全 文 ：沈 阳 农 学 院 学 报 , 1 6 ( 2 ) : 1 7~ 2 2 , 1 9 8 5
Jo u r n a l o f S il e n y a n g A g r i e u l t u r a l C o l l e g e
高等植物异源核酸转化研究
五 . 外源紫菜苔D N A诱导大白菜表型变异
钟文田 沈教娟
紫菜苔花蕾总 D N A借助微量核酸注射技术往入大白菜角果。 在外源紫菜苔 D N A作用
下 , 大白菜出现了特异和非特异两种生物学效应。 前者表现为叶形和色泽上发生变异 , 后者
表现为出苗率降低 , 长势减弱 , 以及叶表面程度不同地出现茸毛等性状 。 这说明外源 D N A
片段似可以通过遗传转化手段导入受体植物生殖细胞乃至表达 。
沿着遗传转化途径开拓植物育种新领域 , 不仅能克服植物自然繁育的障碍 , 实现远
缘物种间遗传信息的交流 , 而且能打破基因连锁关系 , 有选择地单独转 移所 需 要的基
因 , 成为崭新的农作物育种方法的基础 。 因而广泛引起了遗传育种工作者的兴趣 , 长期
以来一直是人们试图改变生物遗传结构的一种愿望 〔 2 , 3 , 了〕 。
可是 , 早期的研究工作由于受方法技术上的限制 , 以及没有找到适宜的受体材料 ,
这项研究虽经历了种子 、 幼苗 、 花粉及组织培养物等不同受体材料上的试验研究 , 但始
终没有取得高等植物遗传转化现象十分令人信服的证据 , 存在着两种相反的试验结论的
争执 〔 7 〕 , 致使这项研究工作进展缓慢 。
近年来 , 由于生物化学和分子生物学领域内研究技术的不断进展 , 迅速把这一课题
从愿望带到现实 。 特别是在哺乳动物方面 , 注射基因在生殖细胞中 的 传递成功〔幻 , 大
大鼓舞了从事植物遗传转化研究工作者的信心 。 自 1 9 81 年以来 , 我们在分离 、 纯化植物
性D N A的同时 , 采用微量核酸注射的办法 , 开展了外源紫菜苔D N A诱导大白菜表型变
异的试验。 本文报道引变试验的结果 。
材 料 与 方 法
1
. 材料 供体为紫菜苔 ( B r a s s f c a e h f n e n s i s v a r . p u r刀 u r e a ) , 受体 为早皇 白
等白菜自交系 ( B r a s s s e a p e k i n e n s i : ) 。
2
. 方法 高等植物异源核酸转化研究首先必须解决两个关键性问题。 一是分离具
有一定结构的高聚状态的纯D N A , 一是保护载有完整基因的 D N A片段顺利导入受体细
胞 。 最后通过表型变化推断基因的整合与表达。
( 1 ) 供体紫菜苔 D N A的分离与测定 : 采用氯仿一异戊醇脱蛋 白 , 琼 脂糖分子筛
( S e p h a r o s e一 4 B ) 纯化的方法分离纯化的紫菜苔 D N A , 其紫外光谱分析 结果呈 典型
本文于 i , 3 4年 7月 1 0日收到 。
1 8沈 阳 农 学 院 学 报 16卷
的核酸吸收曲线 , 吸收高峰为 2 5 9 n m , 吸收低谷为 2 3 2n m 。 A 2 6 o / 2 3。一 2 . 02 一 2 . 2 5,
A 2 6 o / 2 8 0~ 1
.
