全 文 ：　第 44 卷 2008 年第 1 期 　　　　　西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版)
　Vol.44　2008　No.1 　　　　　Journal of Nor thw est Norma l Unive rsity(Natural Science)　
收稿日期:2007-01-17;修改稿收到日期:2007-09-25
基金项目:甘肃省教育厅科研基金资助项目(0501B-15);西北师范大学青年基金资助项目(NWNU-QN-05-36);西北师范
大学学生学术科研资助金资助项目
作者简介:张继 (1963—), 女 , 陕西临潼人 , 研究员 , 博士生导师.主要研究方向为天然产物和生物高分子.
E-mail:jizhang@nwnu.edu.cn
高乌头愈伤组织诱导及增殖研究
张　继 , 廖天江 , 杨　宁 , 郑生霞 , 朱鹏锦 , 赵蕾蕾
(西北师范大学 生命科学学院 , 甘肃 兰州　730070)
摘　要:以高乌头(Aconitum Smomontanum Nakai.)植株为材料 , 研究了不同外植体(芽 、 叶片 、 叶柄)、 基本培养基 、
植物生长调节剂和培养条件对高乌头愈伤组织诱导和增殖的影响.结果表明:以 MS 或 B5 为基本培养基 , 附加不同
组合的 2 , 4-D、 NAA 、 KT 、 BA , 均可诱导产生愈伤组织 , 但不同外植体 、 不同生长调节剂组合对愈伤组织发生均有
一定影响;作为外植体 , 高乌头的芽 、 叶柄和叶片都可顺利诱导出愈伤组织 , 生长素 2 , 4-D对高乌头外植体的脱分化
起促进作用 , 但 NAA 却抑制愈伤组织的形成 , 细胞分裂素 KT 和 BA均能与 2 , 4-D 组合促进愈伤组织的诱导.在 B5
+2 , 4-D 2.0 mg·L-1 +BA 1.0 mg·L -1培养基上 , 光照 14 h·d -1 , 温度(22±1)℃, 最有利于高乌头愈伤组织的诱导.
在此条件下 , 30 d后 , 芽的诱导率达 95%, 叶片的诱导率达 70%, 叶柄的诱导率达 87.5%.愈伤组织最佳增殖条件
为 B5+2 , 4-D 2.0 mg·L-1 +KT 0.5 mg·L -1 , 光照 14 h·d -1 , 温度(22±1)℃.继代培养 14 d 后 , 平均增殖率达
197.5%.
关键词:高乌头;愈伤组织诱导;植物生长调节剂;增殖条件
中图分类号:Q 945.51　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1001-988Ⅹ(2008)01-0083-05
S tudies on callus induction and multiplication
of Aconitum smomontanum
ZHANG Ji , LIAO Tian-jiang , YANG Ning , ZHENG Sheng-xia , ZHU Peng-jin , ZHAO Lei-lei
(Colleg e of L ife Science , Northwest Normal Univ ersity , Lanzhou 730070 , Gansu , China)
Abstract:The callus induction of Aconi tum Smomontanum i s preliminary explored in this paper.Bud ,
leaf and leafstalk are cul tured on different cultural conditions.The resul ts show that the Aconitum
Smomontanum could be induced on MS or B5 medium supplemented w ith dif ferent kinds of ho rmones:
2 , 4-D , NAA , KT , BA.The frequencie s of callus induction are di fferent w hen dif fe rent explants are
cul tivated in medium supplemented w ith dif ferent types and dif ferent concentrations of ho rmones.The
cal lus is induced by using bud , leafstalk and leaf as explants;2 ,4-D could promo te dedif fe rentiat ion , but
NAA could inhibite the formation o f the callus.K T o r BA mixed wi th 2 , 4-D bo th promo t the induction.
