全 文 ：海木不同极性部位抑菌活性的初步观察
李家洲， 卢海啸* ， 梁 珊
(玉林师范学院，广西 玉林 537000)
收稿日期:2013-09-10
基金项目:玉林师范学院高层次人才科研启动基金 (G2012016);广西教育厅科研项目 (200810MS126)
作者简介:李家洲 (1958—) ，男，教授，主要从事生理学和药理学的教学和科研工作。E-mail:ljz5810@ 163． com
* 通信作者:卢海啸 (1974—)，男，博士，副教授，主要从事药用植物资源的研究与开发工作。E-mail:luhaixiao76@ 163． com
摘要:目的 探讨海木不同极性部位的抑菌活性。方法 采用系统溶剂法制备海木枝叶的不同极性部位，以大肠杆
菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉、青霉等 6 种菌作为供试菌种，分别以抑菌圈测定法和试管
二倍稀释法检测海木不同极性部位的抑菌效果和最低抑菌质量浓度 (MIC)、最低杀菌质量浓度 (MBC)及其热稳定
性。结果 海木枝叶的三氯甲烷部位抑菌活性最强;三氯甲烷部位对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的 MIC分别为 0. 037 5、
0. 037 5 g /mL;对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MBC分别是 0. 075 0、0. 075 0 g /mL;水部位的热稳定性较好。结论 海
木的抑菌活性部位为三氯甲烷部位，水部位的热稳定性较好。
关键词:海木;最低抑菌质量浓度;最低杀菌质量浓度;热稳定性
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2014)11-2424-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 11. 049
海木 Trichilia connaroides 有清热解毒，祛风湿腰腿痛，
祛心、胃气痛等功效［1］。Zhang 等［2］报道，海木三氯甲烷
提取物具有止痛和抗炎活性。本课题组在进行海木不同极
性部位的药效初筛中，发现海木三氯甲烷部位具有显著的
活血化瘀以及降血糖、血脂和血压的作用［3-5］。关于海木抑
菌活性及其作用机理的研究尚未见报道，本实验以大肠杆
菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母、黑曲霉、
青霉等 6 种微生物作为供试菌种，初步研究海木枝叶乙醇、
石油醚、三氯甲烷、正丁醇和水 5 种不同极性部位的抑菌
活性。
1 试验器材
1. 1 供试材料 海木枝叶:采自广西永福县寿城，经广西
植物研究所刘演研究员鉴定为楝科植物海木 Trichilia con-
naroides。供试菌种:大肠杆菌 Escherichia coli、枯草芽孢杆
菌 Bacillu subtilis、金黄色葡萄球菌 Staphylococcuaureus;黑
曲霉 Aspergillus niger、青霉 Penicillium citrinum;啤酒酵母
Saccharomyces cerevisiae。上述供试菌种取于玉林师范学院微
生物实验室。
1. 2 试剂与药品 三氯甲烷、石油醚、盐酸、氢氧化钠、
葡萄糖为国药化学试剂有限公司生产，氯化钠为洛阳市化
学试剂厂生产，正丁醇为西陇化工股份有限公司生产，无
水乙醇为广东东华化学有限公司生产，消毒酒精为武汉市
雪环医用消毒用品有限公司生产，蛋白胨、酵母膏为北京
奥博星生物技术有限责任公司生产，牛肉膏为中国医药
(集团)上海化学试剂厂生产，琼脂粉为上海润捷化学试
剂有限公司生产。以上试剂均为分析纯。
1. 3 主要仪器 隔水式电热恒温培养箱、HH． B11. 600-S-
Ⅱ电热恒温培养箱 (上海跃进医疗器械厂);HZ-9811K 双
层双速振荡器 (上海康华生化仪器制造厂) ;CＲDSX-280
不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅 (上海博讯实业有限公司) ;
超净工作台 (苏净集团安泰公司) ，UV-2102C 型可见分光
光度计 (天津港东) ;ＲE系列旋转蒸发仪 (上海鹏奕仪器
有限公司)。
2 试验方法
2. 1 海木提取物的制备 称取海木干枝叶适量，加入适量
