全 文 ：文章编号:0490-6756(2001)05-0744-04
从瑞香狼毒中提取灭蚜活性物质的研究
侯太平1 ,崔球1 ,向瑞礼2 ,侯若彤1 ,刘世贵1
(1.四川大学草原鼠虫病害生物防治工程国家专业实验室 , 成都 610064;2.四川大学分析测试中心 , 成都 610064)
摘要:作者以生物活性跟踪法对瑞香狼毒根的杀蚜活性物质进行了系统的研究 , 根的粉碎物经过乙醇浸
提 、分级萃取 、分段柱层析与薄层层析相结合 , 分离纯化得到具有高灭蚜活性物质样品 A 和 B.经HPLC 分析 ,
A , B样品均为单一纯品.
关键词:瑞香狼毒;活性物质;蚜虫;层析
中图分类号:Q50　　　文献标识码:A
瑞香狼毒(S tellera chamaejasme L.)系瑞香科狼毒属植物 ,又称狼毒 ,断肠草等.根可入药 ,其性味苦
平 、有毒 ,有逐水祛痰破积杀虫之功效[ 1] .目前 ,从瑞香狼毒中主要分离获得 2类化合物 ,即黄酮类和香豆素
类化合物 ,其中黄酮类化合物是二氢黄酮的二聚体双氢双黄酮[ 2 ,3] .另外 ,Hiroshi Tatematsu 等从瑞香狼毒
中还分得 3种木脂体 Lirio resinol-B ,Pino resinol和Matairesiol.前两者是芝麻类型 ,具有鱼毒活性[ 4] ;Masatake
Niw a等人分得 4种二萜原酸酯 Huratoxin ,Sabto xin A , Ssimpiexin和 Pimelea facto r P2[ 5] ,冯威健从瑞香狼
毒中分得 6种二萜活性成分 ,其中一个抗癌活性很强的二萜为尼地吗啉(Gnidimacrin)[ 6] .另外 ,刘桂芳等从
瑞香狼毒中还分出 β-谷甾醇和胡萝卜甙(Daucosterol)等化合物[ 7 , 8] .但从瑞香狼毒中杀蚜活性物质的研究未
见报道 ,我们在前期研究中 ,发现瑞香狼毒含有杀灭蚜虫的活性成分 ,现采用生物活性跟踪法对瑞香狼毒根
的杀蚜活性物质进行分离纯化 ,得到两个具有灭蚜活性的化合物 A及 B.
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
瑞香狼毒采自四川若尔盖草原.棉蚜(Aphis gossypii Glover)系由我们实验用地所栽棉苗中饲养 ,试虫均
选择虫态个体大小均为一致的无翅成蚜.硅胶 GF254 ,硅胶 H(60型):青岛海洋化工集团公司.其他试剂均为
国产分析纯.旋转薄膜蒸发仪 ZX-91:中国科学院上海有机化学研究所制.薄层自动铺板器:重庆南岸新力实
验电器厂.普通烧结玻璃层析柱:华西医科大学玻璃仪器修造厂定制.ECONO低压柱层析系统:BIO-RAD公
司(USA).Shimadzu　Lc-4A 高效液相色谱仪.Shimadzu　SPD-IUV-VIS 检测器.Shimadzu　C-R6A chro-
matopac.
1.2　实验方法
1.2.1　毒力测定方法　根据张宗炳介绍的方法[ 9] ,采用直接浸液法测定毒力.采集虫口密度大的棉花叶
片 ,仔细剔除老弱病残个体 ,留下单一品种且大小适中的健康无翅成蚜个体供实验使用 ,叶片经修剪后每叶
留有蚜虫 50头左右.在分析天平上精确称取样品 ,与等量吐温-20混匀 ,加少量蒸馏水充分乳化后 ,再用蒸
馏水分别梯度稀释 1000 ,2000 ,4000 ,8000倍 ,以吐温-20作阴性对照.将修剪好的带虫叶片浸入各药液中 3s
后拿开 ,沥干 ,将带虫面向上置于铺有滤纸的 15培养皿中.待表面水挥发干后 ,合上皿盖防止蚜虫爬失 ,置
温室(25℃)下 24h后观察结果.
1.2.2　乙醇浸提及萃取　将粉碎的狼毒粉加十倍样品量的 95%乙醇浸提 , 40℃恒温下浸泡过夜 ,浸提 3
次 ,合并浸提液经旋转蒸发减压蒸出大部分溶剂 ,加入等量硅藻土拌匀 ,置通风橱中干燥粉碎.依次用正已
烷 、氯仿 、丙酮 、乙醇和水萃取 ,经浓缩干燥后分别检测各萃取物的毒力.
