全 文 ：文章编号:1000-1573(2005)06-0040-04
南方红豆杉愈伤组织诱导的研究
赵　冬1 , 　肖　颖1 , 2 , 　刘占荣2 , 　王　刚1①
(1.河北师范大学 生命科学学院 , 河北 石家庄 050016;
2.石家庄学院 化学系 , 河北 石家庄 050801)
摘要:以南方红豆杉的嫩茎和针叶为外植体诱导愈伤组织 ,比较了不同种类基本培养基及不同激素水平诱导愈
伤组织的能力。结果表明 ,嫩茎作为外植体较针叶有利于南方红豆杉愈伤组织诱导;B5 培养基较 MS 培养基有
利于愈伤组织诱导。嫩茎诱导愈伤组织的最适培养基为 B5+2 , 4-D 2.0 mg/ L +6-BA 0.5 mg/ L。
关　键　词:南方红豆杉;愈伤组织诱导;外植体
中图分类号:Q 943.1　　　　　　　　文献标识码:A
Studies on callus induction of maire yew
(Taxus chinensis var.mairei)
ZHAO Dong1 , XIAO Ying1 , 2 , LIU Zhan-rong2 , WANGGang1
(1.The College of Life Science , Hebei Normal University , Shijiazhuang 050016 , China;
2.Depar tment of Chemistry , Shijiazhuang College , Shijiazhuang 050801 , China)
Abstract:This paper researched on callus induced from young stem and needle of Taxus chinensis
var.mairei and compared the inducing ability of different kinds of basal medium and different
hormone levels.The result indicated that young stem was bet ter than needle as explant , the
induction rate of callus w as higher.B5 basal medium was mo re ef fective in inducing callus than M S
basal medium .The most suitable cultural medium fo r inducing callus from young steam was B5+
2 ,4-D 2.0 mg/ L+6-BA 0.5 mg/L .
Key words:Taxus chinensis var.mairei ;callus induction;explant
　　紫杉醇(Taxol)是从红豆杉科红豆杉属(Taxus
sp.)植物的树皮中提取的一种四环 、二萜酰胺类天
然化合物 ,具有独特的抗癌作用[ 1] ,它能与微管蛋
白结合 ,并促进其聚合 ,抑制癌细胞有丝分裂 ,阻止
癌细胞的无限增殖[ 2] ,因此成为目前治疗卵巢癌 、
乳腺癌和肺癌的重要药物[ 3] 。由于红豆杉的天然
资源稀少 、生长极为缓慢且紫杉醇含量又很低
(0.01%)[ 4] ,仅从树皮中提取紫杉醇无法满足市场
需求。近年来人们在化学合成 、人工栽培 、真菌培养
等方面进行了大量的研究 ,但这些方法尚不成熟 ,不
能进行大规模商业化生产。而植物细胞培养法 ,特
别是结合了代谢调控与基因工程方面的研究成果
① 收稿日期:2005-04-27
基金项目:河北省自然科学基金项目(300162)
作者简介:赵　冬(1981-), 女 , 河北石家庄人 , 在读硕士研究生 , 主要从事植物代谢生理研究.
通讯作者:王　刚(1958-), 男 , 辽宁大连人 , 教授 , 博士生导师 , 主要从事植物代谢生理研究.
第 28卷第 6期
20 0 5年1 1月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNAL OF AGRICU LT URAL UNIVERSI TY OF HEBEI
　 　 Vol.28 No.6
Nov .2 0 0 5
后 , 可望成为最具有潜力的紫杉醇药源供应途
径[ 5] 。
本研究以南方红豆杉(Taxus chinensis var.