80 一 1 . 85 。 蛋白质含量为 0 . 1一 。 . 2% , 没有 R N A “ 污染 ” 。 增色效应为
30 ~ 35 %
, 。 . 5%琼脂糖凝胶电泳为均一斑点 。 可以认为所得到的 紫菜苔 D N A 是 大分
子纯 D N A , 在一定程度上保持了大分子天然状态 , 基本 上符合转化试验要求 。
( 2 ) 微量核酸注射导入外源 D N A : 高等生物遗传转化试验资料表明 , 微 量 核酸
注射能在试验需要的部位 (生殖细胞附近 ) 造成高浓度的异源 D N A , 是把转化 D N A 引
进受体靶细胞的主要方法 〔 4 〕。
注射针剂配制 : 将浓缩的紫菜苔D N A 溶液装进透析袋 , 在 4℃条件下 对含有 10 m M
C a CI
: 的 S S C溶液充分透析 4 8小时以上 。 微量核酸注射前 , 等体积加入核酪注射液 (上
海第十三制药厂产品 ) , 配成每毫升含有 10 , 50 , 10 , 15 0 , 2。。 , 30 微克的 D N A 注
射针剂 。 以透析液与核酪注射液等体积混合为对照 。
微量核酸注射 : 5 月下旬白菜开花期 , 于注射前 l
周 , 严格去除已开和破蕾的花 , 只 留下花蕾 , 然后套袋
自交 。 注射时 , 摘除花蕾和未授粉的花 , 用玻璃针由角
果顶部扎孔 , 再用微量注射器通过玻璃 针头注入 D N A
溶液 , 至充满角果 , 每角约 2 一 5微升 (见 图 1 ) 。 在
同一株上选另一类似的花序做对照处理 。 注射后迅速套
袋 , 1周后去掉纸袋直到成熟 。
( 3 ) 转化后代鉴定 : 将收获的种子于当年秋季和
第二年春季温室营养钵育苗 , 田间定植后进行外源 D N A
生物学效应及表型观察。 图 1 微量核 酸注针示意 图
试 验 结 果
分别于 198 1和 1 9 8 2年进行了两批外源 D N A 引变处理 , 其后代表现出不 同的生 物学
效应 。
1
. 中毒效应 紫菜苔 D N A 对不 同 白菜自交系诱导转化处理 的后代 , 经 温 室育
苗 , 表现为出苗率降低 , 长势减弱 (见表 1 、 图 2 ) 。 严重的只有 两片子叶长大 , 生长
点发育停滞 。 中毒程度似有随外源 D N A 浓度增加而加重的趋势 。
表 1 诱导转化处理后代 出苗率调查结果
… 出苗率 (% )试 验 组 合 }一 -一— —{ 处 理 1 对 照紫菜苔 D N A 十早皇白紫菜苔 D N A 十白 兰
紫菜苔 D N A + 小白口
3 5
8 l
6 0
.
9
8 4 4
4 0 0
图 2 诱导转化处理 后代 苗期长势比较
左 : 处理 (50 微克 /毫升 D N A ) , 右: 对照
2期 高等植物异源核酸转化研究 1 1 9
2
. 表型变异 两年诱导转化试验共注射 6 4株 , 得到早皇 白处理组种子 7 50 粒 , 对
照组种子 5 12 粒 。 育苗后 , 田间定植处理组 6 03
株 , 对照组 2 81 株 。 表型变化调查结果表明 , 对
照组植株基本上整齐一致 , 呈 早 皇 白 株型特
点 。 处理组中以 10 ~ 50 微克 /毫升 D N A 注射
的 , 有 8 株在叶面 、 叶背或叶脉上程度不同地
具有茸毛 ;紫色羽状全裂叶 1 株 ,绿色羽状全裂
叶 2 株 (见图 3 ) ; 深绿色叶 4 株 。 其中绿色
羽状全裂叶两次试验重复出现 。 图 3 诱导转化后代 ( D : ) 叶形 变异
.3 表型变异株 自交后代遗传表现观察 .A 早皇白 , B .紫菜苔 D N A 十早皇白 , c . 紫菜苔。
紫色羽状全裂叶 、 绿色羽状全裂叶和深绿色叶植株套袋自交 , 所得种子于秋 、冬季田间和
温室种植观察 , 发现这些性状呈数量性状遗传分离特点 。 据紫色羽状全裂叶变异株 3 0 粒
自交种子田间种植调查 , 有三分之二植株程度不同地表现紫色 。 叶形分离上紫色和绿 色
羽状全裂叶变异株均出现程度不同的羽裂叶 , 并表现出紫菜苔叶形特征 (见图 4 ) 。
图 4 表型变异株自交后代 ( D Z ) 叶形分 离情况
左 : 紫色羽状全裂叶 , 右 : 绿色羽状全裂叶; A . 早皇白 , B . D Z代 , C , 紫菜苔。
深绿色叶变异株后代 田间调查结果表明 , 种植的 1 10 株后代中 , 高 、 中 、 矮 三 种类
型结球株分别为 37 、 27 和 30 株 , 其余为抽苔或窄柄等不结球类型 。 其中主要分离类型在
生育期 、 株高和叶绿素含量方面都介于两亲本之间 , 单株净球重出现超亲性状 (见表幻。
表 2 深绿叶株后代几种性状调查结果 .
