全 文 ：收稿日期：2012-04-09
基金项目：广西科技攻关项目（桂科攻 0424001- 3A）
作者简介：*为通讯作者，陈忠伟（1970-），高级兽医师，主要从事兽医制剂研发及动物传染病研究工作，E- mail：chen_zhong- wei@
163.com。赵武（1970-），主要从事动物药理学和传染病学研究工作，E- mail：zhaowu718@sina.com
苦木生物碱提取及其复方注射液的安全性研究
赵 武，陈忠伟*，孙建华，何 颖，刘 伟，胡 帅，关忠谊，陈凤莲
（广西兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室，南宁 530001）
摘要：【目的】筛选出苦木中生物碱的最佳提取方法及研究复方苦木注射液的安全性，为优化苦木生物碱有效成分
的提取工艺及开发出能有效治疗畜禽大肠杆菌病的复方中药注射液奠定基础。【方法】采用高效液相色谱法对乙醇回
流提取法、乙醇渗漉提取法和酶解—乙醇渗漉提取法提取的苦木生物碱进行含量测定并比较，同时对昆明小鼠进行口
服和腹腔注射复方苦木注射液的急性毒性试验，测定半数致死量（LD50）。【结果】酶解—乙醇渗漉提取法提取的苦木总
生物碱、苦木碱己和苦木碱丁含量分别为3.10±0.22、0.30±0.06和0.05±0.01 mg/mL，均极显著高于乙醇回流提取法和乙
醇渗漉提取法（P<0.01）。昆明小鼠口服复方苦木注射液的给药剂量为10000 mg/kg时，小鼠仍健康存活；腹腔注射给药
的LD50=2336 mg/kg，安全性评价为基本无毒物质。【结论】酶解—乙醇渗漉可作为复方苦木注射液中苦木生物碱的规模
化提取方法，复方苦木注射液具有毒性小、无传染、无残留、无耐药性等优点，可在畜禽业中代替抗生素对大肠杆菌等
细菌性传染病进行防治。
关键词：苦木；生物碱；苦木碱己；苦木碱丁；酶解—乙醇渗漉提取法；急性毒性试验
中图分类号：S853.731 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2012）06-0865-04
0 引言
【研究意义】苦木［Picrasma quassioides（D.Don）
Benn.］为苦木科苦木属植物，主要分布于黄河流域以
南各省区，以广东、广西最多。其性苦、寒，归肺、大肠
经。苦木的主要药用成分为茎、枝、叶所含的苦木素
（Quassin）、异苦木素（Picrasmin）、苦树素（Picrasin）、苦
木酮碱（Nigakinone）等十几种生物碱（沈保安和刘荣
禄，2006）。现已有研究证实，苦木具有抗菌消炎、解热
DOI：10.3969/j：issn.2095-1191.2012.06.865
南方农业学报 JOURNAL OF SOUTHERN AGRICULTURE 2012，43（6）：865-868
ISSN 2095-1191；CODEN NNXAAB http：//www.nfnyxb.com
Alkaloid extraction from Picrasnia quassioides (D. Don) Benn.
