蒸馏水浸泡 2 h , 然后将圆底
烧瓶置于电子恒温水浴锅中 , 恒温 80℃加热 8 h 后 , 中性滤纸过
滤后弃掉药渣 ,将所得的药液进一步浓缩至终浓度为 0. 66 g /m l
(即 1 ml药液中含原生药 0. 66 g)。分装于灭菌试管 , 4℃冰箱保
存备用。
5-FU:在超净工作台避光条件下 , 无菌生理盐水稀释 5-FU
针剂至 2. 5 mg /ml后分装于 EP 管并用锡纸遮盖保存于 4℃
冰箱。
2. 1. 2　动物模型的制作 实体瘤:肝癌 H22细胞株昆明小鼠体内
连续传代 3 代后 , 抽取接种 7 d 左右种鼠腹水 , 呈乳白色 , D-
Hanks 液洗涤离心(800 r /min×5 min)3 次 ,调整细胞浓度至1. 0
×107 个 /ml ,台盼蓝拒染法检测存活率≥95%, 将细胞悬液注射
至健康小鼠右腋皮下 , 每鼠 0. 2 ml。全程严格无菌操作 , 40 min
内完成。(腹水瘤为细胞悬液注入腹腔)
2. 1. 3　动物分组及给药 昆明小鼠分笼饲养 , 自由摄食与饮水。
造模后随机分组:模型组 , 模型+珠子参组(简称珠子参组), 模型
+ 5-FU 组(简称 5-FU 组),珠子参组又分为高浓度和低浓度两
组。造模后第 2 天起 ,珠子参高浓度组每只小鼠按 10 g /kg 体重
灌胃给药 ,珠子参低浓度组每只小鼠按 5 g 生药 /kg 体重灌胃给
药 ,连续 10 d;同时给予模型对照组和 5-FU 组每只小鼠分别灌
胃等体积生理盐水。 5-FU 组每只小鼠按 0. 5 mg /20 g 体重腹腔
注射给药 ,连续 5 d;同时给予模型对照组和珠子参各组每只小鼠
腹腔注射等体积生理盐水。
2. 2　对小鼠肝癌实体瘤的抑制作用 抑瘤率和胸腺指数给药结
束后第 2天 ,称重后摘除眼球法取血处死小鼠 , 完整剥离肿瘤组
织和胸腺 ,电子天平称重 , 计算抑瘤率和胸腺指数。
抑瘤率=(1 - 实验组肿瘤质量模型组肿瘤质量)×100%　胸腺指数=胸腺质量(mg)小鼠质量(g) ×10
结果如表 1 , 表 2。与模型对照组相比 , 珠子参各组和 5-FU
组小鼠平均肿瘤重量均显著降低(P <0. 01);与模型对照组相
比 ,珠子参各组小鼠胸腺平均重量和胸腺指数均高于模型对照
组;与 5-FU 组比较 ,珠子参组平均胸腺重量和胸腺指数均高 , 且
结果有显著差异(P<0. 01 或 P<0. 05)
表 1　珠子参对 H 22荷瘤小鼠瘤重的影响( x±s)
组　别 n 肿瘤重量 m / g 抑瘤率(%)
模型对照 12 2. 699 0±0. 904 1 　　
5-FU 12 　1. 561 8±0. 191 7** 42. 14
高浓度 12 　1. 487 3±0. 519 1** 44. 89
低浓度 12 　1. 665 4±0. 963 0** 38. 28
　　与模型对照组比较 , **P<0. 01
表 2　珠子参对 H 22荷瘤小鼠胸腺重量和胸腺指数的影响( x±s)
组　别 n 胸腺重量 m /mg 胸腺指数 C/ 10 mg g-1
模型对照 12 61. 82±12. 26 23. 51±6. 05
5-FU 12 59. 51±24. 74 21. 81±11. 83
低浓度 12 80. 25±15. 73*△△ 33. 65±11. 72*△△
高浓度 12 74. 18±20. 51 31. 74±12. 82△
　　与模型对照组比较 , *P<0. 05;与 5-FU 组比较 , △P<0. 05 , △△P<0. 01
2. 3　对腹水型肝癌小鼠生命延长的作用 生命延长率从造模之
日起记录小鼠生存天数 ,计算各组小鼠生命延长率( ILS)。只统
计接种后生存至取腹水检查后的小鼠。
ILS=(治疗组平均生存天数-对照组平均生存天数对照组平均生存天数 )×100%
结果见表 3 , 珠子参高 、低浓度能不同程度延长肝癌腹水瘤
小鼠的生存期 ,与模型对照组相比 , 结果有统计学差异。
表 3　珠子参对荷腹水瘤小鼠生存天数的影响( x±s)
组　别 n 平均存活时间 /d ILS(%)
模型对照 10 14. 60±1. 61
5 - FU 10 18. 00±1. 65** 23. 29
P J高浓度 10 18. 40±1. 74** 26. 03
P J低浓度 10 19. 05±2. 53** 30. 48
　　与模型对照组比较 , **P<0. 01
表 4　珠子参对荷瘤小鼠血清 T NF -α的影响( x±s)
组　别 n 血清 TNF-α
