全 文 ：环球中医药 2011年 3月第 4卷第 2期　GlobalTraditionalChineseMedicine, March2011, Vol.4, No.2 103　
·中药材研究·
基金课题:教育部新教师基金项目(20091106120011)
作者单位:100193北京 ,中国医学科学院北京协和医学院药用植
物研究所 [石林春(博士研究生)、宋经元 、姚辉 、陈士林 ] ;中国药科
大学(李莉)
作者简介:石林春(1983-), 2008级在读博士研究生。研究方向:
中药资源可持续利用。 E-mail:lcshi@implad.ac.cn
通讯作者:姚辉(1976-), 博士 ,副研究员。 研究方向:中药资源
可持续利用。 E-mail:scauyaoh@sina.com
基于 ITS2条形码序列的京大戟及其易混
品的 DNA分子鉴定
石林春　宋经元　李莉　姚辉　陈士林
【摘要】　目的　对京大戟及其易混品进行 DNA分子鉴定 , 以保证京大戟的用药安全。方法　
对京大戟及其 18种易混品共 29份样品的内转录第二间隔区(ITS2)条形码序列进行分析。对京大
戟 ITS2序列种内序列变异 , 京大戟与其易混品间的种间序列差异进行分析比较 , 并构建京大戟及其
易混品的 NJ树。结果　京大戟 ITS2序列种内变异较小 , 平均 K-2P距离为 0.0092, 最大 K-2P距离
为 0.0138。京大戟与其易混品间的种间序列差异较大 , 种间 K-2P距离的平均值为 0.3395, 最小种
间 K-2P距离为 0.0427。京大戟在 NJ树上聚为独立一支 ,表现出单系性。结论　ITS2条形码可以
对京大戟及其易混品进行 DNA分子鉴定 , 在中药材鉴定中具有重要的应用价值。
【关键词】　京大戟;　易混品;　内转录第二间隔区基因序列;　鉴定
【中图分类号】　R282.5　【文献标识码】　A　doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2011.02.005
MolecularidentificationofEuphorbiapekinensisanditsadulterantsusingITS2 barcodesequence　
SHILin-chun, SONGJing-yuan, LILi, etal.InstituteofMedicinalPlantDevelopment, ChineseAcademyof
MedicalSciences, PekingUnionMedicalCollege, Beijing100193 , China
Correspondingauthor:YAOHui, E-mail:scauyaoh@sina.com
【Abstract】　Objective　ToidentifyEuphorbiapekinensisanditsadulterants, andassurethesafety
ofthismedicinalmaterial.Methods　Inthisstudy, theITS2 barcodesequencesof29 samplesof19spe-
ciesofEuphorbiapekinensisanditsadulterantshavebeenanalyzed.Theintra-specificvariationofEuphor-
biapekinensis, aswelastheinter-specificdivergencebetweenEuphorbiapekinensisanditsadulterantshad
beencalculated.NJtreeofEuphorbiapekinensisanditsadulterantshadbeenconstructedusingMEGA5
software.Results　Euphorbiapekinensispossessedlowintra-specificsequencevariation.Theaverageintra-
specificK-2PdistanceofEuphorbiapekinensiswas0.0092, andthemaximumwas0.0168.Theinter-spe-
cificsequencedivergencebetweenEuphorbiapekinensisanditsadulterantsisrelativelyhigh.Theaverage
inter-specificK-2Pdistancebetween“Euphorbiapekinensisanditsadulterantswas0.3395, andthemini-
mumwas0.0427.Intheclusterdendrogram, Euphorbiapekinensisshowedmonophyletic.Conclusion　
EuphorbiapekinensisanditsadulterantscanbecorrectlyidentifiedusingITS2 barcodesequence, andthe
ITS2regionshowedpotentialusetoidentifytraditionalChinesemedicine.
【Keywords】　Euphorbiapekinensis;　Adulterant;　ITS2;　Identification
　　京大戟为大戟科植物大戟(Euphorbiapekinensis Rupr.)的干燥根 ,主产于江苏 、四川 、江西 、广西等
地 ,具有泄水逐饮 ,消肿散结的功效 ,用于水肿胀
满 ,胸腹积水 ,痰饮积聚 ,气逆咳喘 ,二便不利 ,痈肿
疮毒 ,瘰疬痰核等症[ 1] 。京大戟最早作为 “下品 ”收
载于 《神农本草经 》, 此后 《本草经集 》、 《新修本
草》、《图经本草》、《证类本草》、《本草纲目 》等均有
记载 ,是常用中药材 [ 2] 。京大戟的易混品主要有:
同属植物乳浆大戟 (E.Esula)、钩腺大戟 (E.
