全 文 ：忠a s巴草 地d o f Chin a 1995 , No . 4 , PP. 33~ 37
草木梅单细胞培养再生植株
安利佳 张相岐 ’ 向工 奎风嫂 何孟元 郝 水
(辽宁师范大学生物系 . 大连 1 16 肠 2 2) ( 一东北介范大学细胞与遗传研究所 ,长春 1 3 0 0 2 0
【提要】 研究了建立草木娜优 良悬浮系和单细胞培养再生植株的技术和适宜条件 。 由子叶和
肛轴诱 导的愈伤组织转入分化培养荃 中分化 , 取 已分化出芽的愈伤组织和未分化的愈伤组织建立
悬浮系 , 再由悬浮系分离出单组:犯 .单细胞经液体浅层培养得到了再生植株 . 试验结果表明 ,胚轴诱
`吞的愈伤组织更适合于建立悬浮 系和进行单细胞培养 。 在建立悬浮系过程中 , 每 5 夭换一次新鲜培
养基 比较合适 。 由已分化出 芽的愈伤红织建立的悬浮系分离的单细胞有较高的植株再生颇率 .
关链词 : 草木择 单细胞 悬 矛到乡养 再生植株
中国图书资料分类号 : S欣 l · 9
P l a n t R e g e n e r a t i o n F r o m M o n oc
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.
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,
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T h e e o n d i t i o n s s t
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f o r e n t ia t e d e a ll i w e r o u , 。 d t o 。 , t a b lis h s ,」s p e n s i o n li n e s b y v ib r a t i o n e u l t u r e i n A x li q u id
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.
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s w e r e
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n d u e in g m e d i t l m
.
T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t h y pco o t y l e a l lu s w a s m o r e
s u it a b le f o
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co t y lde o n e a l lu s ; T h e in t e r
v a l o f 5 d a y s f o r e h a n g in g liq u id m e d iu m w a s s u i t a b le t o e s
-
t a b lis h s u p e r io r s u , p e n s io n 11一飞e ; T h e m o n co e l ls o r ig i n a t e d f r o m t h e d i f f e r e n t ia t e d e a l li
h a d h i g h r e g e n e r a t i。 一飞 f r e q u e n e e
.
K e y w o r d s
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P la n t r e g e n e r a
-
t io n
釜 现工作单 位为中国科学院遗传研究所 。
作者简介 ; 安利 佳 ,男 , 39 岁 ,博士 ,副教授 : 十余年来一直从 事植物组织 、 细胞和原生质体培养的研究和遗传转化的研
究 , 已发表学术论文约 20 篇 .
收稿 B期 : 19 , 4一 0 7一 0 1 .
中 国 草 地 1995年
草木择属 (M le l’ ot “ 、 ) 植物大多有 一定 的
经济价值 ,有关该属离体培养已有一些报道 。
T a i r a 等 ( 1 9 7 7 年 )对 白香草木梅 ( M . a z乃u : )
进行了组织和细胞培养 ,仅从愈伤组织分化
出根〔 , 〕 。 aB ia i 等 ( 1 9 8 1年 )在小花草木择 (M .
P a二砚刀邵 a ) 组 织 培 养 中得 到 再 生 植 株 〔 2 , 。
J
o h n s o n 等 ( 1 9 8 2 年 ) 和 o e l e k 等 ( 1 9 8 2 年 )
分别对黄香草木择 (M . O力价 i,l a l’s )进行了原
生 质 体 的 分 离 与 培 养 , 仅 得 到 了 愈 伤 组
织 〔, 、 ` 〕 。 草木择 (M . : u a v e ol e ,。 )是一种优 良的
豆科牧草和密源植物 ,全草亦可药用 。 近年
来 , 我们曾对其进行了组织和原生质体培养
的研究 , 并且得到了再生植株 ` , 、 ` , 。 单细胞培
养尚未见报道 . 为了进一步系统研究草木择
体外培养的再生系统 , 以及利用细胞工程技
术筛选培育草木择优良品种 ,我们进行了草
木梓单细胞培养的研究 ,并着重探讨了建立
优良细胞悬浮系和植株再生的适宜条件 。 现
将结果报道如下 。
表 1 草木握单细胞培养的培养荃
培养基成 分 ( m g / L ) A y l A f 、 A x A y : A f : A s
入 19 5 0 ; · 7 H 20 4 () ( ) 2一)〔 ) 4 0 0 4 0 0 20 0 1 0 0
C
a
C 12
.