A t(22±1)℃, B5+2 , 4-D 2.0 mg·L-1 +BA 1.0 mg·L-1 , 14 hoursilluminat ion per day is best fo r callus
induct ion.After 30 days , the inducing rates of bud , leaf and leafstalk each could be 95%, 70% and
87.5%.The optimized condi tion for multiplicat ion is B5+2 , 4-D 2.0 mg·L -1 +KT 0.5 mg·L-1 , 14
hours illuminat ion pe r day.After subcultured fo r 14 day s , the average mul tiplication rates could be up to
197.5%.
Key words:Aconitum smomontanum ;callus induction;hormone;multiplicat ion condi tion
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西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版)　　 第 44 卷　
Journa l of No rthwe st No rmal Univ ersity (Natural Science)　　 Vol.44　
　　高乌头(Aconi tum Smomontanum Nakai)是乌
头属多年生植物 , 具有温中止痛散寒燥湿的作用 ,
用于治疗风寒 、 关节冷痛或麻木瘫痪 、 跌打损伤
等[ 1 ] .20世纪 80年代韦璧瑜教授研制的国家一级
新药-氢溴酸高乌甲素(从高乌头中分得的
Lappaconitine而制成的氢溴酸盐)镇痛效果好 、 无
成瘾性深受消费者的欢迎 , 该药获国家科技进步三
等奖[ 2 ] .近年来随着消费需求的增多 , 该药的生
产与日俱增 , 使人们对其野生资源的索取日益加
剧 , 其野生资源濒临绝迹 , 从而成为制约氢溴酸高
乌甲素进一步发展的一个重要因素.因此 , 解决氢
溴酸高乌甲素等的药源问题已成为当务之急[ 3 , 4] .
为从根本上解决新药生产与原材料需求紧张的
矛盾 , 扩大其种质资源 , 笔者对取自高乌头不同部
位的外植体进行离体培养 , 试图建立愈伤组织体
系 , 以期为进一步开展大规模的高乌头细胞悬浮培
养 , 进行工业化生产高乌甲素提供新的原料来
源[ 5 , 6] .
1　材料与方法
1.1　材料
高乌头植株采自甘南 , 取其芽 、 叶片 、叶柄作
为外植体.
1.2　外植体灭菌
外植体先用洗衣粉水浸泡几分钟 , 再用自来水
冲洗干净 , 放入超净工作台内.在体积分数为
0.1%HgCI2溶液中浸泡灭菌 20 min , 转至体积分
数为 2%次氯酸钠溶液中浸泡消毒 15 min , 最后将
材料取出 , 在无菌水中漂洗 3 ～ 5次.
1.3　培养基
选用基本培养基 MS 和 B5[ 7 ] .MS 培养基添
加 30 g·L -1蔗糖 , 8 g·L-1琼脂 , 调整 pH 到 5.8;
B5培养基添加20 g·L-1蔗糖 , 8 g·L-1琼脂 , 调整
pH 到 5.5.培养基高压 121 ℃灭菌 20 min.
1.4　培养条件
置于 HPG2280H 人工气候箱内培养 , 温度为
(22±1)℃.诱导过程光照条件分两种处理:①
24 h暗培养后 , 光 、 暗交替培养 , 光照 14 h·d-1 ,
光照强度 2 000 lx ;②全程黑暗培养.继代培养光
照 14 h·d-1 , 光照强度 2 000 lx.
1.5　愈伤组织诱导出愈率和增殖率的计算方法
在诱导和培养过程中 , 及时发现并排除染菌外
植体 , 以未污染的外植体计算诱导出愈率.计算公
式为
出愈率(%)=
　　　　　 出愈外植体块数(接种数-染菌块数)×100%.
先称量继代接种前培养瓶的重量 , 再称接种
后的重量 , 从而得到接种的愈伤组织重量.培养
14 d后 , 再次进行接种时 , 按同上方法测得 14 d
后愈伤组织的重量 , 通过以下公式求增殖率
接种鲜重(mg/瓶)=
　　　接种后瓶重(mg)-接种前瓶重(mg),
收获鲜重(mg/瓶)=
　　　收获前瓶重(mg)-收获后瓶重(mg),
增殖率(%)=收获鲜重接种鲜重×100%.
