全 文 ：兰 州 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) , 1。。 2 , 2 8 ( 8 ) : 仑9“ 9 2
J O U R N A L O F L A N ZH O U U N IV E R S IT Y ( N
a t u r a l S c i e o c e s )
山薰豆研究 (第九报 )
山黛豆中咚一及 p 砂一草酸二氛基丙酸
相时含量的电泳测定及分离*
李志孝 孟延发 。 。 张 立 陈耀祖
(兰州大学化学系 , 兰州 7 3 0 0 0 0 )
摘 要 本丈 用电泳扫描法片国内一些 山烹豆 样品中。一及 p一草跳二 或基丙 胶的相叶含圣进行
了测定并改进 了二 者的分 离方法 。
关挂词 电泳 , 浏 定 . 分离 . 山 熏豆毒素 , 。一及日一草阮二 氛基丙 酸
中圈法分类号 Q g 4 6 . 8
人们长期食用山黛豆 ( L at 五y rn : S a t iv us )会 引起 下 肢 麻 痹 , 称 为 山 熏 豆 中毒
( L a th y
r i s m )
, 许多报导 ” ” ’ 已从山黛豆中分离出日一草酞 a , 日一二氨 基丙酸 (日一 N
一 o X a l y l一 a , 日一d i a m i n o p r o p i o n i e a e id ) (日一 O D A p )也叫日一草酞氨基丙氨酸 (日一
N一 O xa ly la m 坛 oa l a成 ne ) (B O A A )的有毒成份 . 其水溶液对 3 日龄小鸡腹腔注射可复
制出神经性中毒症状 . 也有报导从山黛豆中分离出其它有毒成分 , 但实验证明日一 O D A P
是最主要的毒素 。
B e l 〔 3 〕指出山薰豆 中同时存 在日一 O D A P 的 异 构 体一 a一草 酸 a , 日一二氨基丙酸
( a一 O x a l了l一 a , 日一 d i a m i n o p r o p i o n i e a e id ) ( a一O D A p ) . 这两个异构体可相互转
化 , 达到平衡 . 二者用通常的纸层析 I “ ’ 及邻苯二甲醛比色 ` 们 是无法鉴定的 , 但可用 电
泳法分离鉴定 .
H a r ir s o n 「“ ’ 等人采用合成及 提 取 法 得 到 a一及日一 O D A P . 毒性试验表 明 与日一
O D A P相反 , a一 O D A P是无毒的 。
为了探讨 山薰豆中天然 的 a 一及日一 O D A P的相对 含量 , 研究二者之 间的相互转换 的
条件 , 本文用电泳扫描法对国内 5 种毒素含量不 同 的 山黛豆样品中 a一及日一 O D A P的
相对含量做了测定并简化了从山黛豆中分离二者 的方法 .
1 实验部分
1
.
1 山 , 豆 中 a一及日一 O O A P相对含 t 的浦定
1
.
1
。
1 样品液的制取
分别取山黛豆 3份 , 每份 约 1 9 . 其中 1份萌发 4 d后捣粹 , 另 2 份研成粉状后 分 别
移入 3 支 50 m L具塞试管中 , 各加入 30 m L 30 呱乙醇液将萌发样液及其中 1 份未萌发粉 样
一 本丈 x。它。牟 9 6 日月收到 。
本课趁系甘索省青丰科学奏全资助 项 目… 生物系 .夺项月研称苹,\ 报乓镇物学通报 , ` 9 9 0 , 7 ( 8 ) , 3 7” 庵冬
DOI : 10. 13885 /j . i ssn. 0455 -2059. 1992. 03. 016
兰州大学学报 (自然科学版 ) 2 8卷
液放入冰箱 (约 4 ℃ )浸泡过夜 , 另一份在室温浸泡 , 次 日把在冰箱的滤液立 即 冷 冻 千
燥 , 而在室温提取的滤液在水浴蒸干 . 3 份样均加入 2 m L 10 肠异丙醉 溶解 、 过 滤 . 滤
液于 4 ℃存放并及时进行电泳测定 .
1
.
1
.