Z H : 0 6 6 ( ) 3 3 ( ) 6 6 0 6 6 0 3 3 0 1 6 5
K N O 3 1 9 0 () 9 5一) 1 9 0 0 1 90 ( ) 9 5 0 4 7 5
N H
:
N 0 3 1 6 5 0 8 2 5 16 5 0 1 65 0 8 2 5 4 1 3
K H : P O
: 1 1 7 0 8 5 17 0 17 0 8 5 4 3
微量元素 B s l / 2 1` : B , B s l / Z B , l / 4 B ,
有机成分 B s l / 21弓: B , B s l / Z B : 一/ 4 B s
甘氨酸 2 艺 2 2 2 1
D一 泛酸钙 1 1 1 1 0 . 5
生物素 ( ) . 5 0 . 5 ( ) . 5 ( ) . 5 0 . 2 5
腺昔 ( ) . 5 0 . 5 ( ) . 5
天冬 氨酸 1 1 1
半胧 氨酸 1 1 1
水解乳蛋白 5 0 0 5 (、 〔, 5 00 5 00 5 0 0 25 0
蔗搪 3 ( ) 0 0 0 一() ()一) () 2 0 0 00 2 0 00 0 10 0 0 0 2 0 0 0 0
葡萄糖 2 1) (一() () 1 0 0 00 1 0 0 0 0 2《 ) 0 0 0
2
.
4一 D I () . 2 2 1
6一 B A 0 . 7 () . 7 2 0 . 7 ( ) . 7 0 . 5
N A A 0
.
2 ( )
. 艺 0 . 2 0 . 2 ( ) . 2 0 . 5
G A 3 1
小 A Z
注 : p H = 5 . 8
1 材料 和方法
草木择种子采集于吉林 省西部草原 。 种
子用浓硫酸浸泡 4 分钟 , 再用升汞灭菌 3 分
钟 , 无菌水冲洗 4 次 ,接种在无激素 M S 培养
基上 。 种子萌发 3 夭后切取子叶和胚轴为外
植体接种到 A y , 培养基 (表 l) 中诱导愈伤组
织 。 诱导条件为 27 士 1℃ ,暗培养 。 当诱导出
的愈伤组织长到 s m m 大小时 , 转入 A f ; 培养
基 ( 表 1) 中分 化 。 分 化 条件 为 : 白天 23 一
27 ℃ , 晚间 18 ~ 20 ℃ , 以自然光照为主 , 日光
灯补充照明 ,光照强度为 2 0 0 0一 2 5 0 0 L d x , 每
第 4期 安利佳 张相岐 向 卫 李凤霞等 草木挥单细胞培养再生植株
天光照 12 小时 。
为了建立再生能力强 、 分散性好的细胞
悬浮系 , 我们分别用 已分化出芽的愈伤组织
(芽周围新长出的愈伤组织 )和未分化的愈伤
组织建立 慈浮系 . 将两类愈伤组织分别切碎
( l
、 、 、 m 以 下 、 , 转入 A x 培养基 (表 : )中 、 5 0。 , l
培舒 嘴胡入 1 . 0 克愈伤组织 )进行振荡培养
( 1转 . )m “ 。 分别间隔 5 天 、 10 天和 , 5天换一
次 培养基 , 以比较换液间隔时问对悬浮系的
影响 。 振荡培养 6~ 7 周时用 以尸的镍丝网过
撼 悬俘液以分离单细胞 。
滤液经低速离心 (3 分钟 , 5 c0 rP m ) 沉淀
牟.细胞 ,弃去大部分培养基 , 再用 八夕` 培养基
( 表 l) 将单细胞密度调节到 0 . 5 ~ 1 . 0 又 10 ,
个 /市 l , 然后置培养皿中进行浅层静止暗培养
( 2 7 士 l ℃ ) 。 每 个 5 0 m m 玻 璃 培 养 皿 中 加
5
.