卜 、 项 曰 ) 株 高 1 株 重 { 生 育 期 1 叶绿素含量竺广李本三暨一斗一些牛一里一坦夏丝些些生一遏草旦李一全兰一一毕一 i兰一斗一` 生一斗一一二竺一一休 { 七衣一 。一 。 。 , 卜 。 。 } , 八 n熟土 {一 兰牛兰 - 斗一二牛一{一 , 华一一干一 -牛共一一詹{华卜一 2吧一斗一一弊一干止燮匕斗一一竺生一`代 4局 1 嫂 o· 5 } “ · “ 8 1 ” o { ` · 4 9
紫 菜 苔 {
4,
.
2
1
2
.
5 , 」 8。天以上 1 , . 6 4
株高与株重为 10 株平均值。
0 2沈 阳 农 学 院 学 报 1 6卷
讨 论
高等植物遗传转化包括外源 N D A引入 、 渗入细胞并进入细胞核 , 然 后 被整合 、 复
制 、 表达 , 以致引起表型变异等一系列 目前尚不甚清楚的过程。 同时 , 还可能伴有外源
D N A渗入后改变受体细胞染色体 D N A性质 , 影响基因调控等作用 , 从而使这项研究面
临许多复杂问题 。 现根据我们的试验 , 就其中几点谈谈看法 。
1
. 关千转化处理后代衰型多样性问两
农作物远缘杂交的实践告诉我们 , 双亲染色体组完全配对结合是困难的 , 而双亲遗
传物质局部地亲合并交换 , 保持母本染色体组不变所形成的杂种却是大量的。 可见 , 遗
传转化过程实际上就是D N A片段杂交过程〔 2 〕。 我们在试验中采用的外源 紫菜苔 D N A
片段 , 既包含结构基因 、 调控基因和转位子 , 又包含各种无意义的顺序 ,而且片段上携带
的基因是随机的 , 因此在转化处理后代群体中出现的新性状也应是随机的 , 不可能象常
规杂交育种 F : 代那样较整齐一致 。 同时 , 插入新的顺序有可能改变染色体 D N A原来的
编码 , 导致双亲不具备的新性状产生 。 这些都可能是引变处理后代叶形和 色泽等变化多
样性的原因 。
试验中观察到的转化处理后代某些个体程度不同地出现双亲不具备的茸毛现象 , 是
同比利时 L e .do u x 实验室 ( 1 9 7 1年 ) 在拟南芥菜 W i l n a z 突变体上观察到的茸毛现象 相
似 。 L e d 。 。 二强调指出 , 茸毛现象是突变 , 而且重复处理 , 突变频率增加 〔“ 〕。
2
. 关于内稼核吸醉抑制条件的选择
目前 , 大多数科学家认为 , 通过物理手段将外源D N A引入植物细胞 并 不困难 , 但
有一些证据认为 , 引入的外源D N A迅速被降解并用来重新合成内源 D N A 。 可见 , 保证
外源D N A顺利渗入靶细胞并不被内源核酸酶降解 , 则是诱导转化试验成败 的 关键 。 为
此 , 我们着重对内源核酸降解酶的抑制条件进行了选择 。 D N as e (美国is n g m a公司产
品 ) 降解 D N A的酶动力学试验结果表明 , 当酶量一定时 , 在一定范 围 内反 应 速 度随
底物量增加而提高 , 但达到最大反应 速度后 , 酶反应进程曲线并不呈矩形曲线 , 而是随
底物浓度增加反应速度下降 , 出现反馈抑制作
日吕.0。O
用 (见图 5 ) 。 说明只要增加降解产物浓度 ,
就可抑制内源核酸酶活性 。 因此 , 我们选用核
酪注射液 (核酸 、 酪蛋白水 解液 ) 、 L 一精 氨
酸和硫酸鱼精蛋白等抑制剂进行内源核酸酶抑
制效果的离体试验 , 试验结果表 明 , 以 D N A
溶浪与核酪注射液按 1 : 1配制外源 D N A 引变试
验的注射针荆 , 对内源核酸酶抑制效果为最好
(见表 3 ) 。 其中 , 碱性的 L一精氨酸 浓 度提
高时 , 会强烈改变反应液 p H值 , 不 能靠提高
浓度产生抑制作用 。 硫酸鱼精蛋白 会使 D N A
沉淀而影响转化试验 , 因此不宜使用 。
O班入撤克 / 龙形
图 5 底物量与反应速度关 系曲 线
2期 高等植物异源核酸转化研究 1
表 3 不同抑 制剂甘内源核酸酶抑制效果比较 .
