全 文 ：蓄冬华人浓礴乙杂志⑨
l w c d@州 n ge t, e o m g
世界华人消化杂志 20 。饰8月28 日 ; 15( 24 :) 25 9-7 26 01
IS N 1 0 0 9
一
3 079 C N 1 4
一
12 60 / R
基神研究 B A sI C 邢SEA RC H
珠子参对小鼠日2 2肝癌抑制作用及机制
陈 涛 , 胡 卫 , 崔帮平 , 黎家华
陈涛 , 胡卫 , 三峡大学医学院 中医系湖北省宜昌市 4 3() 02
崔帮平 三峡大学第一临床医学院核 医学科 湖 北省宜昌市
44 3 ( ) ( ) ( )
黎家华 , 三峡大学医学院形 态学部 湖北省宜昌市 4 , t )2
陈涛 , 北京中医药大学博士 教授 主要从事中医药抗肿瘤研究 .
湖北省 自然科学基金资助项 目 , N o . 20 06 BA A 2() 。通讯作者: 陈涛 . 4 3 0 0 2 湖北省宜昌市大学路8号 三峡大学医
学院中医系 . e h e n t a o @ e tg u e d u e n
电话: 0 7 1 7 一 6 3 9 7 3 7 8 传真 : 0 7 1 7 一6 3 9 7 3 2 8
收稿日朋: 2 0 0 7 一 0 1 一 2 2 修回日斯 : 2 0 0 7 一 0 8 一 2 3
尸. n ax ia P IC us va r i n h i b i t i o n
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33
.
78 % 土 6 . 12 % 。 5 3 6 . 5 9% 士 2 . 6 1% ) a n d 5 Ph a s e
(4 2
.
5 1 % 士 9 . 8 5 % , 5 0 . 4 8% 土 3 . 2 8% v s 5 2 . 4 6% 士
2
.
7 6% )
, a n d i n e r e a s e d t h e n u m b
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.
76% 士 7 · 02% , 1 5 . 7 3% 士 6 . 91 % v ,
10月6% 士 2 . 75 % , b o t h P < 0 . 0 1 ) a n d th e n u m b e r
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8 8% 士 1
.
2 %
,
2 7
.
6 9% 士 0 2 1%
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.
4 5% 士 0 . 1 4 % , b o t h P < 0 . 0 1 )
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T h e s e r u m
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8 9 士
1
.
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T r a n s m i s s i o n e l e e tr o n m i
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.
. 管滋资料
原发性肝癌是最
常见 的恶 性肿瘤
之一 , 研制和开发
治 疗肝癌的高效
低毒药物 , 具有
重要的意义 . 珠子
参为五加科人参
属植物 大 叶 三七
或 羽 叶三 七 的 串
珠状根茎 , 具有活
血散瘫 、 补血止
血 、 消肿止 痛之
功 . 但珠子参在治
疗肿瘤 方 面 的报
道尚属空白 .
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e o Py w e r e u s e d t o o b s e r v e c y t o m o r Ph o l o g i c a l
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·
摘要
目的 : 观察珠子参对小 鼠移植性肝癌 ( H动的
增殖抑制作用及其作用机制 .
R E S U LT S
: L o w a n d h i g h e o n c e n t r a ti o n o f p J
o b v i o u s l y i n h i b i t e d t u m
o r gr o w t h
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PJ d e c r e a s e d
t h e n u m b
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(3 5
.
7 3% 土 5 . 9 0% ,
方法 二建立 H 2 2小 鼠肝癌实体瘤模型 , 观察珠
子参对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 , 放免法
(RI )A检测血清中肿瘤坏死因子 ( T N F卜a 含量 ,
光镜 (H E染色)观察肿瘤细胞生长增殖状态 , 并
在透射电镜下观察肿瘤细胞超微结构形态 , 流
式细胞仪技术 (F c M )检测细胞凋亡并进行周
期分析 .
