全 文 ：收稿日期： 2009-09-10； 修回日期： 2010-03-02
基金项目： 浙江省科学技术重点项目（2005C22067）
作者简介： 曾余力， 硕士， 从事植物组织培养研究。 E-mail： zlyl456@163.com。 通信作者： 黄丽春， 教授， 博士，
从事竹类、 林木及其他经济植物生物技术研究。 E-mail： bolch@gate.sinica.edu.tw
浙 江 林 学 院 学 报 2010， 27（4）： 614 - 619
Journal of Zhejiang Forestry College
南方红豆杉离体胚培养诱导不定芽研究
曾余力， 林新春， 桂仁意， 张翠萍， 黄丽春
（浙江农林大学 浙江省现代森林培育重点实验室， 浙江 临安 311300）
摘要： 以南方红豆杉 Taxus chinensis var. mairei 成熟胚为外植体， 筛选出外植体灭菌途径， 研究了基本培养基、 生长调
节剂等因子对其离体胚生长的影响。 结果表明： 最优灭菌处理为 25.0 g·L－1的次氯酸钠（NaClO）溶液真空灭菌 10 min， 其
污染率仅为 6%， 出苗率可达 86%； 木本植物培养剂（WPM）为胚培养的最适基本培养基； 细胞激动素（KT） 0.1 mg·L－1
和玉米素（ZT）1.0 mg·L－1最有效于不定芽的诱导， 不定芽为丛生芽； 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和异戊烯基腺嘌呤（2iP）诱
导不定芽较少； 噻苯隆（TDZ）不能诱导不定芽； 以萌动种胚为外植体对不定芽的诱导优于未萌动种胚。 图 3表 7参 11
关键词： 森林培育学； 南方红豆杉； 胚培养； 植物生长调节剂； 不定芽
中图分类号： S723.1； Q943.1 文献标志码： A 文章编号： 1000-5692（2010）04-0614-06
Regeneration of Taxus chinensis var. mairei from adventitious bud
formation using an in vitro embryo culture
ZENG Yu-li， LIN Xin-chun， GUI Ren-yi， ZHANG Cui-ping， HUANG Li-chun
（The Key Laboratory for Modern Silvicultural Technology of Zhejiang Province， Zhejiang A & F University， Lin’an
311300， Zhejiang， China）
Abstract： The effect of seed sterilization conditions， various basal media， and growth regulators on ex-
plants of mature Taxus chinensis var. mairei embryos were studied. Results showed optimal germination oc-
curred with seeds soaked in a 25.0 g·L-1 sodium hypochlorite solution for 10 min in a vacuum. The contami-
nation rate was reduced to 6% and the germination rate reached 86%. A woody plant medium （WPM） was
selected as the best basal medium with 0.1 mg·L-1 kinetin （KT） and 1.0 mg·L-1 zeatin （ZT）. This medium
effectively induced more clusters of adventitious bud formation； whereas 6-benzylaminopurine （6-BA） and
isopenlenyladenine （2iP） induced fewer adventitious buds while N-phenyl-N′ -1， 2， 3-thidiazol-5-ylurea
