全 文 ：兰州 大学学报 ( 自然科学版 )
3 2 ( 2 )
:
3 10一 13 2 , 19 87 研 究 简 报
邻苯二甲醛比色测定山黛豆毒素O D A P
李志孝 蔡文涛 辛许主国 陈耀祖
山然豆是一种抗寒 、 耐旱 , 抗贫痔的豆科作物 . 宜于在我国西北黄土高原种植 , 因
富含蛋 白质 , 可作为食品及饲料资源 ,但其中含毒素 , 多食后导致下肢瘫痪 . 我们已报导
分离鉴定该毒素为卜草酞氨基丙氨酸 (日一 N 一 o x a ly l一 a m s n 。 一 a l a n i n e ) (简称 B o A A ) 川
也称为卜草酚二氨基丙酸邝 一 N 一 o x a ly l 一 L 一 a ,日一 d i a m i n o p r o p i o n i e a e i d ) (简称 O D A
P )
. 为了配合遗传育种 , 寻找低毒品种 , 急需建立一种准确测定毒素的新 方 法 . 我们
曾报导用纸层析一分光光度法 ( ` ’ 或薄层扫描光度法 I“ ] 分析该毒素 . 也有人用酶解法 (“ ’
或与钻盐形成有色钻络合物的方法 [` ] 进行测定 . 前两个方法的缺点是选择性较 差 , 因
此在测定前必须经色谱层析将其它氨基酸分离 , 手续繁杂 , 重现性较差 . 后 来 R a 。 〔 6 ’
及 B ir g gs l “ ] 等报导 , 采用邻苯二甲醛比色测定 O D A P , 该法有较高的选 择 性和 灵 敏
度 , 但发现在操作中存在一些问题 , 为此我们在其工作基础上对某些操作进行了改进并
系统研究了实验中各因素的影响 , 找出了最佳测定条件 , 从而进一步提高了该法的重视
性和准确度 .
实 验 部 分
一 、 试剂配制
1
.
O D A P标准溶液 ( Z m g / m l) . 在 4 ’ C存放备用 : O D A P由山薰豆 中提取 【” .
2
.
3 0 %乙醇 ;
3
.
3
.
5 N氢氧化钾溶液 ;
4
.
O
.
S M 硼酸钾缓冲溶液 ( P H 二 9 . 9 ) ;
5
. 邻苯二甲醛 ( O P T ) 显色剂 : 称取 25 o m g O P T及 0 . s m l琉基 乙醇于 2 . 5m 195 %
乙醇中溶解 , 然后用 0 。 S M 硼酸钾缓冲溶液稀释至 2 50 m l , 于 4 O C保存备用 .
二 、 仪器 7 51 紫外可见分光光度计 .
三 、 实验方法
1
. 制作标准曲线 : 取 9。川O D A P标准液 ( 2 m g / m l) 于一支 10 m l刻度试 管 中 ,
加 2 m 13 . S N K O H溶液于沸水浴中加热水解 60 分钟 , 冷至室温后 , 用蒸馏水定容至 3 m ].
分别取上述水解浓。 , 0 . 1 , 0 . 2 , 0 . 3 , 0 . 4 , 0 . 5及 o . 6m l于七支试管中 , 再依次加蒸馏水 使
每支试管定容至 1 毫升 . 然后加O P T显色剂各 2 m l , 在 40 O C恒温60 分钟 , 冷却后在 7 51
分光光度计 , 波长入 m a x = 4 29 n m处进行比色测定 . 以每管中O D A P 的微克 数 为 横坐
标 , 以消光值为纵坐标绘制标准曲线 . 见图 1 .
本文 19 86年 10月 17 日收到 .
. 有机化学命业 8 1级学生 。
DOI : 10. 13885 /j . i ssn. 0455 -2059. 1987. 02. 024
第二期 邻笨二甲醛比色测定山然豆毒素。力A F 1 3 1
图 1 O D A P 标准曲线
2
. 样品测定 : 称取 20 m g山 黛 豆 粉
(三份 ) 于三支 10 m l具塞试管中 ,各 加 2
m 13 0% 乙醇振荡混 匀 后 浸泡过夜 , 过滤
后收集部分滤液备用 .
