全 文 ：收稿日期:2009-12-01基金项目:兰州军区医药卫生科研项目(LXH04-6)作者简介:王敏(1978-),男 ,讲师 ,博士 ,主要从事肿瘤药理研究;Tel:0931-8915184, E-mail:wangmin@lzu.edu.cn。＊通讯作者:贾正平 , Tel:0931-8994652, E-mail:empriqqq@public.lz.gs.cn。
瑞香狼毒总生物碱的抗肿瘤活性和机理研究
王　敏1 ,王学习 1 ,贾正平 2＊ ,王　彬2
(1.兰州大学新药临床前研究重点实验室 ,甘肃 兰州 730000;2.兰州军区兰州总医院全军临床药理基地 ,
甘肃 兰州 730050)
　　摘要　目的:研究瑞香狼毒总生物碱的提取分离 、纯化和含量测定 , 确定总生物碱成分的体外抗肿瘤作用 ,通
过对细胞周期和凋亡的检测研究抗肿瘤机理。方法:采用酸提碱沉淀法提取总生物碱 , 用阳离子交换树脂进行纯
化 , 剩余滴定法测定总生物碱含量。体外抗肿瘤活性研究采用 MTT比色法和集落形成法测定 , 靶细胞采用人胃癌
细胞 SGC-7901、人肝癌细胞 BEL-7402和人白血病细胞 HL-60, 流式细胞仪检测药物作用后肿瘤细胞周期和细胞凋
亡情况。结果:提取纯化后瑞香狼毒总生物碱含量为 68.24%, 总生物碱对体外培养的三株肿瘤细胞有较强的抑制
作用 , 主要机理为导致细胞 G0 /G1期阻滞 , 诱导肿瘤细胞凋亡。结论:瑞香狼毒总生物碱提取物具有较强的体外抗
肿瘤作用。
关键词　瑞香狼毒;生物碱;含量测定;抗肿瘤;凋亡;体外
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)12-1919-04
　　瑞香狼毒(StelerachamaejasmeL.)为瑞香科狼
毒属植物 ,为常用中药 “狼毒”3种原植物之一 ,具有
显著的抗肿瘤活性 ,有关瑞香狼毒抗肿瘤活性及其
机制研究 ,本研究小组已做了 10多年的基础研究工
作 ,对瑞香狼毒水提物 、醇提物的抗肿瘤作用 、血清
药理学及分子生物学机理做了较全面细致的工作 。
已从瑞香狼毒中分离出总黄酮成分和总木脂素成
分 ,对其抗肿瘤活性进行了研究 〔1-3〕。生物碱作为植
物中普遍存在的成分 ,大多具有较强的生物活性 ,故
对瑞香狼毒中的总生物碱成分进行了提取和含量测
定 ,通过体外细胞培养评价瑞香狼毒中总生物碱提
取物的抗肿瘤效果。采用流式细胞术检测总生物碱
对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响 ,揭示其抗肿瘤
机理。
1　材料与仪器
1.1　细胞株　人胃癌细胞 SGC-7901、人肝癌细胞
BEL-7402和人白血病细胞 HL-60均引自中国科学
院上海细胞生物研究所的细胞库 ,用 RPMI-1640培
养液(含 10%的小牛血清 , 100 U/L青霉素 , 100 mg/
L链霉素), 37 ℃, 5% CO2 ,相对湿度 100%培养 ,
0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.2　药物与试剂　瑞香狼毒由兰州市药材供应站
提供 ,经西北师范大学植物所晏民生副教授鉴定为
瑞香科植物瑞香狼毒(StelerachamaejasmeL.)的干
燥根茎;主要药品与试剂 RPMI-1640培养基干粉 ,