洲洲以 呵如以 `口厅 ,
2 59 8巧 S N 19 0 0一 3 079 C4 N 1一 12 0 6/ R世界华人 i肖化杂志 2 0 07年 8月 2 8日 第 5 1卷 第 2 4期
.相 吴推道
近年来 , 有关中药
诱导肝癌细胞凋
亡的 研究报道逐
年增 多. 珠子参诱
导肝癌细 胞凋 亡
可能与其细胞毒
作 用一 起发挥抗
癌效应 .
结果 二与模型对照组相 比 , 珠子参低浓度和高
浓度组和 5一 F U 组小鼠平均肿瘤质量均显著降
低 ( 1 . 66士 0 . 96 9 , 1 . 4 9士 0 . 5 2 9 , 1 . 56士 0 . 19 9 峪
2
.
70 士 0 . 90 9 , 均尸< 0 . 01 ) ; 珠子参低浓度和 高
浓度组 小鼠胸腺平均质量和胸腺指数均高于
模型对照组 (胸腺平均质量 : 74 . 18士 20 . 51 m g,
80
.
2 5士 15 . 7 3 m g 好 6 1 . 8 2士 12 . 26 m g , >P 0
.
0 5
,
尸 < 0 . 0 ;5 胸腺指数 : 3 . 17 士 1 . 28 m g/ g , 3 . 36 士
1
.
17 m g /9 F s 2
.
3 5士 0 . 6 0 m g /g ) ; 与 5 一 F U组
( 5 9
.
5 1士 2 4 . 7 4 m g , 2 . 1 5士 1 . 1 8 m g /g )比较 , 珠子
参高浓度组平均胸腺质量和胸腺指数均增高 ,
且结果有显著差异 (均P< o . ol ;) 血清中T N F一 a
浓度珠子参低浓度和高浓度组高于正常对照
组 ( 12 . 8 9士 1 . 1 0 P m o l /L , 1 2 . 15士 2 . 3 5 p m o l / L
峪 10 . 9 7 士 1 . 16 p m o l / L ) , 而 比模型对照组低
( 15
.
3 1士 3 . 4 5 p m o l /L , 均P< o
.
o s ) : 光镜观察到
珠子参组小鼠肿瘤组织 周围有大量的吞噬细
胞和淋 巴细胞浸润 , 电镜下可见珠子参组癌细
胞胞质浓染 , 核 固缩 , 线粒体明显减少 ; F C M
分析显示 , 珠子参低浓度和高浓度组与模型组
相比 G。一 G l期 (3 5 . 7 3% 士 5 . 9 0% , 33 . 7 8% 士6 . 12%
。 5 3 6
.
5 9% 士 2 . 6 1% )和 S期 细胞 ( 4 2 . 5 1% 士
9
.
8 5%
,
5 0
.
4 8% 士 3 . 2 8% 。 5 2 . 4 6% 士2 . 7 6% )减
少 , 而 G Z一M期细胞 (2 1 . 7 6% 士 7 . 0 2% , 15 . 73%士
6
.
9 1% vs 10
.
%% 士 2 . 7 5% , 均P< O
.
ol )和凋亡细
胞 ( 2 6 . 8 8% 士 1 . 2 2% , 2 7 . 69% 士 0 . 2 1% 二 9 . 4 5%
士 0 . 14% , 均P< O
.
01 )增加 .
子参在治疗肿瘤方面的报道 尚属空 白. 根据珠
子参 民间应用的经验及其成分和药理作用的分
析 , 我们率先开展了珠子参抗肿瘤作用的实验
研究 , 结果显示该药具有较好的抑瘤功效 . 在珠
子参治疗肝癌的实验中 , 观察到珠子参对体外
培养的人肝癌细胞 (S M M C 一 7 721 )有良好的抑制
作用 3[] , 并且形态学观察显示该药能明显诱导肝
癌细胞凋亡 . 在此基础上 , 我们进一步研究了珠
子参对肝癌 H 2 荷瘤小鼠的抑瘤效应和诱导肝癌
细胞凋亡的作用 , 并通过分析细胞周期来揭示
其抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡的可
能机制 .