Om l细胞悬浮液 ,每隔 7 天换入 1 . s n 飞l 新鲜
培养基 。 每一种愈伤组织来源的母一个处理
(加液间隔时间 ) 至少接种 10 个培养皿 。 当再
生的小愈伤组织长到 1 . 0 广一 2 . or o m 时 , 统计
愈伤组织再生率 ,并转 卜 固体 A y : 培养基中
增殖 . 愈伤组织长到 s m m 大小时转入 A f , 中
分化 ; 当愈伤组织分化 出幼芽后转入 A f : (表
l) 中使幼芽发育成苗 ; 当幼苗长到 3一 sc m 高
时转入 A s 培养基 (表 1) 中生根 。 用植株再生
率 (再生植株数 /愈伤组织数 x 10 % )来衡量
再生能力 。
2 结果和讨论
草木择子叶和胚轴在 A y l 培养基中均可
诱 导出愈伤组织 , 将两种外植体来源的愈伤
组 织转入 A f , 培养基 中均可分化出不定芽 ,
胚轴愈伤组织的分化率为 69 . 1% , 明显高于
子叶愈伤组织的分化率 ( 28 . 4% ) . 可见 ,草木
裤与某些其它豆科植物相似 〔, 、 . , , 胚轴愈伤组
织更易分化 。
愈伤 组织在 A x 培养基 中振荡培 养 45
天 , 可得到由游离单细胞和细胞团构成的细
胞悬浮系 。用 64 u m 镍丝网过滤得到单细胞悬
浮液 ,其中单细胞比例为 9 写以上 ( 9 . 0%一
9 9
.
5 8 %
, 图 I 一 1 ) 。 根据细胞形态和细胞质
捌密程度 , 可大致将游离的单细胞分为两类 :
第一类为圆形和椭圆形细胞 , 细胞质较稠密 ,
液泡化程度较低 (图 I 一 2 ) ; 第二类为长形及
不规则形细胞 , 细胞质稀疏 , 液泡大 ( 图 I 一
3 )
。 单细胞培养在 A y Z 培养基中 , 第一类细胞
能够分裂 ,而第二类细胞未见分裂 。 第一类细
胞培养 2~ 3 天开始第一次分裂 (图 I 一 4) ,
其中部分细胞能够持续分裂 , 两 周时形成细
胞团 (图 I 一 5 ) ; 3 0~ 3 5 天形成直径 l一 Zm m
的小愈伤组织 (图 I 一 6 ) . 将小愈伤组织转入
固体 A y : 培养基中增殖 20 夭 , 愈伤组织可长
到 s m m 以上 (图 I 一 7 ) 。 增殖后的愈伤组织
转入 A f : 培养基 中 , 7 天后即可分化 出芽 (图
I 一 8 ) 。 幼芽转入 A f: 培养基中 , 幼芽迅速发
育成苗 (图 I 一 9 ) 。 将 3~ sc m 高的幼苗转入
A s 培养基中 , 7 夭左右生根 ,成为再生小植株
(图 I 一 1 0 ) 。
由于外植体种类 、 愈伤组 织的分化状态
以及换培养基间隔时间的不同 , 我们共得到
12 类细胞悬浮系 (表 2 ) 。 不同的悬浮系 , 其单
细胞 密度 、 圆形和椭 圆形细胞的 比例 以及再
生能力都有很大差别 。 在三个处理因素中 ,换
液的间隔时间对于单细胞的质量和再生能力
影响最大 。 间隔 5 夭和 15 天的悬浮系比较 ,
悬浮液中单细胞密度 要降低两个数量级 , 圆