and safety of its compound injection
ZHAOWU，CHENZhong- wei*，SUN Jian- hua，HE Ying，LIUWei，HUShuai，
GUANZong- yi，CHENFeng- lian
（Guangxi Veterinary Research Institute/ Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccines and New Technology，
Nanning 530001，China）
Abstract： 【Objective】 The objective of this study was to screen the best alkaloid extraction method in Picrasnia
quassioides （D.Don） Benn. and study safety of its compound injection for optimizing the technique for active ingredients
extraction and developing compound Picrasnia quassioides （D.Don） Benn. injection on effectively treating avian colibacilo-
sis. 【Method】Alkaloids of Picrasnia quassioides （D.Don） Benn. were extracted via ethanol reflux， ethanol percolation and
enzymolysis-ethanol percolation method， measured and compared using high-performance liquid chromatogram. Meanwhile
the compound Picrasnia quassioides （D.Don） Benn. injection was administered orally and intraperitoneally to 50 and 60
Kunming mice， and toxicity was examined by detecting the LD50. 【Result】The total alkaloid， nigakinone and methylni-
gakinone from Picrasma quassioides （D.Don） Benn. using enzymolysis-ethanol percolation method were 3.10±0.22， 0.30±
0.06 and 0.05±0.01 mg/mL， respectively， which were all significantly higher than those obtained from ethanol reflux and
ethanol percolation （P<0.01）. The Kunming mice survived by tolerating as high as 10 000 mg/kg oral administration of
compound Picrasnia quassioides （D.Don） Benn. injection. And for the intraperitoneal injection when LD50 was 2336 mg/
kg， its safety appraisal was virtually non-toxic matter. 【Conclusion】 The enzymolysis-ethanol percolation method was
found optimal to purify the alkaloid from Picrasma quassioides and the compound Picrasnia quassioides injection can re-
place antibiotic to prevent and control bacterial infectious diseases such as Escherichia coli epidemic in livestock and
poultry industry because of its less toxicity， non infectiousness， non-residual properties and and no resistance to drug.