2　结果与分析
2.1　不同来源的外植体对消毒效果的影响
以野外生长的新生幼叶和室内盆栽生长一段时
间后的新生幼叶为材料 , 试验外植体来源不同对消
毒效果的影响.结果表明:在条件相同的情况下 ,
野生来源的外植体污染较严重 , 污染率达 55%;
而室内盆栽的污染率仅为 30%.表 1列出了两种
外植体来源分别对消毒效果的影响.
表 1　不同外植体来源对消毒效果的影响
Table 1 Effecto f different source of explantson
外植体来源
(Source o f
explants plant)
接种块数/个
(Number of
ino culation)
污染数/个
(Numbe r of
po llution)
污染率/ %
(Rate of
po llution)
野外(Open country) 40 22 55
室内盆栽
(Indoo rpo tted) 40 12 30
2.2　培养基及其诱导条件的筛选
基本培养基的类型是愈伤组织诱导的一个重要
影响因素 , 本实验选用 MS 和 B5培养基 , MS 和
B5培养基分别添加 2 mg·L-1的 2 , 4-D.在超菌工
作台内接种 30 d 后 , 观察并计算高乌头在两种培
养基下的诱导出愈率(表 2).
实验得知 , 在 B5 培养基上 , 光照 14 h·d-1 ,
高乌头愈伤组织诱导率最高 80%;在 MS 培养基
上 , 光照 14 h·d-1 , 诱导率次之 , 为 60%;在 B5
和 MS 培养基上 , 暗培养条件下 , 诱导率相对都较
低.因此 , B5培养基在光照 14 h·d-1条件下对高
乌头愈伤组织的诱导最为有利.
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　2008 年第 1 期 　　张　继等:高乌头愈伤组织诱导及增殖研究
　2008　No.1 　　　Studies on callus induc tion and multiplication o f Aconitum smomontanum　
表 2　基本培养基及培养条件对比
Table 2 Contr ast o f basalmedium and differ ent culture conditions
编号
No.
培养基
(Basal medium)
外植体数/个
　(Number of e xplants)　
愈伤组织数/块
　　(Number of callus)　　
出愈率/ %
　(Callus inducing rates)　
　 　 光照/(14 h·d-1) 暗 光照/(14 h·d-1) 暗 光照/(14 h·d -1) 暗
1 MS+2 , 4-D 40 40 24 23 60 51.52
2 B5+2 , 4-D 40 40 30 21 80 50.5
2.3　植物生长调节剂的筛选
2.3.1　生长素对高乌头愈伤组织诱导的影响　选
择 B5基本培养基 , 添加不同浓度的生长素 2 , 4-D
和 NAA , 通过接到其中外植体的出愈率来筛选出
最优化的生长素及其对高乌头愈伤组织诱导的最适
浓度(表 3).实验表明 , 不同生长素对高乌头愈伤
组织诱导具有显著差异:2 , 4-D比 NAA 更适合于
高乌头愈伤组织的诱导 , 并且在一定范围内随着
2 , 4-D浓度的增加 , 愈伤组织诱导率随着增加.当
浓度达到 2.0 mg·L -1时 , 诱导率达到一个最大值 ,
浓度在 3.0 mg·L-1以上 , 则抑制愈伤组织诱导 ,
诱导率也呈现下降趋势.在 NAA 与 BA 组合的培
养基上 , 高乌头愈伤组织诱导率很低 , 说明 NAA
不适于高乌头外植体脱分化成愈伤组织.
2.3.2　细胞分裂素对高乌头愈伤组织诱导的影响
　植物愈伤组织诱导的优化通常需要生长素和细胞
分裂素协调.选取 2 ,4-D 2.0 mg·L-1的最适浓度 ,
配比以两种不同浓度的细胞分裂素 BA 、 K T 进行
优化试验(表 4).