Gibco公司产品;MTT和 PI为 Sigma公司的产品;新
生牛血清为四季青公司的产品;其余试剂均为国产
分析纯。
1.3　主要仪器 　倒置相差显微镜:OLYMPUS
IX70 , OLYMPUS公司产品;BIO-RADiMark自动酶
标仪 ,日本;流式细胞仪 (FCM):EPICSXL, COUL-
TER公司产品。
2　方法
2.1　总生物碱的提取
2.1.1　酸提碱沉法提取总生物碱:瑞香狼毒药材
粉碎 ,过 60目筛 , 80%乙醇溶液加热回流提取 3次 ,
分别为 2、1.5、1 h,合并滤液 ,减压浓缩至浸膏状。
用 3倍体积 1%盐酸提取生物碱成分 ,过滤 ,合并盐
酸提取液 ,用氨水调 pH10 ～ 11,静置过夜 ,沉淀即
为粗总生物碱 。
2.1.2　阳离子交换树脂纯化:粗总生物碱用酸水
液充分溶解 ,加入预处理好的 001×7阳离子交换树
脂 ,上样完毕后依次用去离子水 、70%乙醇洗去杂质
成分 ,最后用 2 mol/L氨水 80%乙醇洗脱 ,收集氨
性乙醇流分 ,减压浓缩至干 ,为总生物碱成分 。
2.1.3　总生物碱的含量测定:精密称取减压干燥
至恒重的总生物碱提取物约 30 mg,置 100 mL三角
瓶中 ,精密加硫酸滴定液(0.005 mol/L)25 mL与甲
基红 -亚甲蓝混合指示液 2滴 ,用氢氧化钠滴定液
(0.01 mol/L)滴定 ,即得。经测定 , “2.1.2”项总生
物碱提取物的总生物碱含量为 68.24%。
2.2　MTT法检测对肿瘤细胞的杀伤作用　试样用
二甲基亚砜(DMSO)溶解配制 ,加入等量 DMSO作
为对照 ,控制 DMSO终浓度在 5%以内 。取对数生
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长期细胞 ,消化 ,吹打均匀 ,稀释至 5 ×104 /mL,以
190 μL/孔接种至 96孔板 ,培养 24 h后加药 10 μL
处理。实验设阴性对照组(细胞悬液 +DMSO,用于
计算抑制率 )、空白对照组(RPMI-1640培养液 +
DMSO,用于消除培养液颜色误差)、总生物碱各剂
量组(细胞悬液 +不同浓度的总生物碱),总生物碱
各剂量颜色对照组(RPMI-1640培养液 +各浓度药
物 ,用于消除药物颜色误差)每个浓度设 3复孔 ,置
培养箱培养 44 h后 ,取出每孔中加入 MTT10 μL(5
mg/mL),再培养 4 h,吸去培养液 ,加入 DMSO150
μL,震荡 10 min,酶标仪单波长 570 nm测定每孔光
密度 D(λ),实验重复 3次 ,并按下列公式计算抑制
率(IR)。
抑制率(IR)=〔D(λ)阴性 -D(λ)空白〕 -〔D(λ)实验 -D(λ)颜色 〕D(λ)阴性 -D(λ)空白 ×100%
2.3　集落形成法检测对肿瘤细胞增殖能力的影响
　肿瘤细胞有无限增殖的潜力 ,可以由单个细胞成
长为一个细胞集落 ,但细胞活力降低或药物作用后 ,
细胞不会直接死亡 ,而是增殖数代后停止分裂 ,不能
生长为一个集落 ,故通过集落形成检测药物对细胞
增殖能力的影响 。
2.3.1　贴壁细胞 SGC-7901、BEL-7402细胞的集落
形成:取对数生长期的细胞 ,消化 ,计数 ,调整细胞浓
度(分别为 200、250、300、400、500、700个 /mL),取 6