的无水乙醇，加热回流 2 h，用四层纱布过滤，得到的上清
液提取液，重复提取 3 次，合并提取液，减压回收溶剂，
得膏状物，将此膏状物用适量乙醇溶解，然后加入 3 倍量
的蒸馏水，静置，抽滤，除去沉淀物 (叶绿素)，滤液回
收溶剂至干，即得粗提 (乙醇)部分。将所得粗提物分成
5 份，1 份备用，另 4 份依次用石油醚、三氯甲烷、正丁
醇、水进行固-液萃取并减压回收溶剂至干，最后得到的膏
状物即是石油醚、三氯甲烷、正丁醇和水极性部位。
取 5 个已灭菌的 50 mL 小烧杯，加入无菌蒸馏水
10 mL，分别放进粗提 (乙醇)、石油醚、三氯甲烷、正丁
醇和水 5 种极性部位的提取物 3 g，60 ℃超声波振荡 4 h，
摇匀后即得 30 %的海木乙醇提取物、石油醚提取物、三氯
甲烷提取物、正丁醇提取物和水提取物溶液。
2. 2 培养基平皿的制备 LB培养基 (培养细菌用):牛肉
膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，蒸馏水
1 000 mL，pH 7. 0 ～ 7. 2;PDA 培养基 (培养真菌用):马
铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，水 1 000 mL，pH 自
然。马铃薯去皮，切成小块，煮沸 30 min，双层纱布过滤
三次，再加葡萄糖、琼脂熔化，补足水至 1 000 mL。
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121 ℃高温灭菌 30 min。选用直径 9 cm 的无菌培养皿，待
已灭菌的培养基降温至 70 ℃左右，在酒精灯附近，每皿倒
入 15 ～ 20 mL培养基，冷凝备用［6］。
2. 3 菌悬液的配制及含菌平皿的制备 用接种环挑取适量
经活化的各种待测菌体或孢子，以无菌水稀释，振摇
10 min，充分混合，制成相应的初始菌体悬液或孢子悬液，
备用。
每种待测菌取无菌平皿 9 套，分别标记 4、5、6 号各 3
套。另取 6 支盛有 4. 5 mL无菌水的试管，分别标为 1、2、
3、4、5、6 号试管。用 1 mL无菌试管吸取 1 mL 已经充分
混匀的初始菌悬液，精确放 0. 5 mL至 1 号试管中，此为 10
倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将 1 号试管置于振
荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支 1 mL吸管从 1 号
试管中吸取 1 mL 菌液，精确放 0. 5 mL 至 2 号试管中，此
为 100 倍稀释。其余依此类推。
每种待测菌用 3 支 1 mL无菌吸管分别吸取各稀释菌悬
液 1 mL 对号放入编好号的相应无菌平皿中，每皿放
0. 2 mL，马上向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入溶
化后冷却至 45 ℃左右的 LB培养基或 PDA培养基约 15 mL，
置水平位置迅速旋转平皿，使培养基与菌液混合均匀，待
培养基凝固后，放于 37 ℃恒温培养箱中培养 48 h。然后取
出培养平皿，算出同一稀释度的 3 个平皿中的菌落平均数，
并按下列公式计算:每 1 mL中菌落形成单位 (cfu) = 同
一稀释度 3 次重复的平均菌落数 ×稀释倍数 × 5［7］。
选取菌落形成单位为 107 ～ 108 cfu /mL 的相应稀释度的
菌悬液作为待测试验菌悬液，标注待测菌种名称。
分别用无菌吸管吸取各种待测菌悬液 0. 1 mL分别加入
相应的培养基平皿上，用经酒精灯烧过的三角涂布棒涂布
均匀，直到培养基的表面基本干燥为止，即制成含菌平皿。
2. 4 抑菌圈测定 剪制直径为 6 mm 的小圆形滤纸片，经
高温蒸气灭菌 (121 ℃下灭菌 30 min)，烘干。分别于各种
30%海木提取物溶液和无菌水中，浸泡过夜。在无菌条件
下，取出小圆滤纸片，自然沥干，每皿间隔一定距离分别
放置各种滤纸片一片，每菌 3 个重复。然后将平皿分别放
入相应适宜温度的恒温培养箱中培养 (细菌 37 ℃，培养
24 h;真菌 28 ℃，培养 48 h)。使用游标卡尺测量各抑菌
圈的直径大小，取其平均值作为实验结果。
2. 5 最低抑菌质量浓度 ( MIC) 的测定 按“2. 2”项配