Key words： Picrasnia quassioides （D.Don） Benn.； alkaloid； nigakinone； methylnigakinone； enzymolysis-ethanol
percolation method； acute toxicity experiment
南 方 农 业 学 报
降压、抗癌抗蛇毒等作用（中国医学科学院药物研究
所，1996）。广西兽医研究所新兽药开发中心利用广西
特有的优势中草药资源，根据中兽医辨证施治与标本
兼治的原则，结合鸡大肠杆菌病的临床特点与病理特
征，将苦木与黄藤、救必应、白术和广藿香辨证组方，
开发出复方苦木注射液，并应用于规模化养殖场鸡大
肠杆菌病防治，对推动绿色健康养殖、调整产业结构
具有积极作用。【前人研究进展】刘富国（1986）用苦
木片预防仔猪白痢病，平均有效率达95.06%。王启
明（1995）经临床实践证明，苦木制剂对治疗猪的感
冒、无名高热、中暑等疾病均有效，尤其是治疗猪感
冒，有效率在98%以上。杨宗桦（1997）将苦木用于治疗
牛的蹄叶炎和急性眼结膜炎，也取得良好效果。本课
题组的前期研究结果也表明，苦木对禽大肠杆菌有一
定的体外抑菌效果（何颖等，2008）。【本研究切入点】
目前，国内外对苦木有效成分化学结构的研究已有较
大进展（陈猛等，2007；赵文娜等，2011），但有关苦木
生物碱提取、检测方法及毒理学方面的研究较少，苦
木在中兽医临床上的应用研究也鲜有报道。【拟解决
的关键问题】以高效液相色谱测定方法，对乙醇回流
提取法、乙醇渗漉提取法和酶解—乙醇渗漉提取法提
取的苦木生物碱进行测定，筛选出最佳提取方法；同
时对复方苦木注射液进行小鼠口服和腹腔注射的急
性毒性试验，评价其安全性，为优化苦木生物碱有效
成分的提取工艺及开发出有效治疗畜禽大肠杆菌病
的复方中药注射液奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
苦木药材采自广西马山县古零镇，经广西兽医研
究所新兽药开发中心鉴定为苦木科苦木属植物。取其
干燥枝、茎，切片，经粉碎机3次粉碎成100目粗粉。苦
木碱己、苦木碱丁标准品购自南方医科大学中医药学
院，分别含苦木碱己和苦木碱丁20 mg。复方苦木注射
液由广西兽医研究所新兽药开发中心研制，为橙红色
澄明液体，采用苦木、黄藤、救必应、广藿香等有效成
分提取物按一定浓度配制成，1 mL相当于原生药1 g。
昆明小鼠购自广西医科大学实验动物中心，雌雄各
半，共120只，体重18±2 g。
1. 2 苦木生物碱提取
1. 2. 1 乙醇回流提取法 苦木粗粉100 g→80%乙醇
加热回流→回收乙醇→浓缩成膏状→10倍乙醇溶
解→静置过夜（pH 9）→过滤、浓缩成膏→2%盐酸溶液
分次提取→浓缩至1 mL∶1 g生药。
1. 2. 2 乙醇渗漉提取法 苦木粗粉100 g→80%乙醇
（pH 2）浸泡→渗漉（3 mL/min）→浓缩成膏状→10倍乙
醇溶解→静置过夜（pH 9）→过滤、浓缩成膏→2%盐酸
溶液分次提取→浓缩至1 mL∶1 g生药。
1. 2. 3 酶解—乙醇渗漉提取法 苦木粗粉100 g→
酶解120 min→80%乙醇（pH 2）浸泡→渗漉（3 mL/min）
→浓缩成膏状→10倍乙醇溶解→静置过夜（pH 9）→
过滤、浓缩成膏→2%盐酸溶液分次提取→浓缩至
1 mL∶1 g生药。
1. 3 总生物碱测定
精密量取苦木提取液20 mL于蒸发皿中，置水浴
上蒸干，残渣用10 mLH2SO4（0.25 mol/L）溶解，滤过；蒸
发皿用0.05 mol/LH2SO4洗涤两次，每次10 mL，滤过；合
并滤液，移至分液漏斗中，用氯仿提取两次，每次10
mL；合并氯仿液，用0.25 mol/L H2SO4振摇提取3次（10、
10、5 mL），弃去氯仿液，合并酸液，用浓氨试液调pH约
10；然后用氯仿振摇提取5次（20、20、15、15、10、10
mL），每次提取液均用10 mL水洗涤，再通过无水硫酸
钠滤过，滤皿用4 mL氯仿洗涤两次，合并氯仿液，置水
浴上蒸干，再105℃干燥3 h，精密称重即可。
1. 4 苦木碱己、苦木碱丁含量测定
采用高效液相色谱法，条件色谱柱: Nucleosil C18
（4 mm×25 cm，5 μm）；流动相：60%甲醇－0.1%乙酸
铵；流速0.5 mL/min；检测波长254 nm。首先，配制
1 mg/mL苦木己碱、苦木丁碱的甲醇溶液，然后吸取对
照品溶液250、100 μL置于5 mL量瓶中，以甲醇定容，
分别吸取2、4、6、8、10 μL进样，按色谱条件测定，绘制
标准曲线。取总生物碱测定项下生物碱1.0 mg，精密称
量，溶于少量甲醇，通过中性氧化铝小柱（25 mm×6
mm），用15 mL甲醇洗脱，洗脱液挥干溶剂，残渣用甲
醇溶解并稀释至1 mL即可。