结论二珠子参对 H 2 肝癌小 鼠具有良好的抑瘤
作用 , 其作用机制 可能与珠子参阻止 G Z一 M期
细胞转换而影响癌细胞在细胞周期中的进程 ,
干扰 S期 D N A 合成 以及诱导小鼠肝癌细胞凋
亡有关 .
关键词 : 珠子参 ; 肝癌 H 2细胞株 ; 肿瘤坏死因子端
细胞周期
陈涛 , 胡卫 , 崔帮平 黎家华 珠子参对小鼠日2肝癌抑制作用及
机制 . 世界华人消化杂志 2 0 0 7门5 (2 4 ): 2 5 9 7 一 2 6 0 1
ht P :刀叭八切四 .wj g n e t名o m / 1 0 0 9 一 3 07 9 / 1 5 /2 5 9 7 . a s P
O 引言
原发性肝癌 (简称肝癌 )是最常见的恶性肿瘤之
一 , 开展中医药诊治肝癌的研究 , 研制和开发治
疗肝癌的高效低毒药物 , 具有重要的意义 [’ ] . 珠
子参阴幼a 尤 .声沪念us 盯 , m aj or (B ukr )C . Y wu e .kt
M
.
F e n g] 为五加科人参属植物大叶三七或羽
叶三七的串珠状根茎 , 具有活血散癖 、 补血止
血 、 消肿止痛之功 2[] . 二十世纪八 、 九十年代以
来对其有效成分和药理作用开展了研究 , 但珠
1 材料和方法
1
.
1 材料 昆明种封闭群小鼠: 占, 体质量 2 2士 2
g
, 共 60 只 . 购自湖北省实验动物中心 (许可证 号:
s e x K (鄂 ) 2 00 3一 00 0 5 ) . H 2 2细胞株 : 华中科技大学
同济医学院药学系曾凡波老师惠赠 , 接种于K m
小鼠腹腔内传代保存 . 珠子参购于宜昌市久康
药房 , 经宜昌市药检所鉴定 , 产地 : 神农架 ; 批号 :
20 02
一
01
.
5
一氟尿嚓陡 (5 一 F u )( 天津氨基酸公司人
民制药厂:) 针剂 , 2 50 m 留支 , 灭菌生理盐水稀释
至一定浓度 , 避光常温保存 , 用作阳性对照物 . 肿
瘤坏死因子 (T N F一 a) 放免分析药盒 : 购自北京北
方生物技术研究所 . C o u l t e r D N A 一p r e p R e a g e n t s
K i t : 购 自C o u l t e r公司 , 批号 : 7 60 2 0 4K . D F M 一 9 6
型 10 管放射免疫Y计数器 ; 透射电子显微镜 : 日
立 H 一 75 0 0 ; 流式细胞仪 (E P Ie s型 ) : 美国B e ekm a n
c o u l t e r公司 ; 自动平衡离心机 (L D Z s 一 2型 ) : 北京
医用离心机厂 ; 电子天平 (M P 2 0 A型 ) : 一卜海 良平
仪器厂 .
珠子参根茎烘干称质量 , 研磨成粗粉 , 装入
圆底烧瓶内加 10 倍体积蒸馏水浸泡 Z h , 然后将
圆底烧瓶置于电子恒温水浴锅中 , 恒温 80 ℃加热
s h后 , 中性滤纸过滤后弃掉药渣 , 将所得的药液
进一步浓缩至终浓度为6 60 叭 (即 l fnL 药液中含
原生药0 . 6 9) . 分装于灭菌试管 , 4℃冰箱保存备
用 . 5 一 F:U 在超净工作台避光条件下 , 无菌生理盐
水稀释5 一 F U针剂至2 . 5 g/ L后分装于 E P管并用锡
纸遮盖保存于4℃冰箱 .
1
.