（TDZ） produced no adventitious bud differentiation. With WPM， germinated embryos effectively induced
adventitious buds. ［Ch， 3 fig. 7 tab. 11 ref.］
Key words： silviculture； Taxus chinensis var. mairei； embryo culture； plant growth regulators； adventi-
tious buds
南方红豆杉 Taxus chinensis var. mairei 属国家一级濒危保护植物之一， 集材用、 药用、 观赏于一
体， 经济价值极高。 由于红豆杉属 Taxus 植物本身特殊的生物学特性， 种子在天然条件下， 需要两冬
一夏才能萌发并且植株生长缓慢［1］， 常规育种难以保证市场的需要， 故通过离体胚培养技术克服红豆
杉种子难以萌发的缺点， 以期加快植株生长。 近年来， 国内外学者对短叶红豆杉 Taxus brevifolia， 欧
洲红豆杉 Taxus baccata， 杂种红豆杉 Taxus × media var. hicksii， 东北红豆杉 Taxus cuspidata 等进行了
离体胚培养研究 ［2－3］， 从不同角度证实离体胚的萌发、 成苗与培养基、 种子来源、 培养条件等有密切
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关系， 但对南方红豆杉离体胚培养的研究较少， 仅见臧新等 ［4－5］对南方红豆杉离体胚萌发影响因素的
研究。 本研究在前人的研究基础上以南方红豆杉的成熟胚为外植体， 筛选外植体灭菌途径， 基本培养
基、 植物生长调节物质等因子对离体胚生长和分化不定芽的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料购自浙江省嵊州市常青花木场， 于 4 ℃冰箱中冷藏备用。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体灭菌 选取均匀饱满的种子， 剥去外种壳， 流水冲洗 12 h， 置于超净工作台内， 分别置
于 5.0， 10.0， 25.0 g·L－1的次氯酸钠（NaClO）溶液中真空灭菌 5， 10， 15 min， 无菌水分别冲洗 5 遍。
最后在解剖显微镜下切除胚乳挑取种胚， 接入 MS（Murashige and Skoog）培养基中， 1 个种胚·管－1， 各
接种 100管。 接种后先暗培养 2 d， 然后再光培养。
1.2.2 不同基本培养基与植物生长调节物质对离体胚培养的影响 试验一， 挑取种胚分别接种于 MS，
1/2MS， 1/3MS， 1/4MS， WPM（woody plant medium）和 B5（Gamborg）等 6 种基本培养基中， 测试基本培
养基的影响； 试验二， 以 WPM 为基本培养基， 测试不同种类和质量浓度的植物生长调节物质的影
响： 噻苯隆（TDZ）为 0， 0.000 1， 0.001 0， 0.010 0， 0.100 0 mg·L－1， 细胞激动素（KT）， 6-苄氨基腺嘌
呤（6-BA）， 异戊烯基腺嘌呤（2iP）和玉米素（ZT）为 0， 0.030 0， 0.300 0， 1.000 0， 3.000 0， 10.000 0 mg·L－1。
1.2.3 种胚萌动对离体胚培养的影响 根据种胚大小、 颜色分别选取萌动（长度为 0.7 ～ 0.8 cm， 颜色
转微黄色）和未萌动（长度为 0.4 ～ 0.5 cm， 颜色白色）的种胚， 测试不同发育时期对胚培养的影响。 以
WPM 为基本培养基， 附加 0， 0.010 0， 0.100 0， 1.000 0 mg·L－1的 6-BA。 以上试验培养条件： 温度
为（25 ± 2） ℃， 光照度为 2 500 ～ 2 800 lx， 光周期（昼/夜）16/8 h。 对照组（ck）为 WPM基本培养基。
1.2.4 驯化移栽 将带根的试管苗置于驯化室中， 在强光（2 万 lx）下练苗 4 周， 然后取出试管苗， 冲
净根部培养基， 将植株移至泥炭 ∶ 珍珠岩 ∶ 蛭石为 1 ∶ 1 ∶ 1的人工基质中。
1.3 统计分析
以上各试验设计 3个重复， 各试验的结果分析均采用生物统计法将平均值及其标准误差 ［6］和 95%
的可信度进行差异显着性分析［7］。