孔培养板 ,每孔加细胞悬液 4.95 mL,培养 24 h,加
入不同浓度药物 50 μL(0、 0.1、 0.2、0.4、 0.8μg/
mL),对照组加入等量 DMSO,每个剂量 3个平行
孔 。继续培养 2 ～ 3 w后取出 ,小心吸去培养液 ,生
理盐水冲洗 1次 , (V)醋酸∶甲醇 =1∶3固定 30 min,
生理盐水冲洗 1次 , Gimsa染液染色 15 min,蒸馏水
冲洗 ,解剖镜下计数直径大于 50 mm(或含 50个细
胞以上)的集落数 ,下列公式计算细胞集落形成率。
　集落形成率 =某剂量的集落形成数某剂量下种植的细胞数 ×空白集落形成率 ×100%
2.3.2　悬浮细胞 HL-60的集落形成:取对数生长
期的细胞 , 计数 ,调整细胞浓度 1 ×105 /mL,取 50
mL培养瓶 ,每瓶加入细胞悬液 4.95 mL,加入不同
浓度药物 50 μL(0、0.1、0.2、0.4、0.8),对照组加入
等量 DMSO,培养 24 h,取各细胞离心 , PBS漂洗 2
次 ,用 20%小牛血清的 1640培养液悬浮 ,细胞稀释
为 2 ×103 /mL,取细胞悬液 9 mL,加入 HL-60细胞
培养上清和 56 ℃融化的 2%琼脂各 0.9 mL,迅速混
匀 ,按每皿 3 mL分装至 5 cm培养皿中 ,每个剂量 3
个平行孔 。将细胞培养皿置培养箱中培养 2 ～ 3 w后
取出 ,肉眼计数白色集落 ,计算集落形成率。
2.4　流式细胞仪检测 BEL-7402细胞凋亡和周期
分布　取对数生长期细胞 ,消化 ,计数 ,调整细胞浓
度至 5 ×105 /mL,每瓶加入 9.9 mL细胞悬液 ,培养
24 h后 ,对照组加 DMSO100 μL,实验组加入总生
物碱 100 μL(终浓度 100 μg/mL),培养 48、72 h后 ,
1 000 r/min离心 5 min,收集细胞 ,将细胞转移至
1.5 mLEppendorf管中 ,用冷 PBS(pH7.4)洗 2次 ,
弃上清 ,加入 300 μLPBS(pH7.4),制成细胞悬液。
将 0.7 mL预冷的无水乙醇沿管壁分多次加入 , 4 ℃
固定过夜。上机前用 PBS洗 2遍 ,加入 100 μg/mL
RNA酶 , 37 ℃消化 30 min,酶切 RNA;加 50 μg/mL
碘化丙啶(PI), 4 ℃避光染色 。用 200目细胞筛过
滤后在流式细胞仪上检测(激发波长 488 nm,吸收
波长 600 nm)。用计算机自带 Multicycle(Phoenix
FlowSystem, SanDiego, CA, USA)软件分析 ,计算出
细胞周期分布和凋亡情况。
3　结果
3.1　瑞香狼毒总生物碱和长春新碱对肿瘤细胞的
杀伤作用　MTT法检测结果表明 ,瑞香狼毒总生物
碱与长春新碱对体外培养的人胃癌细胞 SGC-7901
和人肝癌细胞 BEL-7402增殖均表现出较强的抑制
作用 ,呈现较好的剂量依赖性 。同时 ,瑞香狼毒总生
物碱的对以上 2株细胞的抑制作用略强于长春新
碱;对体外培养的人白血病细胞 HL-60的增殖有一
定的抑制作用 ,但弱于长春新碱;线性回归法计算
IC50值 ,结果见表 1、表 2。
　　表 1　 MTT法检测瑞香狼毒总生物碱(Alk)与长春新碱(VCR)对肿瘤细胞杀伤作用(%)
剂量 /(μg/mL)
Alk
BEL-7402 SGC-7901 HL-60