2 方法 肝癌 H 2 2细胞株 昆明小鼠体内连续传
代3代后 , 抽取接种 7 d左右种鼠腹水 , 呈乳白色 ,
n
一
H a吐 s液洗涤离心 (8 0 0 r/ m i n X 5 m in )3次 , 调整
细胞浓度至 1 . o x lo ’ “ 个 L/ , 台盼蓝拒染法检测
存活率 ) 95 % , 将细胞悬液注射至健康小鼠右腋
皮下 , 每只鼠.0 2 m L . 全程严格无菌操作 , 40 m in
“邝 f 叼试叱否门.et C O n 7
陈涛 等 .珠子参对小鼠日 2 2肝癌抑制作用及机制 259 9
分组
模型对照
5一 F U
P J高浓度组
P J低浓度组
抑瘤率限 )胸腺质最 m lg )
6 27 4. 8 9 9 6 2士 0
.
9 01 4
1 6 51 7士 0
.
19 1 7
b
1
`
8 47 2士 0石 1 9 1 b
1
.
66 53士 0习 0 3 6b
61
.
8 1 67土 1 2
.
O甘
0
一匕 8 4 2
.
1 4
4
.
8 9
38
.
28
石 08 3土 4 2.
5 200土 1 7 3 5a d
7 4
.
1 7 7 7土 0 2石 1
胸腺指数 11 0 mg /g )
23
.
0 50 6士 6
.
0 5
218 9 0 6士 1 1
.
8 3
3 3
.
6 48 4士 1 1 7 2a d
31
.
7 4 5 2士 1 2
.
8 2
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0 5沪 0 <1 0v s模型对照组 ;C P <0. 0 5, < 0 . 01 vs s一「 U组
. 创斯盘支
本文 充分挖掘民
间用药经验 , 率先
开 展了珠子参抗
肿瘤 的研 究 , 并
从直接 细胞毒作
用 、 诱 导肿瘤细
胞分化年 、 诱导
肿瘤细胞凋 亡等
几个方 面研 究其
治 疗肿瘤的机制 ,
有一定的创新性 .
内完成 . 60 只昆明小鼠分笼饲养 , 自由摄食与饮
水 . 造模后随机分组 : 模型组 , 模型+ 珠子参组 (简
称珠子参组 ) , 模型巧一 F U组 (简称 5一 F U组 ) , 珠子
参组又分为高浓度和低浓度 2组 (P J高浓度组和
PJ 低浓度组 ) , 每组 12 只小鼠. 造模后第 2天起 , PJ
高浓度组每只小鼠按 10 9生药k/ g体质量 19给药 ,
PJ 低浓度组每只小鼠按5 9生药瓜 g体质量 19给药 ,
连续 10 ;d 同时给予模型对照组和 5一 F u 组每只小
鼠分别19等体积生理盐水 . 5一 F U组每只小鼠按 25
m叭 g体质量 ip给药 , 隔天 1次 , 共 5次 ; 同时给予
模型对照组和珠子参各组每只小鼠ip等体积生
理盐水 . 造摸 7 d后 , 各组小鼠腋下均可触摸到瘤
块 , 接种成功率 10 % .
1
.
2
.
1抑瘤率和胸腺指数检测 给药结束后第 2天 ,
小鼠称重摘除眼球法取血处死 , 完整剥离肿瘤
组织和胸腺 , 电子天平称质量 , 计算抑瘤率和胸
分组
模型对照
正常对照
5一 FU
PJ 高浓度组
P J{氏浓度组
1 5
.
3 1 23 土 3
.
4 5 13
1 0
.
966 1 士 1
.
1 56 5
日
13
.
13 1 0 士 2 3 33 3 a
1 2
.
14 6 3 士 2 34 89 a
12 89 3 1士 1
.
0 96 0
.
门0
80
612
己尸丈。 . 0 5 四 模型对照组
腺指数 .
指数 二
抑瘤率 =
胸腺质量 (m g )
实验组肿瘤质量
模型组肿瘤质量 ) X 100%
, 胸腺
小鼠质量 (g) X 10
.
1
.
2
.
2 肿瘤细胞形态学改变 取各组小鼠肿瘤组
织 , 40 留L 甲醛固定 , 常规脱水 , 石蜡包埋 , 切片 ,
H E染色 , 光镜下观察肿瘤生长 、 坏死及对周围
组织的浸润等情况 . 取各组小鼠肿瘤组织 , 按电
镜标本常规处理 , 透射 电镜观察肿瘤细胞超微
结构形态 .