方配制 LB培养基和 PDA培养基，121 ℃高温灭菌 30 min。
采用二倍稀释法测定最低抑菌质量浓度［8］:每种待测菌
取 8支无菌小试管，第1管加30%原提取液1 mL，其他7管
各加相应的灭菌培养液 1 mL，第 2 管加原提取液 1 mL，混
合均匀后吸取 1 mL于第 3 管，混匀后吸取 1 mL 于第 4 管，
依次类推到第 7管，弃去 1 mL，第 8 管改加 1 mL无菌水后
弃去 1 mL 作为对照。使各种海木提取物溶液分别稀释成
3 /10、3 /20、3 /40、3 /80、3 /160、3 /320、3 /640 g /mL 的不
同质量浓度。1 ～7号管中均含有 1. 0 mL不同稀释度的海木
提取液，8号管为无提取物对照，每管加菌悬液 0. 1 mL，摇
匀。然后，置于 200 r /min的振荡器上培养 24 h。结果判定:
培养液清亮透明表示无菌生长，浑浊表示有菌生长，以无菌
生长的最小质量浓度为最低抑菌质量浓度。
2. 6 最低杀菌质量浓度 ( MBC) 的测定 从“2. 5”项无
菌生长的液体培养基中吸出 0. 1 mL滴入相应的平板中，涂
布均匀。然后将各平皿放入相应适宜的恒温培养箱内培养
(细菌37 ℃，培养 24 h，真菌 28 ℃，培养 48 h)，观察是
否有菌生长［9］。结果判定:以无菌生长的最小质量浓度为
最低杀菌质量浓度。
2. 7 热稳定性的测定 将提取物分别置于 80 ℃、100 ℃
水浴和 121 ℃湿热条件下分别处理 30 min，用未经热处理
的海木相应部位的原液作为对照，测定待测菌株的抑菌
性［10］。每菌重复 3 次，按“2. 4”项方法量取抑菌圈直径，
取其平均值为测定结果。
3 结果与分析
3. 1 抑菌效果 由表 1 可知，海木提取物对大肠杆菌，枯
草芽孢杆菌有较强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌抑制效
果不明显，对黑曲霉、青霉、啤酒酵母均无抑制作用。对
细菌的抑菌顺序为:大肠杆菌 ＞枯草芽孢杆菌 ＞金黄色葡
萄球菌。各提取物的抑菌效果顺序为:三氯甲烷提取物 ＞
正丁醇提取物 ＞水提取物，而乙醇提取物、石油醚提取物
的抑制作用甚弱。
表 1 海木提取物抑菌圈直径 (mm)
供试菌种 乙醇提取物 石油醚提取物 三氯甲烷提取物 正丁醇提取物 水提取物 空白对照(无菌水)
大肠杆菌 8. 0 8. 2 10. 2 10. 0 9. 8 6. 0
枯草芽孢杆菌 6. 4 7. 3 8. 2 8. 0 7. 7 6. 0
金黄色葡萄球菌 6. 2 6. 2 7. 5 6. 5 6. 5 6. 0
黑曲霉 6. 1 6. 0 6. 5 6. 2 6. 0 6. 0
青霉 6. 0 6. 3 6. 2 6. 0 6. 0 6. 0
啤酒酵母 6. 0 6. 0 6. 1 6. 1 6. 0 6. 0
3. 2 最低抑菌质量浓度 ( MIC) 根据表 1 的结果，本实
验只测定 3 种提取物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最低抑
菌质量浓度和最低杀菌质量浓度。结果见表 2 和表 3，三
氯甲烷提取物的最低抑菌质量浓度 (MIC)最小，正丁醇
提取物次之，3 者对大肠杆菌的 MIC 分别为 0. 037 5、
0. 037 5、0. 075 g /mL;对枯草芽孢杆菌的 MIC 分别为
0. 037 5、0. 075 0、0. 15 g /mL。
3. 3 最低杀菌质量浓度 ( MBC) 结果见表 4 ～ 5，三氯
甲烷提取物、正丁醇提取物、水提取物对大肠杆菌的最低
杀菌质量浓度 (MBC)分别是 0. 075 0、0. 075 0、0. 150 0
g /mL，对枯草杆菌的最低杀菌质量浓度 (MBC)分别是
0. 075 0、0. 150 0、0. 300 0 g /mL。
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表 2 海木提取物对大肠杆菌的最低抑菌质量浓度 (MIC)
提取物
提取物质量浓度(g·mL －1)
3 /10 3 /20 3 /40 3 /80 3 /160 3 /320 3 /640 对照
MIC /(g·mL －1)
三氯甲烷提取物 － － － － + + + + + + + + 0. 037 5
正丁醇提取物 － － － － + + + + + + + + + 0. 037 5