剂量 /(μg/mL)
VCR
BEL-7402 SGC-7901 HL-60
40 10.44 0 4.22 16 17.20 15.45 3.92
80 20.24 6.99 13.76 32 17.42 20.32 5.02
160 24.61 28.68 16.52 64 20.88 22.30 17.98
320 48.86 42.64 21.11 128 35.82 33.17 28.97
640 88.27 82.94 41.85 256 51.49 50.20 50.00
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　表 2　 MTT法检测瑞香狼毒总生物碱
(Alk)与长春新碱(VCR)IC50值
组别 BEL-7402 SGC-7901 HL-60
Alk 294.61 246.71 2405.56
VCR 397.97 353.27 357.72
3.2　瑞香狼毒总生物碱和长春新碱对肿瘤细胞增
殖的抑制作用　集落形成法检测结果表明:瑞香狼
毒总生物碱对以上 3株细胞的克隆增殖均有抑制作
用 ,表现出较好的剂量依赖性抑制作用 ,但效果低于
长春新碱;线性回归法计算 IC50值 ,结果见表 3、4。
　　表 3　 瑞香狼毒总生物碱(Alk)与长春新碱(VCR)对各细胞株集落形成的抑制率(%)
剂量 /(μg/mL)
Alk
BEL-7402 SGC-7901 HL-60
剂量 /(μg/mL)
VCR
BEL-7402 SGC-7901 HL-60
0.2 21.23 23.12 45.54 0.01 59.96 21.82 46.51
0.4 32.56 35.60 72.95 0.02 79.28 60.28 67.44
0.8 58.21 72.58 91.25 0.04 94.47 85.37 90.70
　表 4　　　瑞香狼毒总生物碱(Akl)与长春新碱(VCR)
对各细胞株的 IC50值(μg/mL)
组别 BEL-7402 SGC-7901 HL-60
Alk 0.643 0.476 0.429
VCR 0.0068 0.0176 0.0113
3.3　瑞香狼毒总生物碱对 SGC-7901细胞周期分
布和诱导凋亡作用　流式细胞术检测显示 100 μg/
mL总生物碱作用 SGC-7901细胞 48、72 h,可以观
察到 G1前期的亚二倍体 DNA峰(Sub-G1),即凋亡
峰 ,亚二倍体细胞比例与对照组比较差异具有统计
学意义 ,表明总生物碱作用 48、72 h后引起 SGC-
7901细胞凋亡;G0 /G1期细胞比例较对照组明显增
加 ,有明显的 G1期阻滞作用;S期细胞比例减少 ,
G2 /M期细胞比例减少 ,结果见表 5。
　表 5　　　瑞香狼毒总生物碱(Alk)对 SGC-7901
细胞周期分布和凋亡比例的影响
组别 Sub-G1 /% G0 /G1 /% S/% G2 /%
48 hcontrol 6.3 55.7 35.9 8.4
48 hAlk 18.6 81.4 12.2 6.4
72 hcontrol 4.4 61.4 27.2 11.4
72 hAlk 19.2 72.0 22.9 5.2
4　讨论
瑞香狼毒是近年来在肿瘤化疗中备受关注的药
物 ,其中含有多种化学成分 ,如:香豆素类化合物 、黄