表 3　生长素对愈伤组织诱导的影响
Table 3 Effecto f diffe rent kinds and concentr ations auxin on induction of callus
编号
No.
基本培养基
(Basalmedium)
激素(Hormone)
　　/(mg·L-1)　　
2 , 4-D　NAA　BA
外植体数/个
(Number o f Explants)
愈伤组织数/块
(Number of callus)
出愈率/ %
(Callus inducing r ates)
1 B5 1.0 　 0.5 40 24 60.0
2 B5 2.0 　 0.5 40 33 82.5
3 B5 3.0 　 0.5 40 29 72.5
4 B5 4.0 　 0.5 40 25 62.5
5 B5 　 0.1 0.5 40 5 10.25
6 B5 　 0.5 0.5 40 1 2.50
7 B5 　 1.0 0.5 40 0 0
8 B5 　 2.0 0.5 40 0 0　
表 4　细胞分裂素对愈伤组织诱导的影响
Table 4 Effectof diffe rent kinds and concentra tions cy tokinin on induction of callus
编号
No. 基本培养基(Basalmedium) 激素(Hormone)　　/(mg·L-1)　　 外植体数/个(Number o f Explants) 愈伤组织数/块(Number of callus) 出愈率/ %(Callus inducing r ates)
　 　 2 , 4-D NAA BA
1 B5 2.0 0.2 　 40 27 67.5
2 B5 2.0 0.5 　 40 29 82.5
3 B5 2.0 1.0 　 40 25 62.5
4 B5 2.0 1.5 　 40 22 55.0
5 B5 2.0 　 0.0 40 30 75.0
6 B5 2.0 　 0.5 40 33 82.5
7 B5 2.0 　 1.0 40 34 85.0
8 B5 2.0 　 1.5 40 32 80.0
9 B5 2.0 　 2.0 40 29 72.5
　　实验表明 , BA 和 KT 都能与 2 , 4-D 2.0 mg·
L-1组合诱导出高乌头愈伤组织.BA 在 0 ～ 1 mg·
L-1范围内 , 随着浓度增加 , 诱导率增大 , 当 BA
浓度大于 1 mg·L-1时 , 愈伤组织诱导率开始下降 ,
说明浓度高于 1.0 mg·L -1 BA 抑制愈伤组织诱导;
K T 则在 0.5 mg·L-1时最为适宜 , 当大于此值时 ,
愈伤组织诱导受到抑制.综合比较 , 在B5 +2 ,4-D
2.0 mg·L-1 +BA 1 mg·L-1组合的培养基上高乌头
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西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版)　　 第 44 卷　
Journa l of No rthwe st No rmal Univ ersity (Natural Science)　　 Vol.44　
愈伤组织的诱导率最高.
2.4　不同外植体对高乌头愈伤组织诱导的影响
以芽 、 叶片和叶柄为外植体 , 接种于 B5 +
2 , 4-D 2.0 mg·L-1 +BA 1.0 mg·L-1(简称 BY)培
养基上 , 试验取自高乌头不同部位的外植体愈伤组
织诱导的情况(表 5).结果显示:芽 、 叶片和叶柄
均可诱导形成愈伤组织 , 芽诱导率 95%, 叶片诱导
率 70%, 叶柄诱导率 87.5%.3种不同外植体诱导
的愈伤组织在生理形态上有一定的细微差异 , 叶片
诱导的愈伤组织呈白色略黄 , 疏松;芽和叶柄诱导
的愈伤组织呈黄色 , 紧密.通过对比发现 , 芽和叶
柄诱导的愈伤组织增殖明显比叶片诱导的快 , 但芽
诱导的愈伤组织在增殖过程中容易褐变(图 1).