Sieboldiana)、地锦(E.Humifusa)等 ,瑞香科植物瑞
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香狼毒(Stelerachamaejasme),豆科植物美丽胡枝子
(Lespedezaformosa)和大叶胡枝子(L.Davidi)[ 2-6] 。
由于京大戟及其易混品均具有较大的毒性 ,不良反
应多 ,混用具有极大的安全隐患 ,因此迫切需要一
种快速 、准确的鉴定方法用于分辨京大戟及其易混
品 ,保证临床用药安全。
DNA条形码(DNAbarcoding)是利用一个或少
数几个 DNA片段对地球上现有物种进行识别和鉴
定的一项新的分子鉴定技术 ,在物种鉴定 、新种发
现 、濒危物种保护等方面具有广阔的应用前景[ 7, 8] 。
2010年 1月 , ChenSL等[ 9]首先运用内转录第二间
隔区(ITS2)序列对涵盖被子植物 、裸子植物 、蕨类 、
苔藓 、地衣 、藻类和真菌 7个大类群的 6000余份药
用植物样本进行 DNA条形码鉴定 ,其物种水平鉴
定效率达 92.7%。随后 , ITS2序列被用于蔷薇
科[ 10] 、豆科 [ 11] 、大戟科 [ 12]等科属的 DNA条形码研
究 ,同样具有较高的鉴定效率。 2010年 9月 , Yao
等[ 13]通过对 GenBank数据库中 50 790种植物和
12 221种动物 ITS2序列进行研究 ,结果表明 ITS2
序列不但可以用于植物的 DNA条形码研究 ,而且
对于动物的 DNA条形码研究也具有重要的参考价
值。 DNA条形码技术在药用植物鉴定中的成功应
用将是中药鉴定方法的革命性突破 [ 14, 15] 。
2010年 PangXH等 [ 12]对大戟科 871个物种的
1183条 ITS2序列进行比较分析 ,其中包括大戟属
244个物种的 267条 ITS2序列 ,表明 ITS2序列可以
用于大戟科植物的 DNA条形码鉴定研究。本文借
PangXH等[ 12]所确立的方法 ,运用 ITS2 DNA条形
码序列对京大戟及其 18种易混品进行鉴定研究 ,
以期为京大戟的准确鉴定和安全用药提供依据。
　材料与方法
1.1　材料
京大戟样品采自陕西和北京 ,凭证标本号分别
为 PS0187MT01、PS0187MT03和 PS0187MT04,原植
物经中国医学科学院药用植物研究所林余霖老师
鉴定 ,京大戟 18种易混品 ITS2序列来自于 Gen-
Bank,京大戟及其易混品信息见表 1。
1.2　DNA提取和 PCR扩增
取新鲜材料或硅胶干燥的叶子 0.03g,采用植
物基因组 DNA提取试剂盒 (TiangenBiotechCo.,
China)提取 DNA。 ITS2序列扩增参考 ChenSL等
的研究[ 9] 。
1.3　PCR产物纯化及序列测定
从琼脂糖凝胶上切下扩增的目的 DNA片段 ,用
琼脂糖凝胶回收试剂盒(TiangenBiotechCo., Chi-
na)对目的片段进行回收 ,经纯化后作为测序反应
的模板 , PCR反应的引物直接作为测序引物 , 用
ABI3730XL进行测序 。
1.4　数据分析
数据分析流程见图 1。使用 CodonCodeAligner
3.71进行序列拼接 ,使用 ITS2 HMM序列注释模
型 [ 16]获得 ITS2序列区段 ,使用 MUSLE3.6进行序
列比对 ,使用 PAUP4b10进行 K-2P遗传距离计算 ,
使用 MEGA5进行 NJ树构建 ,文章所用程序均使用
Python语言编写 。
表 1　样品及其 ITS2序列的 GenBank登录号
拉丁名 登录号　　　　　　　　　
Euphorbiaebracteolata EU659768
E.milii AF537461
E.esula AF537546
E.milii AJ508974
E.esula EU659749
E.milii GU214936
E.esula GU984311
E.palasi EU659769
E.esula GU984313
E.pekinensis GQ434330
E.helioscopia EU659747
E.pekinensis GU441820
E.helioscopia EU659748
E.pekinensis GU441821
E.humifusa EU659774
E.peplus AF537532
E.lathyris AF537550