取 A 。 , A , , A Z , A 3 四支刻 度 试管
分别加上述三份提取液各 l m l于 A ; , A Z ,
A 3管中 , 在 A 。管中也加其 中任一提取液
1 m l
, 然后在 A 。管 中加水 2 m l , 而在其
余三支试管中加 3 . 5N K O H各 2 m l于 沸
水浴中加热 60 分钟 , 冷至室温后 , 用 蒸馏
水定容至 3 m l , 离心 , 分别取上述上层清
液各 l m l于 B 。 , B , , B Z , B 3四 支 试 管
中 , 各 加 Z m 1O P T 显色剂 , 在4 0 O C恒
温 60 分钟 , 冷却后用 7 51 分光先度计 以 B 。为空 白 , 在4 2 9 n m处测得消光值 E , , E Z , E 3 ,
取平均值 , 即为消光值 E .
根据样品消光值 E , 在标 准曲线上查得相应的 O D A P微克数 , 可计算样品中O D A P
的百分含量 .
讨 论
1
. 回收率 的测定 : 称取黄豆粉 (不含O D A P ) 0 . 2 0 克于一支 50 m l具塞试管中 ,
分别加入 2 0 0林l及 5 0 0卜10 D A P标准溶液 ( 2 m g /m l ) , 再分别 加 1 9 . 8 m l 及 1 9 . 5 m 13 0%
乙醇 ( 以下操作 同样品测定 ) , 结果见下表 .
表 回 收 ` 率 测 定 结 果
O D A P标准溶液
加入量 (微升 )
溶液中 O D A P
含量 ( % )
2 0 0 5 0 0
测定值 (% )
回收率 (% )
回收率平均值 ( % )
总平均值 ( % )
口军江一-…一草擎一…吧…哩…哩1哩I哩 }哩1暨 }哩1哩 }竖圳哩
}卫竺竺且竺竺竺业竺望竺}竺三土旦l 魁竺兰」~垫且竺二…一一一一竺兰二一一一卫一一望竺二— -1 ” 7 · ”山表中结果看 出回收率在 97 % 以上 .
2
. 提取 O D A P 的乙醇浓度 : 通用 同不同浓度的乙醇对比实验 . 发现 使 用 30 % 乙
醇提取效果最佳 . 乙醇浓度低于 30 %时 , 溶液 中含有较多淀粉 、 蛋 白质等 . 滤液混浊 、
容易起泡 , 不利操作 ; 乙醇浓度高于 30 %时 , O D A P萃取不完全 . 见图 2 .
132 兰 州 大 学 学 报 10 87年 6月
曝
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图 2 乙醉浓度的选择 图 3 水解 O D A P的 K O H 浓度
及水解时间的选择
3
. 关于提取方法 : 与 R a 。 「6’ 及 B r i g gs l“ ]的方法不同. 我们采用上述浸泡过夜的
办法 , 表面上看 , 浸泡时间较 一长 , 但实际上因过夜使操简便易行 , 经测定该法的萃取率
在 9 9 % 以上 .
4
. 水解 O D A P的 K O H 浓度及时间的选择 : R a o 、 B r i g g s均采 用 3 N K O H水解 3 0
分钟 , 我们通过用 2 . o N , 3 . o N , 3 . 5 N . 4 . 0 N K O H溶液分别实验 , 发现用 3 . SN K O H
水解 1 小时的效果最好 . 见图 3 .
参 考 资 料
【1 〕
〔 2 〕
〔 3 〕
〔 4 〕
[ 5 〕
〔 6 〕
〔 7 〕
兰州大学学报 (自然科学版 ) 4 , 1 一 2 0 , ( 1 9 7 5 ) .
李志孝等 , 兰州大学学报 ( 自然科学版 ) , 2 , 7 6一 5 0 , ( 1 0 5 6 ) .
D
.
R a j i
a g o p a l R a o
, e t a l
,
J
.
A g r
.
F o o d C h
e n , 2 2
,
6
,
( 1 9 74 )
.
K r ; s h n a B a h a d u r a n d S u r a j P r a k a s h B i l l a
,
I n d i a n J
.
A p p l
.
C h
e m
5 3
, 3 , ( 1 0 7 0 )
.
5
.
L
.
N
.
R a o
.
A n a l
.
B i o e h e m
,
5 6
,
3 5 6一 3 9 5 , ( x 9 7 s ) .
C
.
J
.
B r i g g s
, e t a l
.
P l a n t a M e d
,
4 7 ( 3 )
,
2 5 5一 1 9 0 , ( 1 9 5 3 ) .
蔡文涛等 , 兰州大学学报 (自然科学版 ) , 2 0( 化学辑刊 ) , 79 一 85 , ( 19 8 4 ) .