2 电泳扫描 ,
取 10 ~ 2卯 l上述提取液点于新华层析滤纸条 ( 2 8 X 3 c m )上 . 在 D Y一 3 A 型 稳 压 稳
流 电泳仪及水平式电泳槽上进行电泳 . 缓冲液为甲酸 , 毗咙 , 水 = 4 . 0 , 0 . 3 , 95 . 7 v( /
v)
, p H 二 2
.
2 , 30 v0
,
4 h
. 滤纸条风干后喷洒二氯化锡一茹三 酮 溶 液 , 于 10 0℃显色
1 5m in 可出现 2 个完全分开 的紫色斑点 , 与标样对照 , 前一点为日一O D A P , 后一点为 a
一 O D A P 。 然后在岛津 9 10 型双波长扫描仪上进行线性扫 描 (久s = 5 9 0n m , 肠 二 7 2 0n m )
并由仪器直接 给出二者 的相对 (百分 )含量 .
1
.
2 从山 , 豆中分离 a一及日一 OO A P
1 k g山薰豆粉用 3 L 30 肠乙醇液浸泡 4次 (每次 2 4 h) 不时振荡 , 过滤 , 合并滤液 , 料
去乙醇水浴浓缩至 Z L . 分别用氯仿及 乙醚萃取 , 除去脂溶性杂质 , 过阳离子交换树 脂
(南开强酸 1 号 )柱 ( H 十型 ) . 2 次水洗脱 , 收集并冻干含 O D A P 的洗脱浪 , 得 a一及日一
O D A P混合物 3 . 59 . 电泳检查显出 2 个清晰 的斑点 , 无 其它与荀三酮显色的物质 .
a一及日一 O D A P异构体混合物进一步在阳离子交换树脂 (毗吮型 )柱上分离 . 纯化后
的阳离子树脂 (南开强酸 1 号 )( H 十型 ) 柱先用 Z L缓冲液 〔1 5 1 . 3 m L咄吮加 1 0 m L甲酸 , 用
水稀释至 Z L (P H 二 4 )〕淋洗 , 使之转换为咄吮型 , 再用 S L洗脱 液 ( 1 4 . l m L毗吮加 12 5
m L甲酸 , 用水稀释至 S L )平衡交换柱 . 取上述 a一及日一 O D A F混合物悬浮于 3 o m L水
中滴加毗咬使之溶解 , 再加水至 s o m L , 用 10 M H C I调 p H “ 1 . 3后上柱 , 用洗脱液淋洗 ,
流速约 1 0m L / m in ,每 60 m L 收集一瓶并立即放入冰箱 . 用电泳法检查后分别冻千含 a一
及日一 O D A P的洗脱液 .
冻干产物分别加适量水并滴加毗吮使之溶解 , 活性炭脱色 , 再 用 10 M H C I调 p H =
2
, 加丙酮使之沉淀 , 过滤 . 用 P 。 O 。真空干燥 , 得 a一 O D A P o . g6 , 日一 O D A P 2 . 2 .g
电泳检查在相应位置基本上为单一斑点 。
表 1 5 种不 同产地 的山黛豆在葫发前后及不 同提取
温度时 a 一及压 O D A P的相甘含量一一 . . . 一 .一 . .一- ~ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 曰 . . . . . . . . . . . .未 葫 发 葫 发 4 d 后样品 号 O D A P肠 萌 萌室温提取a -1 0 。 8 5 1 9 。 52 0 。 8 4 18 。 93 0 。 4 7 2 4 。 64 0 。 2 5 2 3 。 46 0 。 e s 2 4 。 0
平 ,勺 2 2 . 2
水浴蒸+ 4 ℃提取 冻干 室温提取 水浴落干 4 ℃捉取 冻干
日一 a一 卜 卜 卜 a一 卜
8 0
。
5 4
。
8 9 5
。
2 2 4 。 6 7 5 。 4 6
。
9 9 3 . 1
8 1 。 1 3
。
5 9 6
。
5 2 5
。
0 7 5 . 0 9 。 1 9 0 。 9
75 。 4 8
。
3 9 1
。
7 1 9
。
9 8 1
。
1 7 。 2 9 2 。 8
7 6
。
6 6
.
e 9 3
。
2 2 0 。 5 7 9
。
5 4
.