mairei)的嫩茎和针叶为试材 ,研究不同外植体 、不
同种类培养基及不同激素水平对南方红豆杉诱导愈
伤组织的影响 ,以期为利用分子生物学手段在细胞
中转入紫杉醇生物合成关键酶基因奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)的嫩
茎和针叶 。
1.2　方法
取生长季节的南方红豆杉(3 年生)当年生的嫩
茎和针叶 ,用洗衣粉洗净 ,滤纸压干 ,于无菌条件下
先用 75%的酒精浸泡 60 s ,再用 0.1%的升汞浸泡
10 min ,最后用无菌水冲洗 4 ～ 5次 。消毒后的针叶
切成 1 cm 左右的小段 ,嫩茎切成 0.8 ～ 1 cm 的小
段 ,分别接种到经高温 、高压灭菌的培养基上 ,进行
愈伤组织诱导。
1.3　培养条件
诱导培养基为 MS 和B5两种基本培养基 ,附加
不同的植物激素水平或不同激素组合。培养基琼脂
含量 0.4%,蔗糖含量 2.0%, pH 5.8左右 ,培养温
度(25±2)℃,黑暗培养。
1.4　试验参数测定
愈伤组织诱导率=愈伤组织块数/接种外植体
数。试验重复不少于 3次 ,结果取其平均值。
2　结果与分析
2.1　不同外植体对愈伤组织诱导的影响
将南方红豆杉的嫩茎和针叶接种在 B5 附加
2 , 4-D 2.0 mg/L 、6-BA 0.5 mg/ L 的培养基中 ,
黑暗培养第 9天时嫩茎产生愈伤组织 ,第 11天时针
叶产生愈伤组织 。观察发现 ,由嫩茎诱导出的愈伤
组织颜色较浅 ,为白色或浅绿色 ,较松散 ,易与外植
体分离 ,生长较好;而由针叶诱导出的愈伤组织 ,颜
色较深 ,成团 ,较致密 ,不易与外植体分离 ,生长较差
(图 1 ,图 2)。第 40 天(20天为一继代周期)时 ,计
算得出嫩茎和针叶的愈伤组织诱导率分别为
76.0%和 40%,前者高于后者 ,故选用嫩茎作为外
植体进行愈伤组织诱导 。
图 1　嫩茎诱导出的愈伤组织
Fig.1　Callus induced from young stem
图 2　针叶诱导出的愈伤组织
Fig.2　Callus induced from needle
2.2　不同种类培养基对愈伤组织诱导的影响
不同种类培养基因 ,其组分不同对南方红豆杉
的嫩茎外植体愈伤组织的诱导效果也有所不同(表
1)。MS 和 B5 两种培养基均可诱导嫩茎产生愈伤
组织 ,用相同的激素组合处理时 , B5 的诱导率比
MS的诱导率高约 3 ～ 4倍 ,且 B5培养基中愈伤组
织萌动也较 MS 培养基早 ,故选用 B5培养基为愈伤
组织诱导培养基。
表 1　不同种类培养基对愈伤组织诱导的影响
Table 1　The effect of different cultural medium on the induction of callus
培养基
Medium
植物激素及其浓度/(mg·L-1)
Hormone and their concentration
接种块数
The number of
transferred explants
出愈块数
The number of callus
诱导率/ %
The induction rate
of callus
B5 2 , 4-D 1.0+6-BA 2.0 47 17 36.2
B5 2 , 4-D 2.0+6-BA 2.0 48 25 52.1
B5 2 , 4-D 4.0+6-BA 2.0 50 18 36.0
MS 2 , 4-D 1.0+6-BA 2.0 48 5 10.4
MS 2 , 4-D 2.0+6-BA 2.0 50 8 16.0
MS 2 , 4-D 4.0+6-BA 2.0 58 6 10.3
41　第 6期　 赵　冬等:南方红豆杉愈伤组织诱导的研究
2.3　不同植物激素组合对愈伤组织诱导的影响
取南方红豆杉嫩茎切段分别接种于添加 2 ,4-
D(1.0 mg/L ～ 4.0 mg/L)+6-BA 0.5 mg/L 的
B5培养基上和添加 NAA(2.0 mg/ L ～ 8.0 mg/L)
+6-BA 0.5 mg/L 的 B5培养基上 ,第 40天(20 d
为一继代周期)时 ,统计愈伤组织诱导率见表 2。由
表 2可见 , 2 ,4-D比 NAA 更有利于愈伤组织的形
成 ,这与盛长忠的结果是一致的[ 6] 。观察愈伤组织
的状态也有较大的差异 ,在含有 2 , 4-D和 6-BA
的培养基上 ,愈伤组织体积较大且疏松 ,呈浅绿色;
而在含有 NAA 和 6-BA的培养基上 ,愈伤组织体
积较小且较致密 ,颜色较深 。2 ,4-D和 NAA的浓
度对愈伤组织的形成影响也较大 ,如表 2所示 ,在一
定范围内 ,随二者浓度的增大 ,诱导率呈现不同的变