2 结果与分析
2.1 外植体灭菌
培养 28 d 后调查， 结果见表 1。 最优灭菌处理为 25.0 g·L－1次氯酸钠溶液真空灭菌 10 min， 其污
染率仅 6%， 出苗率达 86%。 试验结果表明， 随次氯酸钠质量浓度升高， 污染率显著降低， 而灭菌时
间加长也能有效降低污染。 由于南方红豆杉胚乳较厚， 高质量浓度次氯酸钠浸泡不会损伤到离体胚的
萌发生长， 各处理的萌发率为 93% ～ 98%。
2.2 不同基本培养基与植物生长调节剂对离体胚培养的影响
2.2.1 不同基本培养基对离体胚培养的影响 将南方红豆杉离体种胚接于不同基本培养基中， 培养 2
个月后， MS 培养基中的胚， 叶色淡绿， 茎较长较粗， 但根较短无侧根， 根长约 2.0 cm。 在不同 MS
质量浓度（1/3MS， 1/2MS， MS）培养基的胚， 随无机盐质量浓度升高， 芽长增长； 在 1/3MS 中根长最
长， 根数最多。 可能是南方红豆杉茎伸长生长需要高质量浓度的无机盐离子， 根生长则以低质量浓度
无机盐离子为宜， 而茎叶和根的平衡生长则需要大量元素的协调配比。 对应 MS 培养基， WPM 培养
基中离体胚茎段细长， 叶色深绿， 并有许多侧根生成， 根系好， 主根长度达 3.8 cm， 平均根数达 4.3
条， 是南方红豆杉胚培养的最佳基本培养基； B5培养基由于茎细弱， 叶色发黄， 不适于南方红豆杉的
胚培养（图 1 ~ 3）。
2.2.2 不同植物生长调节物质对离体胚培养的影响 将离体种胚接种于含有不同质量浓度的 6-BA 的
培养基中， 50 d 调查结果如表 2。 与对照组相比， 6-BA 质量浓度递增时， 离体胚抽出茎叶的长度递
曾余力等： 南方红豆杉离体胚培养诱导不定芽研究 615
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降， 胚根长度变短甚至不萌发， 胚轴上有突起发生。 在 6-BA 0.03 mg·L－1时， 胚轴有突起形成， 少数
有不定芽分化； 质量浓度增加至 0.10 mg·L－1， 不定芽数量增加； 但 6-BA 质量浓度增高到 1.00 mg·L－1
时， 突起变少， 且突起不能分化为不定芽， 并随之褐化。 将离体种胚接种于含有不同质量浓度的 KT
表 1 种子表面灭菌对离体种胚培养的影响
Table 1 Effect of factorial tests among various concentrations of NaClO vs. its durations on germination of excised embryos
编号 次氯酸钠质量浓度/（g·L－1） 灭菌时间/min 萌发率/% 出苗率/% 污染率/%
1 5.0 5 97 a （95.14 ~ 100.00） 53 g （42.76 ~ 63.05） 24 ab （16.02 ~ 33.57）
4 10.0 5 96 a （88.61 ~ 99.16） 57 f （46.71 ~ 66.36） 26 a （17.74 ~ 35.73）
5 10.0 10 97 a （90.46 ~ 99.30） 60 e （49.72 ~ 69.67） 11 d （5.62 ~ 18.83）
6 10.0 15 96 a （89.68 ~ 99.24） 70 d （60.02 ~ 78.76） 18 c （11.03 ~ 26.95）
7 25.0 5 99 a （94.15 ~ 99.97） 77 c （67.51 ~ 84.83） 7 e （2.86 ~ 13.89）
8 25.0 10 98 a （92.52 ~ 99.74） 86 a （77.63 ~ 92.13） 6 e （2.23 ~ 12.60）
9 25.0 15 93 a （82.62 ~ 97.62） 80 b （70.82 ~ 87.33） 6 e （2.23 ~ 12.60）
2 5.0 10 98 a （90.93 ~ 99.68） 47 h （36.94 ~ 57.24） 23 b （15.17 ~ 32.49）
3 5.0 15 94 a （85.49 ~ 97.86） 55 fg （44.73 ~ 64.97） 23 b （15.17 ~ 32.49）
说明： 小写字母标注不同表示差异显著（P＜0.05）。 括号内数值表示 95%的可信度。
图 1 不同基本培养基对芽体
生长的影响