1. 5 小鼠口服急性毒性试验
选取50只昆明小鼠，雌雄各半，在人工照明12 h、
通风良好的条件下饲养观察3 d后，随机分成4个试验
组和1个对照组，每组10只，给药前8 h和给药后4 h内
禁食，但不禁水。口服按0.5 mL/20 g剂量灌胃给药，灌
服剂量按复方苦木注射液总生物碱含量计算，分别为
1000、2500、5000和10000 mg/kg体重。连续观察7 d，记
录小鼠中毒症状，小鼠死亡或试验结束后进行剖解，
观察各组织器官的变化，取心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺
脏及肠组织做病理切片，并计算半数致死量（LD50）。
1. 6 小鼠腹腔注射急性毒性试验
选取70只昆明小鼠，雌雄各半，随机分成6个试验
组和1个对照组，每组10只，给药前18 h和给药后4 h内
禁食，但不禁水。按总生物碱含量计算，各组分别按
1100、1320、1584、1900、2281和2737 mg/kg体重给药。
连续观察7 d，观察小鼠的饮水食欲、活动及精神状况，
记录小鼠死亡数，剖解肉眼观察各组织器官的变化，
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赵武等：苦木生物碱提取及其复方注射液的安全性研究
按简化寇氏法计算LD50。
2 结果与分析
2. 1 不同提取方法所得苦木生物碱含量比较
不同提取方法所得苦木总生物碱和苦木碱己、苦
木碱丁含量测定结果见表1，苦木药材和复方苦木注
射液中的苦木碱己、苦木碱丁高效液相色谱图见图1
和图2。由表1可知，酶解—乙醇渗漉提取法提取的苦
木总生物碱（3.10±0.22 mg/mL）和苦木碱己（0.30±
0.06 mg/mL）、苦木碱丁（0.05±0.01 mg/mL）含量极显
著高于乙醇回流提取法和乙醇渗漉提取法（P<0.01）。
由图1和图2可知，选用碱性含水流动相的Nucleosil
C18色谱柱，苦木碱己和苦木碱丁在254 nm处有最大吸
收值，且其色谱峰表观丰度较高，基线也较平稳，说明
以高相液相色谱测定苦木生物碱，具有稳定、准确、重
复性好的特点。
表 1 苦木中总生物碱和苦木碱己、苦木碱丁的含量
Tab.1 Results of determination of total alkaloids，nigakinone and methylnigakinone of Picrasma quassioides
提取方法 总生物碱（mg/mL） 苦木碱己（mg/mL） 苦木碱丁（mg/mL）
Extractingmethod Total alkaloids Nigakinone Methylnigakinone
乙醇回流法 Ethanol refluxmethod 2.10±0.63B 0.12±0.04B 0.03±0.01B
乙醇渗漉法 Ethanol percolation method 1.16±0.58C 0.04±0.01C 0.01±0.00C
酶解—乙醇渗漉法 Enzymolysis- ethanol percolation method 3.10±0.22 A 0.30±0.06A 0.05±0.01A
同列数据后不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）
Different capital and small letters in the same column represent extremely significant difference（P<0.01）
图 1 苦木药材中苦木碱己、苦木碱丁的高效液相色谱图
Fig.1 High- performance liquid chromatogram of nigakinone and
methylnigakinone ofPicrasma quassioides（D. Don）Benn.
2. 2 小鼠口服急性毒性试验结果
用灌胃针经口腔灌入复方苦木注射液后，个别小
鼠蜷缩在角落，活动减少，但第2 d观察，发现有30只小
鼠活动、饮水和采食恢复正常；连续观察7 d后，40只小
鼠均健康存活（表2），且全部小鼠的精神、食欲、肤色、
分泌物、呼吸、食欲、肌肉运动等方面均未观察到异常
变化。试验结束后剖检，发现各试验组小鼠脏器变化
与对照组无明显眼观差异。按照毒理学安全性评价标
准（范玉明和张舒，2009）得知，LD50＞10000 mg/kg，属
无毒性物质。
2. 3 小鼠腹腔注射急性毒性试验结果
复方苦木注射液的小鼠腹腔注射急性毒性结果
见表3。腹腔注射复方苦木注射液2 h后，部分昆明小
鼠表现出兴奋不安，痉挛，缩成一团，呼吸困难，随后
死亡。其他小鼠活泼程度不如对照组，采食量明显减
少，但饮水量增加。至第7 d存活小鼠的采食、饮水恢
