全 文 ：山西师大学报( 自然科学版 )
第 一卷 第 2 期 1 99 0 年
J ou
r n a l证 s h a n 粗 . T ca e h e r .s U n lve r si t y
N a t u r a lS C」e n e e Ed lt lo n V o L . 4 N o . 2 1 9 9 0
草木握子叶愈伤组织单细胞培养及植株再生①
张俊敏 陈 惠
(生物系 )
摘要 本文对草木挥子叶愈伤组织进行了单细胞悬浮培养 ,对基本培养基 M s 和改良 B 。 、
. 月一 D 浓度对单细胞分裂增殖的影响进行了研究 , 并再生出植株 。
关链词 单细胞培养 再生植株
草木择 (M e 一i lo t u s s u a v e o pe n s ) [ 一、 2〕是一种十分重要的豆科牧草 , 但关于草木探 的组
织与细胞培养工作国内外还尚未有报道 [ 3 、 刁] 。我们试图通过草木择单细胞培养的方法获
得其再生植株 ,并为单细胞育种及原生质体培养奠定基砒 。
1 材料与方法
实验所用材料由东北师大草原所提供 。 种子经 由 0 . 1% 的升汞消毒 15 分钟后 , 用无
菌水冲洗数次 ,接入无外源激素的 M s 培养基上 。 10 余天后子叶伸出种皮 ,将子 叶切成 0 .
` c m , 的小块 ,接入诱导培养基 (见表 1 、 2 ) 。 在温度为 27 士 I C 的恒温箱中黑暗培养 。
将诱导 出的质地 致密且表面颗粒 比较疏松的愈伤组织继 代培养 2一 3 次后 , 转入
1 50 ml 的三角瓶内 ,其内约有 30 m l 的 M S 或改 良 B S 培养液 (激素浓度见表 4 ) ,置于 150 转
/分的往复式摇床上振荡培养 。 10 天左右更换一次培养液 。 当振荡的培养液中细胞达到一
定密度时 , 培养液通过 4 0 目尼龙过滤网得到 97 % 以上的单个游离细胞 。
过滤液 1 50 m l 离心 5 分钟 ,将约 2 3/ 的上清液倒掉 ,剩 l邝 的大部分移入一预先 消过
毒的三角瓶中待用 。 在离心管中剩下约 l翻 上清液 ,摇动离心管 , 使沉淀 悬浮 。 吸取 一滴
于血球计数板上 , 以游离单细胞为基数计算细胞的密度 。 然后重复四次 ,求其平均值 。 再
将上述三角瓶中剩余的 13/ 的上清液倒入离心管中 , 并根据需要的起始密度 , 补加入新鲜
培养基 ( m s 或改 良 B : ,激素浓度同前 ) ,接种的三角瓶置于 1 10 转 /分的摇床上培养 ,两周
后分装入浅层培养瓶 ( 5 0 0 m l) 内进行静止培养 (培养基为 M s 或改良 sB 十 2 . 4一DI . o m g l/
+ B A O
.
7 m g / l+ N A A O
.
Zm g / l )
。
20 夫后 ,将培养液 内的愈伤组织小块 (直径 2— l3 l m )转入含同样激素浓度的平板上继代培养两周 ,然后接入分化培养基 。 培养物每 日光照量 . 0 0 0 / u x 左右 。
转入分 化培养基的愈伤组织培养一个月后便有苗形成 。
当苗长 出 3— 月片小 叶时 , 转 入含 IA A !— ! 0m 8 I/ 或 BI A I— 1o m g l/ 、 N A A
I M g 1/ 或三者配合使用的生根培养基内 , 均可生根 。
① 本文是在郝水先生 、 张传善老师的直接指导下完成 。 工作 ,卜受到安利佳 、 罗希明 、 李风霞等各位老师的大力协
助 。 在此深表谢愈 。
7 2
DOI : 10. 16207 /j . cnki . 1009 -4490. 1990. 02. 016
当小苗长到 7— sc m高时 ,移入花盆便可成活 。
2 结果与分析
我们采用 M S 、 改良 B 。 两种基本培养基诱导愈伤组织 ,结果表明这两种培养基的诱导
效果都比较好 。 因此我们采用 M S 培养基比较不同激素对诱导愈伤组织的影响 。
.2 1 .2 刁一 D 对愈伤组织形成的影响
草木择小块子叶接入诱导培养基上 2一 3 天后 ,子叶的伤面处开始膨大 , 但只在含有
2
. 月一 0 的培养基上能形成愈伤组织 ,而在无 2 . 4一 D 的培养基上 ,不能形成愈伤组织 。 在
2` ,一 D 含量 为 1 . sm g l/ 的培养基上 , 愈伤组织诱导率高达 1 0 % (见表 1) 但这些愈伤组
织质地松散 , 有胶质化 ,这种愈伤组织继代培养生长缓慢 , 不久便死亡 。
表 1 2 . 刁一 D 对草木柳子叶愈伤组织形成的影响
2
.