图 1　不同外植体诱导的愈伤组织生理形态
F ig 1 Phy siology and mo rpho lo gy of callus induced from diffe rent e xplants
表 5　不同外植体来源对愈伤组织诱导的影响
Table 5 Effecto f diffe rent source o f explants on induction of callus
外植体(Explants plant) 培养基(Medium) 外植体数/个(Number o f explants) 愈伤组织数/块(Number o f callus)
出愈率/ %
(Callus inducing
r ates)
愈伤组织生长情况
(Grow the condition
o f callus)
叶(Leaf) BY 40 28 70 +
芽(Bud) BY 40 38 95 +++
叶柄(Leaf stalk) BY 40 35 87.5 ++++
　　注:+生长差;++生长一般;+++生长较好;++++生长最好.
2.5　愈伤组织的继代培养及其增值率
选择健康愈伤组织分成小块接种于新鲜培养基
上进行继代培养.结果表明 , 添加 2 ,4-D 2.0 mg·
L-1和 K T 0.5 mg·L-1的 B5培养基愈伤组织增殖
率最高 , 达到197.5%;当 2 ,4-D浓度超过3.0 mg
·L-1时 , 愈伤组织呈灰黄色 , 并且极易褐化.
如果在继代培养中 , 延长培养时间 , 不及时转
接 , 愈伤组织的颜色就会加深 , 之后再进行继代培
养 , 则生长速度急度转缓.因此 , 为保持愈伤组织
旺盛的生长 , 必须持续及时转接 , 每次继代时间大
约在 30 d左右为宜[ 8 ] .
3　结论
高乌头野生植株作为愈伤组织诱导的材料 , 污
染较为严重 , 多次接种都难获得无菌的材料 , 故应
采取预处理措施:先将野生植物植株掘出 , 剪除地
上茎叶部分 , 改为室内盆栽 , 等其根部侧芽生长出
新叶后 , 再行采样接种;也可以将芽接 B5+BA
1.0 mg·L-1 +NAA 0.1 mg·L-1中 , 20 d 后生长
分化出大量的无菌叶 , 这样就可大大增加无菌材料
获得的途径.
通过 MS 和 B5 基本培养基的筛选试验得知:
MS 和 B5在光暗交替和黑暗条件下添加一定的植
物生长调节剂均可诱导出高乌头愈伤组织.MS 基
本培养基在乌头属其它植物愈伤组织诱导中被广泛
采 用 , 林 静 , 何 毅[ 9 ] 在 乌 头 (Aconitum
Carmichael i Debx .)愈伤组织诱导中采用 MS.瞿
素萍等[ 10] 在川乌头(Aconi tum Carm ichael)组培中
也采用 MS.但本试验发现 , 外植体和愈伤组织在
MS 中培养褐变程度相对 B5 严重 , 不同程度上影
响愈伤组织的诱导和增殖 , 所以 , B5 培养基是高
乌头愈伤组织诱导生长的最适宜培养基.
通过植物生长调节剂的筛选实验得知:生长素
2 ,4-D能促进高乌头外植体脱分化形成愈伤组织 ,
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　2008　No.1 　　　Studies on callus induc tion and multiplication o f Aconitum smomontanum　
而 NAA 则抑制愈伤组织的形成;细胞分裂素 K T
和 BA均能促进高乌头愈伤组织的形成.较好的激
素组合为 BA 和 2 ,4-D , 其诱导最佳培养基是B5+
2 , 4-D 2.0 mg·L-1 +BA 1.0 mg·L-1 .徐秀泉 , 于
荣 敏 , 赵 昱 等 人[ 11] 在 黄 花 乌 头 (Aconi tum
Coreanum)愈伤组织诱导中也发现较好的激素组合
为 BA和 2 ,4-D.
高乌头外植体被诱导出愈伤组织后 , 需通过继
代培养使愈伤组织增殖生长.实验表明 , 高乌头愈
伤组织增殖率较低 , 在 B5 +2 , 4-D 2.0 mg·L -1 +
K T 0.5 mg·L-1培养基下 , 增殖效果相对较高 , 增
殖率可达 197.5%.但随着 2 , 4-D浓度增大到 3.0
mg·L-1以上 , 愈伤组织的增殖生长受到抑制 , 说
明过高或过低均不利于愈伤组织的生长.李琰 , 姜
在民等[ 12] 在研究杜仲叶片愈伤组织诱导和生长的
实验中也得出相同的结论.