2 9 5
。
s
7 6
.
0 4
。
6 9 5
.
4 2 6 。 8 74
。
2 3
。
7 0 6 . 3
7 7 . 9 5
。
6 9 4 。 4 2 3
.
4 7 6
.
6 6 。 3 9 3
.
7
赞
oD A P含章按 丈肤〔 4 〕浏宾
3期 李志孝等 :山薰豆中 a一及日一 O D AP相对含量的测定及分离 91
3 结果与讨论
3
.
1山 , 宜中 a一及日一 O O AP的相对含 t 的洲定
从表 1数据可 以看出 , 5 种不同来源的山黛豆样品中含有不同含量的O D A P . 在萌
发前后不同温度时的提取液中 a一及日一异构体的含量也不同 . 在 4 ℃提取 , 冷冻干燥后
二者 的相对含量为 6 : 94 = 1 : 15 . 7 , 而在室温提取水浴 蒸 千 的 条 件 下 a一体升高到
2 2
.
7帕 .山瀚豆 的萌发过程可使 O D A P的含量升高 (见表 2 )这与 M a l at hi ` 。 ’ 的观察结果
表 2 3 奋山熏豆样品 在
萌发时O D A P含
量 变化
萌发天教 O D人P /呱
0
。
4 6 9
0
。
50 7
O
。
6 5 5
0 。 6 74
0
。
6 6 2
0 。 6 14
一致 , 说明山瀚豆 中确实存在 O D A P合成酶 .但并未改
变 a一及日一 O D A P的比例 ,说明在山熏豆中 a一及 p一
异构体随温度处在不同的平衡状态 。 在低温条件下 ,
消除了草酞基由日一氨基向 a一氨基的转移 , 可 以认
为 1 : 1 5 。 7为 a一及日一异构体在山熏豆 中 的天然比
例 . 而 2 2 . 7 : 7 7 . 3 = 1 : 3 . 4是在室温提取 , 水浴蒸
干的条件下建立的平衡状态 , 为 此 , 可 以设想 , 这一
平衡状态如下式所示 :
实验证明分离得到的 a一及日一 O D A P 的 水 溶液
324
1匕6
C O O 卜l
I
H
,
C一 C H
/ 、
H
Z
N
H O 一
N H 不= 已
C O O 卜1
矛
11
:
C 一 C 11
/ 、
二二二已 H N N H ,
C 一 C 一 O H
!1 目
( ) ( )
a 一O D A P 中间体 日一O D A P
分别于封管中8 5 ℃加热 1 5 h后发现每一管中均产生相对应 的另一异构体达 40 肠左右 。 说
明存在上述的平衡过程 . 因此 , 早在本世纪初发现山黛豆有毒时 H ol m “ s曾指出山薰豆在
经过蒸煮之后似乎可以破坏该毒素的说法及后来 R o y发现在 150 ℃加热 Z o m in 有 可 能使
毒素含量达到限定 的安全水平的说法是有一定道 理的。
3
.
2 山 , 夏中。一及日一 O O A P的分离提取
用阳离子交换树脂从山黛豆提取液中分离出 Q一及日一 O D A P需进行两次离子交换 , 先
将提取液通过阳离子树脂 (H +型 ) , 用 2 次水洗脱使 a一及日一O D A P与其它氨基酸分开 ,
这一步的关键在于提取液中的脂溶性物质需用氯仿及 乙醚反复抽提干净 。 为了 提 高 a一
O D A P的收率 , 提取液的浓缩操作可在 沸水浴上进行 , 使日一 O D A P向 a 一O D A P转化 .
所得的。一及日一 O D A P混合物进一步在阳离子交换树脂 (咄吮型 )柱上进行 , 关键在于洗
脱液的PH值应严格控制在 2 , 30 .
9 2 兰州大学学报 (自然科学版 ) 2 8卷
表 3 从山烹豆 中分离出的 a一及日一O D A P的鉴定
. . . . 口. . . . . . . 曰. . .
~ ` 一 . 熔 点 比旋光 ( SM H C I)
孟ōda一 O D人 P
日一 O DA P
3 0
。
6 8
3 1。 14
::;
14
。
4 3
14。 1 9
16 0
.