形和椭圆形细胞 的比例降低 70 % ~ 8 0 % ;间
隔 15 天换一次培养基的悬浮 系来源的单细
胞 ,未能再生愈伤组织 . 显微镜下观察到 ,换
液后 4~ 6 天细胞密度达到最高 , 细胞状态也
最佳 。 随后便质量下降 , 主要是老化细胞急剧
增多 。 到 15 天时 , 悬浮系中巨形 、 不规则形和
长形细胞已占大多数 。 个别悬浮系中已基本
上无圆形 、 细胞质浓稠的游离单细胞 。 这可能
主要和培养基的营养状态有关 。
用于建立悬浮系的愈伤组织的生理状态
第4期 安利佳 张相岐 向 卫 李凤霞等 草木挥单细胞培养再生植株
天光照 12 小时 。
为了建立再生能力强 、 分散性好的细胞
悬浮系 , 我们分别用 已分化出芽的愈伤组织
(芽周围新长出的愈伤组织 )和未分化的愈伤
组织建立 慈浮系 . 将两类愈伤组织分别切碎
( l
、 、 、 m 以 下 、 , 转入 A x 培养基 (表 : )中 、 5 0。 , l
培舒 嘴胡入 1 . 0 克愈伤组织 )进行振荡培养
( 1转 . )m “ 。 分别间隔 5 天 、 10 天和 , 5天换一
次 培养基 , 以比较换液间隔时问对悬浮系的
影响 。 振荡培养 6~ 7 周时用 以尸的镍丝网过
撼 悬俘液以分离单细胞 。
滤液经低速离心 (3 分钟 , 5 c0 rP m ) 沉淀
牟.细胞 ,弃去大部分培养基 , 再用 八夕` 培养基
( 表 l) 将单细胞密度调节到 0 . 5 ~ 1 . 0 又 10 ,
个 /市 l , 然后置培养皿中进行浅层静止暗培养
( 2 7 士 l ℃ ) 。 每 个 5 0 m m 玻 璃 培 养 皿 中 加
5
.
Om l细胞悬浮液 ,每隔 7 天换入 1 . s n 飞l 新鲜
培养基 。 每一种愈伤组织来源的母一个处理
(加液间隔时间 ) 至少接种 10 个培养皿 。 当再
生的小愈伤组织长到 1 . 0 广一 2 . or o m 时 , 统计
愈伤组织再生率 ,并转 卜 固体 A y : 培养基中
增殖 . 愈伤组织长到 s m m 大小时转入 A f , 中
分化 ; 当愈伤组织分化 出幼芽后转入 A f : (表
l) 中使幼芽发育成苗 ; 当幼苗长到 3一 sc m 高
时转入 A s 培养基 (表 1) 中生根 。 用植株再生
率 (再生植株数 /愈伤组织数 x 10 % )来衡量
再生能力 。
2 结果和讨论
草木择子叶和胚轴在 A y l 培养基中均可
诱 导出愈伤组织 , 将两种外植体来源的愈伤
组 织转入 A f , 培养基 中均可分化出不定芽 ,
胚轴愈伤组织的分化率为 69 . 1% , 明显高于
子叶愈伤组织的分化率 ( 28 . 4% ) . 可见 ,草木
裤与某些其它豆科植物相似 〔, 、 . , , 胚轴愈伤组
织更易分化 。
愈伤 组织在 A x 培养基 中振荡培 养 45
天 , 可得到由游离单细胞和细胞团构成的细
胞悬浮系 。用 64 u m 镍丝网过滤得到单细胞悬
浮液 ,其中单细胞比例为 9 写以上 ( 9 . 0%一
9 9
.