Figure 1 Effects of basal media on shoot growth
of Taxus chinensis var. mairei
图 2 不同基本培养基对根数
的影响
Figure 2 Effects of basal media on root number
of Taxus chinensis var. mairei
图 3 不同基本培养基对根长
生长的影响
Figure 3 Effect of basal media on root growth
of Taxus chinensis var. mairei
表 2 6-BA对种胚培养诱导不定芽分化的影响
Table 2 Effect of 6-BA on induction of adventitious buds by embryo culture
6-BA处理/（mg·L-1） 接种数 不定芽诱导率/% 生长状况
0（ck） 20 0 b （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，叶色深绿，胚根长，多侧根
0.03 20 15 a （3.21 ~ 37.89） 茎叶抽出，叶色深绿，胚根短，不定芽个数 1 ~ 2 个，着生于胚轴
0.10 20 15 a （3.21 ~ 37.89） 茎叶抽出较矮，叶色偏黄，胚根短，不定芽个数 3 ~ 5 个，着生于胚轴
0.30 20 10 a （1.23 ~ 31.70） 无茎叶抽出，无胚根，胚轴有 1 ~ 2 个不定芽，培养基褐化
1.00 20 0 b （0.00 ~ 16.84） 无茎叶抽出，无胚根，胚轴有少量突起，培养基褐化
3.00 20 0 b （0.00 ~ 16.84） 胚肿胀，颜色黄褐
10.00 20 0 b （0.00 ~ 16.84） 褐化愈合组织
说明： 小写字母标注不同表示差异显著（P＜0.05）； 括号内数值表示 95%的可信度。
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不定芽的诱导较 6-BA 强（表 5）， 对南方红豆杉离体胚不定芽的诱导率最高， 质量浓度为 0.30 mg·L－1
时， 诱导率高达 70%， 但仅有 1 ～ 2个单芽·胚－1， 而 KT和 ZT的不定芽多为丛芽。 对茎叶抽出抑制效
果低于 6-BA， 当质量浓度为 3.00 mg·L－1茎叶仍有抽出， 叶色较绿。 添加 TDZ 的试验处理， 都无不定
芽分化。 低质量浓度 TDZ 中试管苗生长与对照组相似， 质量浓度高于 0.100 0 mg·L－1， 胚轴膨胀， 试
管苗有水化现象； 当质量浓度增加到 1.000 0 mg·L－1， 种胚呈黄褐色愈合组织（表 6）。
2.3 种胚萌动对离体胚培养的影响
由表 7 可知， 将萌动的种胚接种到含 0.10 ～ 1.00 mg·L－1 6-BA 的培养基上， 离体胚分化出大量不
茎叶和胚根生长的抑制较明显； 当 KT 质量浓度升高至 0.30 mg·L－1时不定芽的诱导率降低， 而且随
KT 质量浓度的升高， 对胚根发育的抑制越强； 当质量浓度提高至 10.00 mg·L－1 时， 离体胚无生长、
褐化。 试验发现， 接种于含 6-BA 的培养基中的离体胚仅在胚轴上有突起产生， 分化少量不定芽， 而
接种于含 KT 培养基中的离体胚在胚轴、 子叶和生长点均有不定芽的分化。 将离体种胚接种于含不同
浓度 ZT 的培养基中， 50 d 调查结果如表 4。 由表 4 可知， ZT 也能有效诱导不定芽的分化。 当 ZT 的
质量浓度在 0.10 ～ 1.00 mg·L－1时， 胚轴、 生长点和子叶均有不定芽分化， 且多为丛生芽， 当 ZT 质量
浓度为 1.00 mg·L－1时诱导率高达 50%， 与 KT不同的是， ZT 对茎叶抽出抑制不明显， KT 质量浓度为
0.10 mg·L－1时无茎叶抽出， 而 ZT的质量浓度为 1.00 mg·L－1时仍有茎叶抽出， 但节间较短， 并且有轻
微水化现象； 当 ZT 升至 3.00 mg·L－1时， 水化更为明显。 在含不同质量浓度 2ip 的培养基中， 2iP 对
的培养基中， 50 d 调查结果如表 3。 由表 3 可知， 0.10 mg·L－1 KT 的培养基中离体胚无茎叶抽出和胚
根伸长， 但可见丛生不定芽的分化， 诱导率达 30%。 与 6-BA 相比， KT 更优于不定芽的分化， 但对