1
.
2
.
3 T N F
一
a 活性检测 小鼠摘除眼球取血 , 37 ℃
孵育促凝血 , 15 0 r/ m in 离心数次至血清析出 , 取
上清送至宜昌市中心医院放免科租A检测 .
1
.
2
.
4 细胞周期分析和细胞凋亡检测 取新鲜肿
瘤组织剪碎 , 用2 0 0 目过滤制备单细胞悬液 . 离
心 ( s o o r /m i n X s m i n )洗涤 3次后 , 调整细胞浓
度为 l x l护 个几 , 4 Oc 7 0 0 m U L的乙醇固定 3 0
m i n
, 用含 R n a s e及碘化丙咙 (p l )染色液染3 0 m i n
后上流式细胞仪检测 D N A 含量 的变化 , 并用
M u lt i e y e l e软件分析细胞周期变化 .
统计学处理 数据采用单因素方差分析 , 应
用 S P S S 10 . O在 PC上进行处理 .
2 结果
2
.
1 抑瘤率和胸腺指数 与模型对照组相比 , 珠子
参各组和 5一 F U组小 鼠平均肿瘤质量均显着降低
俨< 0 . 01 , 表 1) . P J高浓度组小鼠胸腺平均质量和
胸腺指数均高于模型对照组和 5 一 F u 组 (P < 0 . 05
和尸 < 0 . 01 , 表 1) . P J低浓度组小鼠胸腺指数高于
5
一
F U组 (尸< 0 , 05 , 表 .l)
.2 2 血清NT F 一 a 浓度 与正常对照组相 比 , 珠子参
组和5 一F U组血清NT F 一 a 水平升高 , 但无统计学差
异 , 而模型对照组血清 T N F一 a 水平显著高于其他
各组俨 < 0 . 05 , 表 2) .
2
.
3 肿瘤细胞形态学改 变 光镜 H E染色可见 : 模
型组瘤细胞排列紊乱 , 大量侵入骨骼肌 , 核染色
深 , 异型性明显 , 可见较多瘤 巨细胞 , 部分呈大
片或带状凝固性坏死 ; 珠子参组肿瘤细胞排列
紊乱 , 核染色深 , 大小不一 , 可见瘤巨细胞 , 坏死
不如模型组严重 , 肿瘤细胞周围可见大量淋巴
细胞及巨噬细胞浸润 ; 5一 F U组肿瘤组织较局限 ,
有纤维组织包裹 , 少见瘤巨细胞 .
透射 电镜观察肿瘤细胞超微结构形态可
见 : 模型组细胞生长旺盛 , 线粒体多且普遍增大 ;
5
一
F U 组细胞变性坏死严重 , 有大量细胞崩解 、
死亡 . 胞质中见大量肿胀线粒体 , 细胞核高度异
常 , 可见核碎裂 , 核染色质溶解 , 胞质深染 ; 珠子
参组可见 : 有的瘤细胞线粒体明显减少 , 线粒体
川 w以颐卯日亡`口厅 ,
6 20 0 I S1 9 0 0 N S
一
39 7 0 C1 4 N
一
1 20 6/ R世界华人消化杂志 20 07年8月 8 2日 第 1 5卷 第 4 2期
. 同行评价
本文报道 了珠子
参对 H2 2肝 癌 小
鼠的抑瘤效应 及
其对肿瘤细 胞周
期和小 鼠血清中
T F N
一 a含量的影
响 , 研 究内容丰
富, 采用的方法较
得 当 , 结果结论较
可信 , 有一 定的参
考价值 .
aP 0<
.
05
匕p < 。 . 01 路 模型对照组
脊减少 ; 有的瘤细胞线粒体严重受损 , 空泡化严
重 . 同时多处细胞有核固缩 , 核边移胞质浓染或
者细胞核染色质碎裂浓缩成不规则团块 , 出现
凋亡的形态改变 (图 .l)
2
.