5 8 %
, 图 I 一 1 ) 。 根据细胞形态和细胞质
捌密程度 , 可大致将游离的单细胞分为两类 :
第一类为圆形和椭圆形细胞 , 细胞质较稠密 ,
液泡化程度较低 (图 I 一 2 ) ; 第二类为长形及
不规则形细胞 , 细胞质稀疏 , 液泡大 ( 图 I 一
3 )
。 单细胞培养在 A y Z 培养基中 , 第一类细胞
能够分裂 ,而第二类细胞未见分裂 。 第一类细
胞培养 2~ 3 天开始第一次分裂 (图 I 一 4) ,
其中部分细胞能够持续分裂 , 两 周时形成细
胞团 (图 I 一 5 ) ; 3 0~ 3 5 天形成直径 l一 Zm m
的小愈伤组织 (图 I 一 6 ) . 将小愈伤组织转入
固体 A y : 培养基中增殖 20 夭 , 愈伤组织可长
到 s m m 以上 (图 I 一 7 ) 。 增殖后的愈伤组织
转入 A f : 培养基 中 , 7 天后即可分化 出芽 (图
I 一 8 ) 。 幼芽转入 A f: 培养基中 , 幼芽迅速发
育成苗 (图 I 一 9 ) 。 将 3~ sc m 高的幼苗转入
A s 培养基中 , 7 夭左右生根 ,成为再生小植株
(图 I 一 1 0 ) 。
由于外植体种类 、 愈伤组 织的分化状态
以及换培养基间隔时间的不同 , 我们共得到
12 类细胞悬浮系 (表 2 ) 。 不同的悬浮系 , 其单
细胞 密度 、 圆形和椭 圆形细胞的 比例 以及再
生能力都有很大差别 。 在三个处理因素中 ,换
液的间隔时间对于单细胞的质量和再生能力
影响最大 。 间隔 5 夭和 15 天的悬浮系比较 ,
悬浮液中单细胞密度 要降低两个数量级 , 圆
形和椭圆形细胞 的比例降低 70 % ~ 8 0 % ;间
隔 15 天换一次培养基的悬浮 系来源的单细
胞 ,未能再生愈伤组织 . 显微镜下观察到 ,换
液后 4~ 6 天细胞密度达到最高 , 细胞状态也
最佳 。 随后便质量下降 , 主要是老化细胞急剧
增多 。 到 15 天时 , 悬浮系中巨形 、 不规则形和
长形细胞已占大多数 。 个别悬浮系中已基本
上无圆形 、 细胞质浓稠的游离单细胞 。 这可能
主要和培养基的营养状态有关 。
用于建立悬浮系的愈伤组织的生理状态
第4期 安利佳 张相岐 向 卫 李凤霞等 草木挥单细胞培养再生植株
表 2 草木握不同细胞悬浮系的培养与再生
悬浮系 ’ 换液间隔
(天 )
单细胞密度
(个 /毫升 )
圈形和椭圆形细胞的比例
( % )
愈伤组织再生率
( % )
植株再生率
( % )
C D -
C D 之 l 0
1 5
7
.
3 又 1 0 4
1
.
2 X 1 0 `
4
.
5 X 1 0 :
6
.
1 X 1 0 5
2
.
5义 10 4
9
.
7 X 10 3
2
.
6 X 10 5
4
.
7 X 1 0
`
1
.
8 又 1 0 3
8
.
4 X I () 5
3
.
0 X I () 5
9
.
9 只 1 0 3
5 8
.
9
4 7
.
6
C D ,
C N -
0
.
0 8
0
.
0 0
2 1 8
.
4
3 6
。
7
0
.
0
.7951
5
l 0
1 5
5
1 0
l 5
5
12
.
8
3 1
.
4
1 9
.
0
9
.
8
0
.
0 7
0
.
0 0
4
.
6
0
.
0
78 2
.
6
NCPD
1 9
.
1
3 6
.
5
0
.
0
。
9 3
.
9
0
.
0
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l 5
2 7
.
4
1 2
.
2
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1 0
2
.