表 3 KT对种胚培养诱导不定芽分化的影响
Table 3 Effect of KT on induction of adventitious buds by embryo culture
KT 处理/（mg·L－1） 接种数 不定芽诱导率% 生长状况
0（ck） 20 0 c （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，叶色深绿，胚根长，且有较多侧根
0.03 20 0 c （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，胚根较长
0.10 20 30 a （11.89 ~ 54.28） 无茎叶抽出，胚根短，子叶处有丛生不定芽
0.30 20 10 b （1.23 ~ 31.70） 无茎叶抽出，无胚根，子叶处有丛生不定芽，胚轴肿胀突起
1.00 20 5 bc （0.13 ~ 24.87） 无茎叶抽出，无胚根，子叶处有丛生不定芽，胚轴肿胀
3.00 20 0 c （0.00 ~ 16.84） 无茎叶抽出，无胚根，胚轴开裂，培养基轻微褐化
10.00 20 0 c （0.00 ~ 16.84） 胚无生长，颜色褐色
说明： 小写字母标注不同表示差异显著（P＜0.05）。 括号内数值表示 95%的可信度。
ZT 处理/（mg·L－1） 接种数 不定芽诱导率/% 生长状况
0（ck） 20 0 d （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，叶色深绿，胚根长，且有较多侧根
0.03 20 0 d （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，节间短，胚根短，胚轴褐色
0.10 20 10 c （1.23 ~ 31.70） 茎叶抽出，胚根短，胚轴有 2 ~ 3 个不定芽
0.30 20 20 b （5.73 ~ 43.66） 茎叶抽出，胚根短，子叶、胚轴有丛生不定芽
1.00 20 50 a （27.20 ~ 72.80） 茎叶抽出，无胚根，子叶、胚轴有丛生不定芽
3.00 20 0 d （0.00 ~ 16.84） 胚肿胀，有水化现象
10.00 20 0 d （0.00 ~ 16.84） 黄色愈合组织
说明： 小写字母标注不同表示差异显著（P＜0.05）。 括号内数值表示 95%的可信度。
表 4 ZT对种胚培养诱导不定芽分化的影响
Table 4 Effect of ZT on induction of adventitious buds by embryo culture
曾余力等： 南方红豆杉离体胚培养诱导不定芽研究 617
浙 江 林 学 院 学 报 2010 年 8 月
说明： 小写字母标注不同表示差异显著（P＜0.05）。 括号内数值表示 95%的可信度。
表 5 2iP对种胚培养诱导不定芽分化的影响
Table 5 Effect of 2iP on induction of adventitious buds by embryo culture
2iP 处理/（mg·L－1） 接种数 不定芽诱导率/% 生长状况
0（ck） 20 0 c （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，叶色深绿，胚根长，且有较多侧根
0.03 20 0 c （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，叶色绿，胚根长
0.10 20 30 b （11.89 ~ 54.28） 茎叶抽出，叶色绿，胚根短，胚轴有 1 ~ 2 个不定芽
0.30 20 70 a （45.72 ~ 88.1） 茎叶抽出，叶色绿，胚根短，胚轴有 1 ~ 2 个不定芽
1.00 20 25 b （8.66 ~ 49.10） 茎叶抽出，胚根无，胚轴有 1 ~ 2 个不定芽
3.00 20 0 c （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，胚根无，胚轴绿色膨胀
10.00 20 0 c （0.00 ~ 16.84） 黄褐色愈合组织
TDZ 处理/（mg·L－1） 接种数 不定芽诱导率/% 生长状况
0（ck） 20 0 （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，叶色深绿，胚根长，且有较多侧根