水提取物 － － － + + + + + + + + + + 0. 075 0
注:“ － ”表示菌完全无生长;“ +”表示菌生长迟缓，形成的菌落很少;“ + +”表示菌生长比较快，形成菌落较多;“ + + +”
表示菌生长迅速，菌落数增长快
表 3 海木提取物对枯草芽孢杆菌的最低抑菌质量浓度 (MIC)
提取物
提取物质量浓度(g·mL －1)
3 /10 3 /20 3 /40 3 /80 3 /160 3 /320 3 /640 对照
MIC /(g·mL －1)
三氯甲烷提取物 － － － － + + + + + + + + + 0. 037 5
正丁醇提取物 － － － + + + + + + + + + + + 0. 075 0
水提取物 － － + + + + + + + + + + + + + 0. 150 0
注:“ － ”表示菌完全无生长;“ +”表示菌生长迟缓，形成的菌落很少;“ + +”表示菌生长比较快，形成菌落较多;“ + + +”表
示菌生长迅速，菌落数增长快
表 4 海木提取物对大肠杆菌最低杀菌质量浓度 (MBC)
提取物
提取物质量浓度(g·mL －1)
3 /10 3 /20 3 /40 3 /80 3 /160 3 /320 3 /640 对照
MBC /(g·mL －1)
三氯甲烷提取物 － － － + + + + + + + + + + + + 0. 075 0
正丁醇提取物 － － － + + + + + + + + + + + 0. 075 0
水提取物 － － + + + + + + + + + + + + + 0. 150 0
注:“ －”表示菌完全无生长;“ +”表示菌生长迟缓，形成的菌落很少;“ + +”表示菌生长比较快，形成菌落较多;“ + + +”表
示菌生长迅速，菌落数增长快
表 5 海木提取物对枯草芽孢杆菌最低杀菌质量浓度 (MBC)
提取物
提取物质量浓度(g·mL －1)
3 /10 3 /20 3 /40 3 /80 3 /160 3 /320 3 /640 对照
MBC /(g·mL －1)
三氯甲烷提取物 － － － + + + + + + + + + + + + 0. 075 0
正丁醇提取物 － － + + + + + + + + + + + + + + + 0. 150 0
水提取物 － + + + + + + + + + + + + + + 0. 300 0
注:“ －”表示菌完全无生长;“ +”表示菌生长迟缓，形成的菌落很少;“ + +”表示菌生长比较快，形成菌落较多;“ + + +”表
示菌生长迅速，菌落数增长快
3. 4 热稳定性测定 结果见表 6 ～ 7。水提部位经 80 ～
121 ℃处理后抑菌圈直径变化幅度较小，表明水提取物的
热稳定性较好。其他 2 种提取物经过 80 ～ 100 ℃的温度处
理后，抑菌圈直径数值变化小，其抑菌活性变化不大，但
121 ℃处理后抑菌圈直径明显变小，抑菌效果变差，抑菌
性能大大降低，但仍表现出一定的抑制作用。
表 6 海木提取物热处理后对大肠杆菌的抑菌圈直径
提取物
不同温度加热处理后的抑菌圈直径 /mm
80 ℃ 100 ℃ 121 ℃ 对照
三氯甲烷提取物 10. 1 9. 5 7. 6 10. 2
正丁醇提取物 9. 8 9. 1 7. 2 10. 0
水提取物 9. 5 9. 7 9. 3 9. 8
表 7 海木提取物热处理后对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径
提取物
不同温度处理加热后的抑菌圈直径 /mm
80 ℃ 100 ℃ 121 ℃ 对照
三氯甲烷提取物 8. 1 7. 3 6. 7 8. 2
正丁醇提取物 7. 6 7. 8 6. 4 8. 0
水提取物 7. 5 7. 8 7. 6 7. 7
4 讨论
本实验结果显示，海木各种极性的抑菌效果为:三氯
甲烷部位 ＞正丁醇部位 ＞水部位;而乙醇部位和石油醚部
位的抑制作用较为微弱，表明三氯甲烷部位和正丁醇部位
是海木发挥抑菌作用的主要活性部位;海木提取物对细菌
生长具有广谱抑制作用，其中对革兰氏阴性菌抑制作用较
强，对革兰氏阳性菌抑制作用较弱，抑菌顺序为:大肠杆
菌 ＞枯草芽孢杆菌 ＞金黄色葡萄球菌;水部位的热稳定性
较好，三氯甲烷和正丁醇部位和热稳定性相对较弱，但只
要使用低于 100 ℃温度进行提取，其提取物仍具有较强的
抑菌活性。