8
0
。
0
.`几J
-
,`DNP
,
C— 子叶 . P— 胚轴 . D— 分化的愈伤组织 , N— 未分化的愈伤组织 .
胞的培养 。单细胞培养过程中 ,倒置镜下跟踪
观察细胞分裂情况表明 , 只有部分圆形或椭
圆形细胞能够持续分裂 , 最后形成愈伤组织 ;
而长形或不规则形细胞基本不分裂 。所以 ,悬
浮系中圆形和椭圆形细胞的比例与再生能 力
有密切关系 . 从表 2 结果来看 , 圆形和椭圆形
细胞在 3 0 %以下的 6 类悬浮 系 ( C D 3 、 C N Z 、
C N
3 、
P D
3 、
P N
: 、
P N
3
)均未能再生 植株 , 而有
3 0% ~ 4 0 %圆形和椭圆形细胞的两类悬浮系
( C N
, 、
P N
,
)也 只有 4 . 6%和 2 . 8%的植株再
生率 。 圆形和椭圆细胞 比例在 47 . 6% 以上的
4 类悬浮系 , 其单细胞再生能力则大幅度提
高 ( 3 6 . 7 % ~ 7 8 2 . 6% ) . 因此 ,悬浮系中圆形
和椭圆形细胞的比例可以作为一个悬浮系质
量的指标来评价和预测其再生能力 。
以上结果表明 ,在草木梅单细胞培养过
程中 ,采用胚轴外植体诱导愈伤组织 ,选用 已
分化出芽的新鲜愈伤组织建立悬浮系 , 振荡
培养过程中每间隔 5 天换一次培养基 , 可以
得到细胞分散性好 、 圆形和椭圆形细胞 比例
高的优 良悬浮系 。 用这样的悬浮系进行单细
胞的分离与培养 ,可高频率地再生植株 。
3 参考文献
T
a i r a
.
T
.
e t a l
.
C a l l u s a n d s
u s卯 n s i o n c u l t u r e o f M 以立卜
t u s a lb a t i
s s u e a n d c e ll
s .
C
r o p 反 i , 1 9 7 7 , 1 7 : 4 0 7~ 4 1 1
玩户j , Y . p . 5 . a n d 5 . 5 . G O粉1 . R e g e n e r a t i o n o f p la n t .
f r o m
e a
l l
u s o f
a
f o
r a g e l
e g u m e
, s w 忱 t e沁v e r ( M e l苗以公
加八 , 刀`。 r 口 压 , t . ) S A B R A O Jo u r n a l , 19 8 1 , 13 : 1 76 ~
17 9
J o h
n
so
n , L
.
B
.
e t a l
.
P
e e t o l丫a se y 一 2 3 f o r ios l a r i n g m -es
o ph y l l p
r o t o p肠` t s f r o tn 此 v e r a l M记如 oe s阵 ice s . P肠 n t
段 1. L e t t e r s , 19 8 2 , 26 : 1 3 3一 1 3 7
Oe k k
,
M
.
M
. e t 。 1
.
P r o t o p l a
s , e u l t u r e o f t h er 吨 u m es :
A r a ` h ls h夕加 g , a , M o l叔 u s o刀介动以自 , rT ifl 对~ 。 -
s u P访 at u功 . 2 . P f la n肥 n p h y s i o l . 创 . 19 8 2 , 1 0 65 : 1 7 3~
17 7
安利 佳等 . 豆科植物组织 培养的研究 . 植物学报 , 1 9 9 3 ,
34 ( 10 )
: 74 3 ~ 7 5 2
张相岐等 . 草木挥原生质体培养再生植株 . 见 : 中国博士
后首届学术大会论 文集 (下册 ) . 北京 : 国防工业 出版社 .
1 9 9 3 , 17 2 6 ~ 1 7 3 0
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.
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19 8 1
,
2 1
:
2 8 9~ 2 9 4
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T i洛 u e a n d O r g a n C u l r u r e , 19 8 6 , 7 : 1 4 9~ 1 53