化 ,愈伤组织诱导率在添加 2 , 4-D 2.0 mg/L 和
NAA 4.0 mg/L 时各存在 1 个最高值(76.0%和
40.0%)。
表 2　不同植物激素组合对愈伤组织诱导的影响
Table 2　The ef fect of different phythormone combinations on the induction of callus
培养基
Medium
植物激素及其浓度/(mg·L-1)
Hormone and their
concentration
接种块数
The number of
transfer red explants
出愈块数
The number o f callus
出愈时间/d
The day o f first
appearance o f callus
诱导率/ %
The induction rate
of callus
B5 2 , 4-D 1.0+6-BA 0.5 30 14 17 46.7
B5 2 , 4-D 2.0+6-BA 0.5 29 22 11 76.0
B5 2 , 4-D 4.0+6-BA 0.5 30 13 20 43.3
B5 NAA 2.0+6-BA 0.5 30 8 12 26.7
B5 NAA 4.0+6-BA 0.5 30 12 10 40.0
B5 NAA 8.0+6-BA 0.5 30 6 12 20.0
3　结论与讨论
植物组织培养成功与否 ,外植体的选择非常重
要。本试验发现 ,南方红豆杉的嫩茎较易产生高质
量的愈伤组织:先是茎的两端膨大变白 ,叶柄切口处
产生愈伤组织 ,然后整个茎膨大 ,最后整个外植体可
以全部转为愈伤组织 。这与前人的报道是一致
的[ 7] 。试验还发现 ,直径大且较幼嫩的茎比直径小
或老的茎更易产生愈伤组织。而由叶片产生的愈伤
组织较致密 ,不适于下一步的液体悬浮培养。虽然
茎相对于叶污染率较高 ,且出愈时间较晚 ,但因其产
生的愈伤组织松散 ,颜色浅 ,生长状态好 ,故选用嫩
茎为外植体进行愈伤组织诱导 。
使用不同种类的培养基(MS和 B5)和不同浓度
的 2 ,4-D , NAA 和 6-BA等植物激素对南方红豆
杉的嫩茎诱导愈伤组织的试验结果表明 ,虽然在两
种培养基中添加一定的植物激素均能产生愈伤组
织 ,但以 B5为培养基附加 2 , 4-D的激素组合 ,更
有利于嫩茎形成愈伤组织。其中 ,B5+2 , 4-D 2.0
mg/L +6-BA 0.5 mg/L 为诱导茎愈伤组织的最
适培养基 ,诱导率为 76.0%,且愈伤组织的质量好 、
块大 、松散 、颜色浅 ,适于下一步的液体悬浮培养。
在试验中还发现 ,红豆杉组织培养中茎的污染率是
较高的 ,原因可能是因为其含有内生真菌 ,表面消毒
后建立无菌培养依然比较困难[ 8] 。
南方红豆杉的愈伤组织和红豆杉属其他植物愈
伤组织一样 ,在生长过程中常会有一些酚类物质渗
出 ,FETT -NETO[ 9]等认为 ,愈伤组织褐化是由于
这些酚类物质氧化所致 。频繁继代更换培养基不能
根除这一现象。既便在培养基中添加抗坏血酸和谷
氨酰胺 ,效果也不明显 ,而添加活性炭能减缓这一现
象 。如何有效的抑制这种褐化现象 ,提高愈伤组织
的质量还有待于进一步的研究。
参考文献:
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(编辑:郭桂仙)
(上接第 31页)
不同重金属在玉米主产区的污染程度有所不同 ,污
染率较高的重金属是砷和镉 , 分别是 3.45%和
3.32%,其次是汞和铜;各县重金属污染累积水平不
同 ,全省重金属平均污染率为 12.0%,超过平均污
染水平的县有大名 、霸州 、正定 、高阳和献县 ,最高的
霸州 、大名达到了 28.0%,最低的辛集市为 2.0%。
3.3　综合评价各区域污染程度不同
用综合污染指数评价 ,全省玉米主产区所监测
的15个县均存在污染等级处于警戒限和轻污染水
平的土壤 ,全省达到警戒限水平的土地占到了监测
总面积的 39.8%,污染等级处于警戒限的面积较大
的有高阳 、大名 、肥乡 、霸州 、献县等 5县 ,其中高阳
县达到了 78.9%,为最高;全省轻污染水平的土地
面积占到了监测总面积的 4.6%,污染比率较高的
县是霸州 、正定 、大名和迁安 ,比率最高的霸州市达
到了 12.8%;全省达到中度污染和重度污染的土壤
面积均达到的总面积的 0.06%,分别出现在清苑和
承德县 ,其他县(市)均未发现中度污染或重污染的
土地 。
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(编辑:郭桂仙)
43　第 6期　 赵　冬等:南方红豆杉愈伤组织诱导的研究