复正常，活动自如。剖检死亡小鼠，发现肠系膜充血，
肝脏、脾脏肿大，被膜紧张，边缘钝圆，表面呈暗紫红
色，切面呈暗红色，质地变软；心脏、肾脏体积均增大。
用改良寇氏法计算，LD50=2336 mg/kg，安全性评价为
基本无毒物质。
表 2 小鼠口服急性毒性试验结果
Tab.2 Result of acute toxicity experiment on mice by oral dosage
组别 剂量（mg/kg） 试验数（只） 7 d后的观察结果
Group Dose No. Result after 7 days
1 1000 10 健康存活
2 2500 10 健康存活
3 5000 10 健康存活
4 10000 10 健康存活
CK 0 10 健康存活
表 3 小鼠腹腔注射急性毒性试验结果
Tab.3 Result of acute toxicity experiment on mice by celiac in-
jection dosage
组别 剂量 对数剂量 试验数 死亡数（只） 死亡率（%）
Group （mg/kg） Logarithmic （只） Death Mortality
Dose dose No. number rate
1 1.12 0.0414 10 0 0
2 1.32 0.1206 10 1 0.1
3 1.58 0.1998 10 2 0.2
4 1.90 0.2788 10 4 0.4
5 2.28 0.3581 10 7 0.7
6 2.74 0.4373 10 10 1.0
CK 0 1.0000 10 0 0
苦
木
碱
己
苦
木
碱
丁
0.04
0.02
0.00
AU
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
苦
木
碱
己
苦
木
碱
丁
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
0.30
0.20
0.10
0.00
AU
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南 方 农 业 学 报
涂片镜检可见脾脏呈急性脾炎变化，被膜下有大
量红细胞；肝脏汇管区有少量炎症细胞浸润，肾脏皮
质部可见部分蛋白管型，胃粘膜下层有轻度的炎症细
胞浸润；心肌纤维核数量减少，肌纤维断裂、崩解、溶
解、消失，肌纤维间有一定量的红细胞。随着药物剂量
增大，小鼠死亡率增加，脏器病变也更加明显。
3 讨论
传统的提取方法如煎煮、有机溶剂浸出醇处理
等，提取温度高、提取率低、成本高、不安全，而选用适
当的酶可将植物组织分解，加速有效成分释放提取。
大部分中药材的细胞壁是由纤维素构成，其有效成分
往往包裹在细胞壁内；纤维素是由β- D-葡萄糖以
1，4-β葡萄糖苷键连接，而用纤维素酶酶解可以破坏
β- D-葡萄糖键，使植物细胞壁破坏，有利于有效成分
的提取（余兴莲等，2007）。本研究中的酶解—乙醇渗
漉法是采用β-纤维素分解酶对苦木的植物纤维素进
行分解，所得的苦木总生物碱含量极显著高于乙醇回
流法和乙醇渗漉法，且该法提取的苦木碱己、苦木碱
丁的含量与另外两种方法相比差异也极显著，说明β-
纤维素分解酶能较大幅度提高苦木生物碱的提取率。
复方苦木注射液由苦木、黄藤等中药提取制备，
具有清热解毒、利湿消肿、健脾和中、燥湿止泻、行气
通经等功效，临床常用于防治致病性大肠杆菌引起的
肠炎、腹水综合症、浆膜炎、肺炎、输卵管炎等症。本研
究对复方苦木注射液进行了急性毒性试验，按注射液
中总生物碱计算给药剂量和毒性判定指标；在小鼠口
服急性毒性试验中，口服剂量超过1000 mg/kg，7 d后
小鼠仍健康存活，按照药物学急性毒性试验标准，说
明复方苦木注射液对小鼠口服安全无毒；在小鼠腹腔
注射急性毒性试验中，用改良寇氏法计算出LD50=2336
mg/kg，根据标准判定，亦表明复方苦木注射液临床治
疗安全性非常高，基本安全无毒。因此，在畜禽业中以
复方苦木注射液代替抗生素对大肠杆菌等细菌性传
染病进行防治，具有良好的兽药开发前景。
4 结论
选用酶解—乙醇渗漉法提取苦木生物碱，所得的
总生物碱和苦木碱己、苦木碱丁含量较高，基本符合
实际生产工艺要求，进一步优化研究后可作为复方苦
木注射液中苦木生物碱的规模化提取方法。而小鼠口
服和腹腔注射急性毒性试验证明，复方苦木注射液临
床治疗安全性非常高，具有毒性小、无传染、无残留、
无耐药性等优点，可在畜禽业中代替抗生素对大肠杆
菌等细菌性传染病进行防治。
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（责任编辑 兰宗宝）
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