酮类化合物 、二萜类化合物等 〔4〕 ,有研究认为 ,瑞香
狼毒的抗肿瘤成分主要为瑞香狼毒水提取物及尼地
吗啉。然而 ,尼地玛琳因为有效剂量和毒性剂量接
近 ,降低了开发利用的价值 〔5〕。本研究小组近年来
对瑞香狼毒抗肿瘤有效成分进行了系列研究 ,从中
分离了石油醚提取物 、总黄酮和总木脂素成分 ,证明
石油醚提取物和总木脂素成分具有最强的抗肿瘤活
性 ,推测其中真正有效成分依然为尼地玛琳 〔6〕。故
笔者提取分离总生物碱成分 ,进行含量测定建立质
量控制标准 , 通过肝癌 BEL-7402细胞 、胃癌 SGC-
7901细胞和 HL-60细胞检测体外抗肿瘤活性。研
究表明 ,瑞香狼毒总生物碱对肝癌 BEL-7402细胞
和胃癌 SGC-7901细胞表现出较强的杀伤作用 ,作
用强于长春新碱 ,然而对 HL-60细胞作用很弱 ,表
明其有一定的抗瘤谱 ,是由于细胞贴壁或悬浮的生
长形态还是细胞种属选择性还有待进一步研究。瑞
香狼毒总生物碱对细胞集落形成的 IC50要小于杀伤
剂量 ,表明在低剂量时可以抑制肿瘤细胞的增殖 ,较
高剂量时表现为直接对肿瘤细胞的杀伤 ,但对肿瘤
细胞增殖的抑制作用却远低于长春新碱 ,推测瑞香
狼毒总生物碱主要为对细胞的杀伤作用 ,从细胞周
期和凋亡的检测中可以看出 ,诱导细胞凋亡作用强
而对肿瘤细胞周期影响较小 ,总生物碱作用细胞后
引起的细胞凋亡与时间依赖关系不是非常明显 ,通
过药物作用 -时间曲线可以看出 48 h药物作用最
强 ,随时间延长杀伤作用无明显增加 ,故 48 h为药
物作用最佳时间。在细胞周期表现出 G1期增多 , S
期细胞比例减少 , G2 /M期细胞比例减少 ,有明显的
G1期阻滞作用 ,表明阻滞快速分裂的肿瘤细胞进入
下一个分裂周期 ,使细胞停滞在分裂前期。本研究
结果表明 ,瑞香狼毒总生物碱提取物具有较好的体
外抗肿瘤作用 ,而目前文献尚未见对该类成分的研
究 ,笔者提取的总生物碱成分可以进一步分离纯化
并进行体内抗肿瘤活性研究 。
参 考 文 献
[ 1] 王彬 , 王锐 ,贾正平 , 等.瑞香狼毒系统溶剂法分离提取
部位的体外抗肿瘤活性 [ J] .中药材 , 2004, 27(5):359-
361.
[ 2] 贾正平 , 樊俊杰 ,王彦广 , 等.瑞香狼毒水提物小鼠药物
血清对小鼠白血病 L1210细胞增殖 、克隆形成和 DNA
合成的影响 [ J] .中草药 , 2001, 32(9):807-809.
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[ 3] 王敏 ,贾正平 , 马骏 ,等.瑞香狼毒总黄酮提取物的抗肿
瘤作用 [ J].中国中药杂志 , 2005, 30(8):603-606.
[ 4] 张天柱 ,魏春雁 , 刘玉峰 .瑞香狼毒生物活性成分的提
取与分离 、纯化方法 [ J] .特产研究 , 2006, 1:57-60.
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daphnanetypediterpenegnidimacrinisolatedfromStelera
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肿瘤活性 [ J] .兰州大学学报(自然科学版), 2008, 44
(2):63-65.