收稿日期:2001-02-06基金项目:国家自然科学基金(29902006)
2001年 10月
第 38卷第 5期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)
Oct.2001
Vol.38　No.5
1.2.3　分段柱层析　采用二级分段柱层析:第一级固定相为硅胶 H(200g),流动相为正已烷-乙酸乙酯(10∶
1),柱径 12cm ,常规湿法装柱 ,硅胶高度约 8cm ,每次上样量 25g ,流速 10ml/mim ,分三段收集得段 I、段 II
和段 I II.各段用薄层检测且分别测毒力 ,以毒力较强的段 I 、段 II 部分作下一级柱层析起始样品进一步细
分 ,第二组固定相为硅胶 H(200g),柱径5cm ,常规湿法装柱 ,硅胶高度约 50cm ,每次上样量5g ,流速 2.5mL/
mim ,对于段 I流动相采用梯度洗脱 ,起始溶剂组成为正已烷 ,终溶剂组成为正已烷-乙酸乙酯(30∶1),对段 II
亦用梯度洗脱 ,起始溶剂组成为正已烷-乙酸乙酯(30∶1),终了溶剂组成正已烷-乙酯乙酯(10∶1).分部收集 ,
薄层检测合并相同部分且分别测毒力 ,毒力较强部分作下一步骤起始样品进一步细分.
1.2.4　制备薄层分离　收集所得的高毒力组分在分析薄层上仍然含有 2 ～ 3条 Rf值相差很小的谱带 ,用柱
层析很难完全分离 ,故用制备薄层进一步细分.玻板尺寸:20cm×20cm ,硅胶 GF254厚度:1mm.上样时用点样
毛细管点成线状 ,展开剂用正已烷-乙酸乙酯(10∶1).展层后在紫外灯下对谱带作上标记 ,然后刮板 ,洗脱得
单一谱带样品 ,反复改变溶剂条件进行薄层检测确定纯度.
1.2.5　HPLC分析　柱子为高效硅胶柱 ,进样量 4μL ,流速 1mL/mim ,检测波长 254nm ,反复改变溶剂条件
检测纯度.
2　实验结果
2.1　溶剂萃取物的毒杀活性
由乙醇总提物所得干的物质分别用正已烷 、氯仿 、丙酮 、乙醇和水萃取 ,可得各干物质对棉蚜的毒杀活
性 ,结果见表 1.由表 1可知 ,在各处理浓度中 ,正已烷及氯仿提取物校正死亡率与总提取物相近 ,说明杀蚜
活性物质极性较低 ,主要存在于正已烷及氯仿低极性萃取物中 ,故确定以活性最大的正已烷萃取物为下步分
离提纯样品.
表 1　溶剂萃取物的毒杀死亡率(%)＊
浓度(%) 0.200 0.100 0.0500 0.0250
总提物 ＊＊87.11 66.67 27.45 18.37
正己烷 88.68 72.00 23.21 17.02
氯　仿 86.70 46.80 27.27 16.33
丙　酮 3.88 21.31 8.70 1.79
乙　醇 20.11 14.89 7.27 2.02
水 5.70 5.13 1.75 1.47
　　　　　＊表内数据系 3次重复的统计结果;＊＊校正死亡率(%)=(处理死亡率-对照死亡率)×100/对照存活率;下同
2.2　分段柱层析结果
经过 10级分段柱层析结合薄层检测最后得到 9个流分 ,测试各自的触杀毒力 ,结果如表 2.
表 2　层析各流分的毒杀亡率(%)＊
浓度(%) 0.200 0.100 0.0500 0.0250
总提物 87.1 66.7 27.5 18.4
Ⅰ 9.43 7.40 1.52 6.38
流分 Ⅱ 81.1 65.4 29.8 16.1
Ⅲ 24.1 15.4 7.69 6.78
Ⅳ 98.2 82.5 49.1 30.0
Ⅴ 5.88 8.16 1.72 1.54
Ⅵ 3.51 6.25 3.38 1.89
Ⅶ 57.8 37.1 26.3 10.9
Ⅷ 64.2 33.3 28.9 11.9
Ⅸ 27.5 14.3 7.41 4.35
745第 5期 侯太平等:从瑞香狼毒中提取灭蚜活性物质的研究
　　上述结果表明 , Ⅳ号流分(F4)与Ⅲ号流分(F3)毒力最强 ,这两个流份在检测薄层上仍有 2 ～ 3条 RF 值
非常相近的谱带 ,故确定以 F4及 F3流份作进一步分离.
2.3　制备薄层分离结果
F3经薄层制备分离得高活性化合物 A ,F4经薄层制备分离得高活性化合物 B ,为考察 A 及 B样品的毒
力 ,我们测试了二者对蚜虫的半致死浓度(LC50),结果见表 3.
表 3　A , B化合物对蚜虫的触杀毒力
A B
LC50(g/ L) 0.64330±0.0125 0.2505±0.0089
回归方程(Y) Y =7.8563+2.0948X Y =9.7291+2.9536 X
相关系数(r) 0.9675＊ 0.9767＊
　　　　　　　＊相关极显著
由表 3可知 ,化合物 A ,B的触杀毒性较强 ,可以确定化合物 A ,B即为所要寻找的瑞香狼毒中具有最强
杀蚜活性的有效成分.