课题组将对海木三氯甲烷部位和正丁醇部位的活性成
分做进一步的追踪，最终分离出其具有生物活性的单体成
分，为海木的进一步开发利用提供实验基础。
参考文献:
［1］ 陈冀胜，郑 硕． 中国有毒植物［M］． 北京:科学出版
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2014 年 11 月
第 36 卷 第 11 期
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多指标优选健胃清肠口服液提取工艺研究
刘效栓， 毕映燕， 李季文， 李喜香， 牟倩倩
(甘肃省中医院药剂科，甘肃 兰州 730050)
收稿日期:2013-08-12
基金项目:甘肃省中医药管理局中医药项目 (GZK-2011-65)
作者简介:刘效栓 (1964—) ，主任药师，从事中药制剂质量控制研究。Tel: (0931)2687057，E-mail:liuxiaoshuan1964 @ 163． com
摘要:目的 优选健胃清肠口服液最佳提取工艺。方法 采用多指标控制，以干膏率、大黄酸、大黄素、大黄酚的提
取率为综合评价指标，选取提取时间、料液比和提取次数为考察因素，通过正交试验优选口服液的最佳提取工艺。结
果 健胃清肠口服液的最佳提取工艺为加 10 倍量的水煎煮 3 次，第 1 次 2 h，第 2 次、第 3 次分别为 2 h。结论 该工
艺稳定可行，可作为健胃清肠口服液工业化提取工艺。
关键词:健胃清肠口服液;正交试验;大黄酸;大黄酚;大黄素
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2014)11-2427-03
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 11. 050
健胃清肠合剂是由大黄、厚朴、枳壳、木香等药材组
成的中药复方制剂，为甘肃省中医院院内制剂，主要作为
胃肠道造影检查前及术后清肠剂使用，其在临床上安全、
有效、耐受性好［1］。为了方便该制剂在临床上的使用，减
少患者服药剂量，增加患者顺应性，将其制成口服液。根
据处方中药物所含成分的理化性质及药理作用，结合中医
临床用药的特点，采用正交试验法，对健胃清肠口服液的
提取工艺进行优化，为工业化生产提供技术支持。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 高效液相色谱仪 (Waters 1525 泵;Waters 717
进样器;Waters 2487 双通道紫外检测器);HS6150 超声波
清洗仪;赛多利斯电子天平;ZXFD-A5140 电热鼓风干燥
箱;电热套。
1. 2 试药 大黄等六味药材 (甘肃省中医院药学部提
供);大黄酸 (批号 110757-200206)、大黄酚 (批号
110796-200716)、大黄素 (批号 110756-200110)由中国药
品生物制品检定院提供。乙腈 (天津光复精细化工研究
所，色谱纯)，甲醇 (天津百世化工有限公司，分析纯) ，
三氯甲烷 (天津百世化工有限公司，分析纯)、盐酸 (天
津百世化工有限公司，分析纯)、磷酸 (天津百世化工有
限公司，分析纯) ，实验用水采用双重蒸馏水。
2 方法与结果
2. 1 干膏率测定 按正交试验所得的提取液浓缩至 60 mL
左右，精密吸取 3 mL，移至恒重蒸发皿中，水浴蒸干，残
渣于 105 ℃干燥 5 h，取出，迅速移至干燥器中冷却至室
温，称定质量，计算干膏率。
2. 2 成分测定
2. 2. 1 色谱条件 Waters C18 柱 (250 mm × 4. 6 mm，
5 μm)，以甲醇 － 0. 1%磷酸 (85 ∶ 15)为流动相，体积流
量为 1 mL /min，检测波长为 254 nm，柱温为室温，进样量
20 μL。理论塔板数均不低于 4 000。
2. 2. 2 对照品溶液的制备 精密称定大黄酸、大黄素、大
黄酚对照品，加甲醇溶解，定容于 10 mL 量瓶中，制成质
量浓度分别为 1. 16、0. 080、1. 08 mg /mL 的对照品溶液，
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第 36 卷 第 11 期
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Vol． 36 No． 11