E.supina EU659773
E.pulcherima GU214943
E.tirucali AF537479
E.lucorum EU659771
Lespedezadavidi GU217671
E.lunulata EU659752
L.davidii GU572178
E.lunulata GU441824
L.formosa GU572180
E.sieboldiana EU659753
Stelerachamaejasme AJ549498
E.maculata EU659772
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图 1　数据分析流程
　结果
2.1　京大戟种内 ITS2序列变异分析
京大戟 3个样品的 ITS2序列长度均为 219 bp,
均不包含大于 5 bp的单核苷酸重复区(homopoly-
mericregion), GC含量分别为 55.71%、 55.25%、
56.62%。京大戟种内 ITS2序列共有 3个变异位
点 ,分别是位于 47 bp处的 G-A变异 ,位于 103 bp
处的 A-C变异和位于 205 bp处的 T-C变异。京大
戟种内 ITS2序列平均 K-2P距离为 0.0092,最大 K-
2P距离为 0.0138。此外 ,采自北京和采自陕西的
京大戟样品 ITS2序列之间差异不明显 。
2.2　京大戟及其易混品种间 ITS2序列变异分析
京大戟及其易混品 ITS2序列比对长度为 237
bp,序列长度最短的是 E.maculata,为 208bp,序列
长度最长的是 E.sieboldiana,为 223bp,共有 182个
序列变异位点 ,其中信息位点 152个 ,见图 2。京大
戟及其易混品 ITS2序列平均 GC含量为 62.6 %,
GC含量最低的是 Stelerachamaejasme,为 46.4%,
GC含量最高的是 E.lathyris,为 75.9%。京大戟及
其易混品 ITS2序列种间 K-2P距离的平均值为
0.3395,最小 K-2P距离为 0.0427。
2.3　京大戟及其易混品 NJ树
基于 ITS2序列 ,通过邻接法(NJ)所构建的系
统聚类树图(图 3)(bootstrap1000次重复 ,支上数
值仅显示自展支持率≥50%)可以看出大戟属单独
聚为一支 ,支持率为 66,京大戟 3个样品聚在一起 ,
表现出单系性 ,豆科植物美丽胡枝子和大叶胡枝子
聚为一支 ,支持率为 100。
(图 2片段 ,接下页)
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图 2　京大戟及其易混品 ITS2序列变异位点
环球中医药 2011年 3月第 4卷第 2期　GlobalTraditionalChineseMedicine, March2011, Vol.4, No.2 107　
图 3　基于 ITS2序列构建的京大戟及其易混品 NJ树
　讨论
京大戟种内 ITS2序列长度一致 ,仅有 3个变异
位点 ,平均 K-2P距离为 0.0092,且陕西和北京样品
ITS2序列之间没有明显差异 ,说明京大戟种内 ITS2
序列变异较小 ,具有稳定和一致的序列特点 。
京大戟及其易混品种间 ITS2序列长度及 GC
含量变化均较大 ,变异位点多达 182个 ,且有 152个
为信息位点 ,种间 K-2P距离的平均值为 0.3395,说
明京大戟及其易混品种间 ITS2序列差异较大 ,京大
戟 ITS2序列可以明确的与其易混品 ITS2序列进行
区分 。
京大戟种内 ITS2序列最大 K-2P距离为
0.0138,京大戟与其易混品种间 ITS2序列最小 K-
2P距离为 0.0427,种间最小 K-2P距离大于种内最
大 K-2P距离 。同时 ,从基于 ITS2序列构建的京大
戟及其易混品 NJ树可以看出 ,京大戟 3个样品聚
为一支 ,支持率为 91 ,具有明显的单系性。因此 ,我
们可以运用 ITS2 DNA条形码序列准确鉴定京大戟
及其易混品。
参 考 文 献
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(收稿日期:2011-02-16)
(本文编辑:秦楠)
　
·信息之窗·
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