2.4　HPLC 分析
经HPLC正相层析分析 ,由以上步骤所得样品 A及 B在正相硅胶柱上都是单峰 ,层析图谱如附图(洗脱
液为 [正已烷-乙酸乙酯(97∶3)] .
正相:样品 B;　　　正相:样品 A
附图　HPLC 分析图谱
3　讨论
植物中的化学物质 ,特别是植物次生性代谢物质 ,在植物自身防御机制中起着相当重要的作用.如何有
效地利用植物中存在的化学物质防治害虫 ,或是为探索新型的生物合理设计农药提供线索 ,这都是很有希望
的研究领域.从天然植物中寻找农药活性物质 ,作为先导化合物再加以改造是创制新农药的研究热点.在寻
找活性物质的研究过程中 ,活性成分的提取 、分离纯化是耗时耗力的关键步骤.寻找活性成分除了化学指标
外 ,还必须建立生物指标 ,以便追踪分离 ,还要在实验过程中随时比较各分离组分的生物活性及得率.我们的
前期工作已确定在瑞香狼毒根乙醇提取物中含有灭蚜活性物质 ,在此前提下 ,才对常用的提取分离方法作了
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详细考察及预试验 ,并合理设计毒力检测指标.在初分离阶段 ,产物纯度较低 ,此时将表现出一定生物活性
(稀释 1000倍时 ,灭蚜死亡率为 80%)的组分再做进一步分离处理 ,在分离的后期产物纯度较高时 ,选择毒
性最强的组分供进一步实验用.这样可以避免低含量 、高活性成分被其他低活性 、高含量组分掩盖而遗漏 ,因
为实验的目的是寻找具有最强灭蚜活性的成分.通过研究 ,我们已建立了一种能有效 、可靠 、快捷地分离纯化
瑞香狼毒灭蚜活性物质的方案 ,即:乙醇总提※正已烷 、氯仿萃取※二级分段柱层析※薄层制备得纯品.
瑞香狼毒根的正已烷初分产物尚包含较多的组分 ,象这样复杂的混合物的分离比较麻烦 ,采用分段柱层
析具有节约溶剂 、硅胶 、节省人力 ,分离效果较好等优点.首先进行大柱初分可以进行粗略分类 ,去除一些永
久性的吸附杂质 ,实验表明 ,大柱初分对粗分提取物分段效果十分理想 ,通过一步分离就可将有效成分纯度
提高 4倍以上 ,同时样品体积的减少亦有利于下步的进一步纯化.中柱细分采用梯度洗脱 ,最后采用制备薄
层得到纯品.
样品 A ,B 对棉蚜具有较强的触杀毒力.样品 A ,B均为低毒类化合物 ,对蚜虫羧酸酯酶 、谷胱甘肽-S-转
移酶均有较显著的抑制作用 ,有望成为一种有利于保护环境的高效 、低毒 、安全无公害的农药.
参考文献:
[ 1] 江苏医学院编.中药大辞典(下册)[ M] .上海:上海人民出版社 , 1997.
[ 2] 黄文魁.瑞香科狼毒中的双二氢黄酮狼毒素(Chamaejasmine)的结构[ J].兰州大学学报(自科版), 1977.3(4):50.
[ 3] 黄文魁 , 张振杰 ,等.中国化学会 1963 年年会论文摘要集 , 178.
[ 4] Niwa M , ea al.Piscicidal constituents of stellera chamaejasme L[ J] .Chem Pharm Bull , 1982.30(12):4518.
[ 5] Tatematsu H , et al.Piscicidal constituents of stellera chamaejasme L.(II)[ J].Chem Pharm Bull , 1984.32(4):1612.
[ 6] 冯威建 , 等.瑞香狼毒提取物尼地吗啉抗癌活性[ J].中华肿瘤杂志 , 1995 , 17(1):27.
[ 7] 刘桂芳 , 王莲.瑞香狼毒化学成分研究[ J] .中国中药杂志 , 1995 , 20(12):738.
[ 8] 刘桂芳 , 付玉芹.瑞香狼毒化学成分研究[ J] .中草药 , 1996 , 27(2):67.
[ 9] 张宗炳.杀虫药剂的毒力测定[ M] .北京:科学出版社 , 1988.
STUDYON EXTRACTION ISOLATIONOF KILLING-APHIDES
COMPONENTS FROM STELLERA CHAMAEJASME L.
HUO Tai-ping1 , CIU Qiu1 , XIANG Rui-li2 , HOU Ro-tong1 , LIU Shi-gui1
(1.National Lab.For Grassland Biological Control , Sichuan University , Chengdu 610064 ,China;2.Analytical
and Testing Center ,Sichuan University ,Chengdu 610064 ,China)
Abstract:I t is that the roo ts of S tel lera chamaejasme L.were reported to be used as insectcide against
aphides in china.the authoors obstain the insectcide-activity components A and B , which were separated by
phy sical methods such as systematic ex t raction , chromatography and HPLC.
Key words:S tel lera chamaejasme L.;aphidecide;bioactive substance;chromatog raphic f ractionation
747第 5期 侯太平等:从瑞香狼毒中提取灭蚜活性物质的研究