4 肿瘤细胞周期及细胞凋亡发生的影响 F C M
检测腹水中肝癌细胞的D N A含量 , 细胞各期所
占百分比如表3所示 . 结果表明 , 珠子参能诱导
肝癌细胞凋亡 , 其 中珠子参高浓度组诱导的细
胞凋亡率最高 . 模型对照组细胞的凋亡为肿瘤
细胞 自发的凋亡 . 从周期分析结果可以看出 , 珠
子参可使G Z一M期细胞聚积 , 阻止了M 一G t期的转
换 , 从而干扰了小鼠肝癌H 2 2细胞在细胞周期中
的进程 . 同时 , 珠子参能使 S期细胞减少 , 可能与
干扰了癌细胞D N A合成有关 .
3 讨论
细胞凋亡是在一定的生理或病理条件下 , 细胞
受到某种信号的触发后主动参与并遵循一定程
序的死亡过程 , 在整个过程中发生一系列特殊
基因的改变及生化 、 形态特征的改变 [’] . 肝癌细
胞的凋亡在肝癌的发生发展 , 转归及治疗等方
面发挥着重要的作用 , 近年来 , 有关中药诱导肝
癌细胞凋亡的研究报道逐年增多15 一`01 . 珠子参诱
导肝癌细胞凋亡可能与其细胞毒作用一起发挥
抗癌效应 . 周期分析结果表明 : 珠子参可使 G Z一M
期细胞聚积 , 阻止 了M 一 G !期的转换 , 从而干扰
了小鼠肝癌 H 2细胞在细胞周期中的进程 . 同时 ,
珠子参能使 S期细胞减少 , 可能与干扰了癌细胞
D N A合成有关 .
T N F
一
a 具有抗肿瘤 、 抗病毒及免疫调节等
广泛的生物学效应 . 但实体瘤患者血清 r TN F一 a 水
平异常升高 , 会严重破坏细胞因子之间正向的
协调作用 , 造成细胞因子网络功能紊乱 , 并可引
起脂肪降解 、 血管渗漏 、 内源性致热等病理损
w玲训K颐如以比万7 7
陈涛 等. 珠子参对小鼠日 2 2肝癌抑制作用及机制 6 20 1
伤. 因此 , T N F 一 a 的生物学作用与其体内的水平
高低密切相关 . 实验结果显示 : 珠子参组 T N F 一 a
水平高于正常组 , 但显着低于模型组 , 表明珠子
参具有抑制荷瘤机体 T N F 一 a 水平异常升高的作
用 , 使其维持在一定水平而发挥抗肿瘤 、 调节
机体免疫功能等积极作用 ,至于其最佳水平范围
则有待进一步探明 .
本研究结果显示 , 珠子参生药在 5 留k g和 10
叭 g剂量下19给药 , 对小鼠移植性肝癌具有较好
的抑瘤效果 , 其作用机制可能与珠子参诱导肝
癌细胞凋亡和影响细胞周期以及调节 T N F 一 a 水
平有关 .
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2
一
2 3
编辑 张焕兰 电编 何基才
I S SN 100 9
一
3 0 7 9 C N 14
一
12 6 0R/ 2 0 0 7年版权归世界华人消化杂志
。 消息 .
第四届哈尔滨全国消化内镜学术会议通知
本刊讯 为促进消化内镜诊治技术的发展和学术交流 , 由中华消化内镜学分会 、 黑龙江省医学会 、 黑龙江省
医院 、 黑龙江省临床消化病研究所联合举办的第四届全国消化内镜学术会议定于 2 00 7 一 12 一2 2 /23 在哈尔滨召
开 . 大会将邀请国内外著名专家作消化 内镜进展方面专题报告及内镜演示 , 并制定中华消化内镜学会消化内镜
消毒指南(讨论稿) . 欢迎消化届同仁积极投稿及参与 , 参会代表授予国家继续教育 I 类学分 .
1 投稿要求
论著要求 80 0字以内摘要 (目的 、 方法 、 结果 、 结论) , 电脑打印(W O R D格式 ) , 网上投稿 截稿时间: 2 00 7 一 10 一31 .
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