酶 活
谕窗一降 _ _’朋 剂
性
\低 ( % )
DN 人 :抑制剂 N D人 ;抑制剂
2: 1
N D人 :抑制剂
核 酪 注 射 液
L一精氨酸 ( 0 .I M )
4 5
.
83
1 9
_
8 5
29
.
0 9
1 5
_
4 6
20
.
8 8
1 2
_
1 7
比Iv \一配 \二
* DN s a e来源 : 早皇白角果提取液 .
3
.关于受体细胞及其感受期选择问题
关于高等植物接受外来遗传物质 的适宜部位及其最敏感时期的研究 , 远不如微生物 /
感受态那样清楚 , 一般认为受精和胚胎发育阶段是高等植物接受远缘遗传物质的敏感时 /
期 〔 1 〕。 最近 , 在哺乳动物方面 , 以小鼠无性繁殖基因注入受精卵 , 再由受精卵发育成的
小鼠中 , 有 20 ~ 30 % 个体基因组中携带外源 D N A , 并能遗传给约 50 % 的后代 〔 8 〕 , 以及
把兔子 日一血红蛋白基因往入老鼠受精卵进行试验 , 经解剖幼鼠发现肝细胞中确实 携 带
这种外源基因 , 并完全整合在老鼠的一条特定的染色体上〔 9 〕。 这些研究成果进一步 表
明 , 高等生物受精卵可能是遗传转化试验较理想的受体细胞 。 我们在试验中采用陆续开
花授粉的子房作为受体材料 , 由花序基部到顶部角果中受精卵发育处于不同时期 , 就增
加了感受期的选择机会 , 这很可能是引变成功的重要一环 。
4
. 关于防止自然混杂问题
遗传转化研究的试材 , 除了选用 自交系外 , 还必须严防自然混杂 。 为此 , 我们在重
复试验中 , 对供体与受体材料进行了隔离种植。 受体早皇白自交系在微量核酸注射前严
格套袋自交 , 处理后继续套袋 l 周 , 以防止雌蕊柱头继续接受花粉造成混杂 。 由于试验
中对照株基本整齐一致 , 呈早皇 白株形特点 , 说明受体材料是纯的 。 可见 , 转化处理后
代群体中出现的表型变异 , 不可能是受体亲本分离或自然混杂造成的 , 似应认定是外源
D N A诱导转化的结果 。
参 考 文 献
〔 l 〕 黄驳麒 、 翁坚等: l o s x 。 遗传学报 , s ( 1 ) : 5 6一 6 2 。
〔 2 〕 中国科学院上海生物化学研究所 : 1 9 7 7 。 农作物远琢杂 交育种 : 6 一 10 。 科学技术文蔽出版社 ,
〔 3 〕 H ol l , F . B . : 1 980 。根食作物的远缘杂交译文集: 1一 6 。 并学出版社。
〔 4 〕 C o 立中e P , ` B . H . , H , B . T y P 6 。 日 : 1 9 5 0 。根食作物 的远缘杂交译文集 : 10 2一 x o g 。 科学出版社 。
〔 5 〕 C o e k i n g , E . C . e t a l . : 1 9 5 一 N a t u r e , 2 9 3 ( 5 5 3 0 ) : 2 6 5一 2 6 9 .
〔 6 〕 L e d o u x , L . e t a l . : r o 7 一, I n . I n f o r nt a t i v e M o l e e u l e s i n B i o l o g i e a l S y s t e m s , N o r t h -
H o l l a n d P u b l
.
C o
. ,
15 9一 x 7 5 .
〔 7 〕 M a h e s h w a r i , S . C . e t a l . : 10 5 0 . S e i . P r o g r e s s , 6 6 ( 2 6 3 ) : 4 5 5一 4 5 0 .
〔 s 〕 M a r x , J . L . : 1 9 5 2 . S e i e n e e , Z x s ( 4 5 7 1 ) : 4 5 0 .
〔 。 〕 S e o t t , A . : 1 9 8 2 . N e w S e i e n t i s t , s , 2 6 .
2 2沈 阳 农 学 院 学 报 1 6卷
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` t h e o t h e r w a s n o n -
s P e e i f i e i t y e f f e e t s h o w i n g a d C e r e a s C i n t h e r a t e o f e m e r g e n e e
, s l o w
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o f l e a v e s
.
T h i s s u g g e s t s t h a t t h e e x o t i e D N A i n t
r o d u e e d
一
i n t o t h e
r e e e P t o r t h r o u g h m i e r o i n j e e t i o n t e e h n i q u e e a n b e l e d i n g e n i t a l e e l l s a n d
e v e n e x P r e s s e d
.