0.000 1 20 0 （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，叶片舒展，胚根长淡黄色，有侧根
0.001 0 20 0 （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出较高，胚根长，无侧根
0.010 0 20 0 （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，节间较短，胚根短
0.100 0 20 0 （0.00 ~ 16.84） 茎叶抽出，胚根短，胚轴膨胀水化
1.000 0 20 0 （0.00 ~ 16.84） 黄褐色愈合组织
表 6 TDZ对种胚培养诱导不定芽分化的影响
Table 6 Effect of TDZ on induction of adventitious buds by embryo culture
说明： 括号内数值表示 95%的可信度。
表 7 种胚萌动前后对胚培养的影响
Table 7 Effect of with or without breaking seed dormancy on germination of excised embryos
6-BA 处理/（mg·L－1） 接种数 未萌动 萌动
0（ck） 30 茎叶抽出，叶色淡绿，胚根长，多侧根，胚轴细 茎叶抽出，茎叶黄，胚根长，多侧根，胚轴粗
0.01 30 茎叶抽出，胚根短，胚轴有突起形成 茎叶抽出，叶片细，胚根短，胚轴表面褶皱
0.10 30 茎叶抽出，叶少，胚根短，有突起形成 子叶处抽出叶片，无胚根，胚轴膨大较松软不定芽多
1.00 30 无茎叶抽出，有少量突起，培养基褐化 无茎叶抽出，无胚根，胚轴褶皱不定芽较少
3.00 30 胚肿胀，颜色黄褐 胚轴变粗，胚轴褶皱，局部灰褐
定芽； 而且随 6-BA 质量浓度增高， 胚轴分化不定芽的数量呈现先升高后下降的趋势； 但是将未萌动
的种胚接种到相同的培养基中， 仅在胚轴处产生突起， 没有不定芽的分化。
2.4 驯化移栽
将试管苗置于模拟自然环境中， 经 1个月练苗驯化后， 移至混合人工基质中， 成活率达到 90%。
3 结论与讨论
木本植物组织培养的困难之一是建立无菌材料。 在建立无菌材料时， 外植体表面灭菌将影响试验
成败。 本研究采用 25.0 g·L－1次氯酸钠溶液真空灭菌 10 min， 污染率仅为 6%， 出苗率达 86%。 而且
由于南方红豆杉胚乳较厚， 高质量浓度的次氯酸钠溶液不会伤害到内部的胚， 对其萌发无影响。 试验
还发现南方红豆杉种胚在 MS 培养基上能够较好的萌发生长， 萌发率在 95%左右， 而陈永勤等 ［8］曾报
道红豆杉在 MS培养基上的萌发较差， 这与本研究结果不一致。
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第 27 卷第 4 期
臧新等［5］对 MS和 B5等培养基进行研究， 认为这几种培养基对南方红豆杉的离体胚培养影响差别
不大， 而我们在研究中发现不同基本培养基对离体胚培养影响较大。 WPM 培养基能促进根系产生和
茎叶生长， 是南方红豆杉离体种胚培养最适宜的基本培养基。 MS 培养基对南方红豆杉茎段生长亦较
佳， 但不利其根系的生长。 B5培养基也不适于南方红豆杉的胚培养。
在不同细胞分裂素对离体种胚培养的影响试验中发现， 不加细胞分裂素时试管苗生长最好， 添加
细胞分裂素不利于种胚的伸长生长， 但可诱导不定芽的产生且不需经过愈合组织而直接分化产生不定
芽， 其中 KT 和 ZT 最适于南方红豆杉的不定芽诱导。 对于大多数树种， 诱导不定芽时， 外植体需接
种在细胞分裂素与生长素配比的培养基中， 但在许多针叶树培养中， 单独使用细胞分裂素， 足以诱导
不定芽发生［9－10］， 这与本试验研究结果相一致。
萌动后的南方红豆杉种子具有较强的生长势和生理活性， 而且此时内源激素含量高于其他时期，
而未萌动的种子中发芽抑制物的含量较高［11］， 抑制种子的萌发生长。 南方红豆杉种胚萌动对胚培养的
影响， 试验得知以萌动后的种胚为外植体更容易诱导出不定芽， 这可能与南方红豆杉种胚内源激素随
种胚成熟度而发生变化有关。
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