5、 1 62℃
2 0 3、 20 6 (分解 ) 二髻
. C sH sN : 0 ,
·
H ZO 计算值 C 3 0 . 0 3 H 5 . 2 9 N 4 . ` 3
表 2 数据说明 : 分离得到的 a一及日一O D A P为一水合物 , 元素分析及熔点 、旋光值均
与文献一致 . 电泳分析证 明与 a一及日一O D A P混合物相同迁移度处分别显出单一斑点 .
参 考 文 献
R a o 5 L N
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: o l a t i o双 a 几d C h a r ac t e r l z a t i o 皿 o f 日一N 一 O x a ly l一 L 一 a , 日一d i a m l 皿 o p r o p l o n l e
A e l d
.
A N e u r o t o x i几 f r o m t五e S e e d o f L a t五y r u s S a t l v o s . B i o e h e 也 i s t r了 . 20 64 , 3 : ` 32
兰州 大学化学系等 . 山熏豆中毒紊分析与去毒方法的研 究 . 兰州大学学报 ( 自然 科 学版 ) , 19 7 5 , 1 ( 2 )
: 1勺 2 1
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s o l a t i o 皿 o f a 一 a 皿d 丫一 o x a l y l D e r i v a t i v e s o f a , 丫一 D i a口 i双 o b u t y r i e A e i d
f r o m S e e d s o f L a t h y r u s S a t i v u s
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d t五e D e t ec t i o 几 o f t h e a 一 O x a ly l I s o m e r o f t五e N e u r o t o x i 众
a 一A nz i 红。一日一 o x a l y l a m 五n 。 p r o p l o 二 l e A e i d W五I e五 O e e u r s t o g e t五e r , i t五 t h e N e u r o t o x i n I n T h i s a双 d
O t h e r S P ce i o s
。
P五y t o e h e . l s t r y . 1 , 6 . , ( 6 ) : 1 2 1 1~ 22 2。
李志孝子 . 部笨二甲醛比色浏 定山 傲 豆 毒素 OD A P 。 兰州 大学学报 ( 自然科学版 ) . 1 9 8 7 , 23 ( 2 ) : 1 30
勺 1 3 2
H a r r i s o o F r a n e e s L y 二二 e , e t a l
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S v 红 t五e s i s o f a 一 a n d 日一 N 一 O x a l y l一 L一 “ , 日· D i a m i n o p r o p i o 双 l e
A e i d a几d T五e i r I s o l a t i o n f r o m S e e d s o f L a t五y r u s S a * i v u s . P五y t o e五e m i s t r了 , 2 9 7 7 , z e : 1 2 1 1、 22 15
M a l a t h i K
, e t a l
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S t
u d i e , 。双 t五e B i o s y 几 t il e s i s o f p一N 一 O x a ly l一 L 一 a . 日一D i a m i n o p r 。 p l 。 n i e A e l d .
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e L a t五y r u s S a t i , u s N e u r o t o x i红 . B i o e五i m B i o p五了5 A e t a , 29 右7 , 1 4 1 : 7 1、 75 .
D e t e r m i n a t i o n o f a
一 a n d 日一 O x a l y l d i a m i n o P r o P i o n i c A 。 id
L a t h y r u s S a t i v u s b y E l e e t r o P h o r e s i s
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A n e z e e t r o p h
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o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f r e l a t i v e e o n t e n t
o f a一 a n d 日一 o x a l y ld i a m sn o p r o p i o n i e a e id i n s o m e s a m P l e s o f L a t h y r u s
S a t i v u s h a s b
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e v e z o p e d
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T h e e o n d i t i o n o f s e p a r a t i o n o f a一 a n d 日一
o 二 a l y zd i a m i n o p r o p i o n i e a e i d b了 i o n e x e h a n g e e h r o m a t o g r a p h y h a s a l s o
b e e n d i
s e u s s e d a n d i m P r o v e d
。
Ke y w o r d s
’
e l e e t r o p h
o r e s i s
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d e t e r m i n a t i o n
,
i s o l a t i o n , L
a t h笋r u s n e ; r o t o x i n ,
“一 a n d p一 O x a l了Id i a舆 i n o p r O P I O n i o a 。王4