/fmol ml - 1
模型对照 8 15. 312 3±3. 451 3
正常对照 8 10. 966 1±1. 1565
5 - FU 10 13. 131 0±2. 333 3*
高浓度 6 12. 146 3±2. 348 9*
低浓度 12 12. 893 1±1. 096 0*
　　与模型对照组比较:*P<0. 05
表 5　珠子参对肿瘤细胞周期和凋亡的影响
组　别 n G0 /G1 S G2 /M Apopto sis(%)
模型对照 7 36. 59±2. 61 52. 46±2. 76 10. 96±2. 75 9. 45±0. 14
5 - FU 8 36. 80±6. 66 42. 28±5. 74 20. 92±8. 16 12. 87±0. 11
高浓度 9 33. 78±6. 12 50. 48±3. 28 15. 73±6. 91 27. 69±0. 21
低浓度 9 35. 73±5. 90 42. 51±9. 85 21. 76±7. 02 26. 88±1. 22
2. 4　TNF-α活性检测 RIA 法检测小鼠血清中 TNF-α浓度:实
体瘤小鼠摘除眼球取血 , 37℃孵育促凝血 , 1 500 r /min 离心数次
至血清析出 ,取上清送至第一临床医学院放免科检测。 结果见
表 4。与正常对照组相比 , 珠子参组和 5-FU 组血清 TNF-α水平
升高 ,但无统计学差异 , 而模型对照组血清 TNF-α水平显著高于
其他各组(P<0. 05)。
2. 5　流式细胞仪检测细胞 DNA 含量并进行周期分析 取各组
小鼠腹水细胞 ,离心(800 r /min×5 min)洗涤 3 次 , 调整细胞浓度
为 1×106个 /ml , 4℃70%的乙醇固定 30 min , 用含 Rnase及碘化
丙啶(P I)染色液染 30 min 后上流式细胞仪检测 DNA 含量的变
化 ,并用 Multicy cle软件分析细胞周期变化。 表 5 的结果显示:
珠子参能诱导肝癌细胞凋亡 ,其中珠子参高浓度组诱导的细胞凋
亡率最高。模型对照组细胞的凋亡为肿瘤细胞自发的凋亡。从
周期分析结果可以看出 , 珠子参可使 G 2-M 期细胞聚积 , 阻止了
M - G1期的转换 , 从而干扰了小鼠肝癌 H 22细胞在细胞周期中
的进程。同时 ,珠子参能使 S 期细胞减少 ,可能与干扰了癌细胞
DNA 合成有关。
3　讨论
原发性肝癌(简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一 , 是目前实
体瘤中预后较差的恶性肿瘤 ,且缺乏有效的治疗方法和手段。为
此 ,开展中医药诊治肝癌的研究 , 研制和开发治疗肝癌的高效低
毒药物 ,具有重要的意义。
本研究结果显示 ,珠子参在 5g 生药 /kg 和 10g 生药 /kg 剂量
下灌胃给药 ,对小鼠移植性肝癌实体瘤具有较好的抑瘤效果 , 光
镜下肿瘤细胞周围较多见淋巴细胞浸润 , 而且对腹水瘤小鼠具有
延长生存期的作用。其作用机理可能与珠子参诱导肝癌细胞凋
亡和影响细胞周期以及调节 TNF -α水平有关。
细胞凋亡是在一定的生理或病理条件下 , 细胞受到某种信号
的触发后主动参与并遵循一定程序的死亡过程 , 在整个过程中发
生一系列特殊基因的改变及生化 、形态特征的改变。肝癌细胞的
凋亡在肝癌的发生发展 , 转归及治疗等方面发挥着重要的作用。
珠子参诱导肝癌细胞凋亡可能与其细胞毒作用一起发挥抗癌效
应。周期分析结果表明:珠子参可使 G 2 /M 期细胞聚积 , 阻止了
M /G 1 期的转换 ,从而干扰了小鼠肝癌 H 22 细胞在细胞周期中
的进程。同时 ,珠子参能使 S 期细胞减少 ,可能与干扰了癌细胞
DNA 合成有关。
TNF-α主要产生于单核巨噬细胞 , 具有抗肿瘤 、抗病毒及免
疫调节等广泛的生物学效应。但 TNF-α的生物学作用与其体内
的水平高低密切相关 , 临床上实体瘤患者血清 TNF-α水平异常
升高 ,会严重破坏细胞因子之间正向的协调作用 , 造成细胞因子
网络功能紊乱 ,并可引起脂肪降解 、血管渗漏 、内源性致热等病理
损伤。本次实验结果显示:珠子参组 TNF-α水平高于正常组与5
- Fu 组 , 但显著低于模型组 , 表明珠子参具有抑制荷瘤机体
TNF-α水平异常升高的作用 , 使其维持在一定水平而发挥抗肿
瘤 、调节机体免疫功能等积极作用 ,至于其最佳水平范围则有待
进一步探明。
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