参考文献:
[ 1] 　中国西北高原生物研究所编著.青海经济植物[ M] .
西宁:青海人民出版社 , 1987:8.
[ 2] 　韦壁瑜 , 孔宪武 , 赵起远 , 等.高乌甲素的化学成
分[ J] .中药通报 , 1981(6):26.
[ 3] 　彭崇胜 , 王建忠 , 简锡贤 , 等.高乌头和彭州岩乌
头中生物碱成分的研究[ J] .天然产物研究与开发 ,
1999 , 12(4):45-52.
[ 4 ] 　彭崇胜 , 陈东林 , 陈巧鸿 , 等.高乌头根中新的二
萜生物碱 [ J] .有机化学 , 2005 , 25(10):1235-
1239.
[ 5 ] 　肖尊按.植物生物技术[ M] .北京:化学工业出版
社 , 2005:3.
[ 6 ] 　肖培根 , 王锋鹏 , 高　峰 , 等.中国乌头属植物药
用亲缘学研究[ J] .植物学报 , 2006 , 44(1):1-37.
[ 7 ] 　张献龙 , 唐克轩.植物生物技术[ M] .北京:科学
出版社 , 2004:6.
[ 8 ] 　于荣敏 , 徐秀泉 , 赵　昱 , 等.不同理化因子对黄
花乌头花药愈伤组织诱导的影响[ J] .暨南大学学
报:自然科学版 , 2003 , 24(6):109-114.
[ 9 ] 　林　静 , 何　毅.乌头组培快繁的技术探讨[ J] .贵
州科学 , 1998 , 16(2):120-123.
[ 10] 　瞿素萍 , 陈　伟 , 屈云慧 , 等.组织培养法快速繁
殖川乌头种苗[ J] .中国野生植物资源 , 2004 , 23
(4):62-63.
[ 11] 　徐秀泉 , 于荣敏 , 赵　昱.药用植物黄花乌头植株
再生系统的建立[ J] .中药材 , 2004 , 27(11):797-
799.
[ 12] 　李　琰 , 姜在民 , 唐　锐.杜仲叶片愈伤组织诱导
的激素优化研究[ J] .植物研究 , 2006 , 26(2):182
-186.
(责任编辑　孙晓玲)
(上接第 82页)
看 , 芽的诱导极其容易 , 本实验中初代培养很低的
芽诱导率受到高污染率的影响 , 因而不具有普遍
性 , 愈伤组织培养中 , 愈伤组织的诱导实验很成
功 , 愈伤组织的分化仅有根产生 , 芽的分化尚需进
一步实验.
参考文献:
[ 1] 　徐耀良 , 陈艺林.浙江凤仙花属新分类群[ J] .植物
分类学报 , 1999 , 37(2):194-200.
[ 2] 　熊源新.贵州凤仙花属二新种[ J] .植物分类学报 ,
1996 , 34(1):98-101.
[ 3 ] 　陈艺林.国产凤仙花属新种[ J] .植物分类学报 ,
1999 , 37(1):88-89.
[ 4 ] 　危建安 , 谢　琪.凤仙花研究进展[ J] .时珍国医国
药 , 2001 , 12(2):164-165.
[ 5 ] 　韦毅刚.广西之植物新资讯[ J] .广西植物 , 1998 ,
18(3):226-228.
[ 6 ] 　凤仙花茎段培养与快速繁殖[ J] .辽宁师专学报 ,
2006 , 8(3):107-108.
[ 7 ] 　曹孜义 , 刘国民.实用植物组织培养技术教程[ M] .
兰州:甘肃科学技术出版社 , 1996:10-74.
(责任编辑　陈广仁)
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