罗勒不同提取物对 3种实验性血栓形成模型的影响
周文婷 1 ,依把代提·托合提 1 ,田树革2 ,何志琴 1 ,艾尼瓦尔 ·吾买尔 1＊
(新疆医科大学 1.药学院药理教研室;2.中医学院实验中心 ,新疆 乌鲁木齐 830054)
　　摘要　目的:通过 3种不同的动物体内血栓形成模型 ,考察罗勒不同提取物对血栓形成的影响 ,比较不同极性
活性组分作用差别 , 进而探讨其有效作用成分类型及筛选最佳提取工艺。 方法:采用小鼠肺血栓模型 、FeCl3诱导
大鼠颈动脉血栓模型及大鼠下腔静脉血栓模型 3种实验性血栓模型 ,考察罗勒不同提取物的抗血栓形成作用。结
果:罗勒不同提取物均可提高胶原蛋白-肾上腺素混合诱导剂所致肺血栓小鼠的存活率 , 延长 FeCl3诱导大鼠颈动
脉血栓形成时间 , 并减轻血栓湿质量 ,减轻结扎法所致下腔静脉血栓湿质量 ,且其中以乙醇为溶剂采用超声波提取
法的罗勒提取物效果最为显著。结论:罗勒提取物有显著的抗血栓作用 , 其主要有效组分可能为某些极性较小的
脂溶性黄酮类成分。
关键词　罗勒提取物;血栓;提取方法
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)12-1922-04
收稿日期:2010-01-25基金项目:自治区高校科研计划(XJEDU2006130)作者简介:周文婷(1983-),女,在读硕士研究生 ,主要从事心血管药理研究;Tel:15899168882, E-mail:sherry zwt@126.com。＊通讯作者:艾尼瓦尔·吾买尔 , Tel:0991-24362421。
　　罗勒是维吾尔医应用历史悠久的常用药材之
一 ,是唇形科罗勒属植物罗勒 (Ocimumbasilicum
L.)的地上部分 〔1〕。罗勒是维吾尔医用于心脑血管
疾病的首选药材之一 ,具有治疗心肌梗塞及腹泻 、抗
肿瘤等作用 〔2-4〕。现代化学研究表明 ,罗勒全草的主
要成分为挥发油 、黄酮类 、香豆素类 、甾体化合物等 ,
其中挥发油含量最大〔5, 6〕。黄酮类化合物的主要提
取方法是有机溶剂提取法 ,用超声波法提取黄酮类
物质 ,是目前比较新的方法 〔7〕。本研究中 ,笔者以
水或 70%乙醇为溶剂 ,采用超声波提取法以及传统
的温浸提取法提取罗勒全草的有效成分 ,并通过 3
种不同的动物血栓模型观察各提取物对血栓形成的
影响 ,旨在筛选更加合适的提取方法并为进一步确
定其有效组分提供一定依据。
1　材料与仪器
1.1　实验动物　KM小鼠 、清洁级 Wistar大鼠 ,购
自新疆医科大学实验动物中心 ,许可证号:SCXK
(新)2003-0001。
1.2　药物与试剂 　阿司匹林 (Sigma公司进口分
装)、银杏叶片 (深圳海王药业有限公司 , 批号:
Z20027956)、胶原蛋白(Sigma公司进口分装);盐酸
肾上腺素注射液(天津药业集团新郑股份有限公
司 ,批号:071101);FeCl3为国产分析纯 ,配成 70%
水溶液。罗勒药材产地为新疆托克逊县 ,经新疆医
科大学帕丽达 ·阿不力孜教授鉴定为唇形科罗勒属
植物罗勒(OcimumbasilicumL.)的干燥地上部分。
1.3　主要仪器　超声波清洗仪(上海科导超声仪
器有限公司 , SK2200H);冷冻干燥机 (北京博医康
实验仪器有限公司 , FD-1);半导体点式温度计(厦
门中村电子仪器厂 , Model706);全自动酶标仪
(BECKMANCOULTERAD340)。
2　方法
2.1　药材提取
2.1.1　罗勒水提物(温浸法):罗勒地上部分粉碎
后加 10倍量蒸馏水 ,置 60 ℃恒温水浴锅浸泡 3 h
后过滤 ,残渣再加 10倍量蒸馏水 ,共提取 3次 ,合并
滤液 ,减压浓缩至浸膏状置 -70 ℃冷藏 12 h,取出
后放入冷冻干燥机 , 24 h后得罗勒水提物的固体粉
末。
2.1.2　罗勒水提物(超声波提取法):罗勒地上部
分粉碎后用 10倍量蒸馏水(60 ～ 70 ℃)浸泡 1 h,以
频率 25 Hz的超声波处理 30 min后过滤 ,残渣再加
·1922· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 12期 2010年 12月