4一 D 子叶外植体 愈伤组织 愈伤组织 愈伤组织
浓度 m创 l 块数 块数 “ 诱导率 特征
0 4 0 0 0 /
0
.
5 4 0 2 5 3 2
.
5 松散
1
.
5 4 0 4 0
,
10 0 松散
3
.
0 4 0 3 0 7 5 松散
注 :基本培养基为 M S 。
2
.
2 细胞分裂素与生长素配合使用时对愈伤组织形成的影响
在 2 . 刁一 D 与细胞分裂素 、 N A A 配合使用的培养基上 (表 2 ) ,诱导形成的愈伤组织的
质量有所提高 。
表 2 细胞分裂紊与 2 . 刁 D 、 N A A 配合使用对愈伤组织形成的影响
激素浓度 m日 l 草木挥子叶外 愈伤组织 愈伤组织 愈伤组织
B A Z T 植体接种块数 块数 诱导率 特征
0
.
1 4 0 2 5 6 2
.
5 较致密
0
.
2 4 0 3 7 9 2
.
5 疏松 、 沙粒状
0
.
5 D
. 护 月0 3 7 9 2 . 5 致密 、颗粒状
0
.
5 4 0 I 0 2 5 松散 、胶质状
0
.
5 0
.
5 月o 1 l 2 7 , 5 松散
0
.
7 4 0 3 6 9 0 致密 、大颗粒
2
.
0 4 0 l 7 4 2
.
5 松散 、表面涩疤
注 , :基本培养基为 M S
注 : : 2 , 4一 D 浓度为 一 s m g / l : N ^ A o 0 . 2毗 / -
在 2 . d一 D 、 N A A 浓度一致时 , 添加不同含量的 BA 。结果表明 , B A 含量在 0 . 7 m即 I 时 ,
7 3
愈伤组织诱导效果最好 , 即诱导率高 ,且愈伤组织质地致密而表面颗粒较大 。 B A 含量高达
Zm g l/ 时 , 愈伤组织松散而表面有涩疤 。 B A 含量低于 0 . 7 m g l/ 时 ,愈伤组织松散且呈沙粒
状 。
zT
、
2
·
J一 D 、 N从 配合使用时 , 愈伤组织诱导率下降 ,在各实验组其他激素浓度相同
时 , zT 为 0 . l m g l/ 时 ,诱导率明显下降 , 但诱导 出的愈伤组织质地致密 ,呈颗粒状 ,易分
化 。 z T 为 0 . sm s/ l 时 ,所形成的愈伤组织质地松散 、 胶质化 , 不易分化 。 以上结果表明 , 只
有将生长素与细胞分裂素配合使用 ,且比例适当时才能诱导出质量高的愈伤组织 。
2
.
3 基本培养基对草木裤单细胞悬浮培养的影响
表 3 . 荃本培养基对悬浮培养的草木棍细胞分裂增殖的影响
基本培养基 M S 改良 B。
起始细胞数又 1。` /而 2 . 2 2 . 2
终止细胞数又 1。 , /刘 6 。 7 6 . 9
比率 3 . 0 4 3 . 1 3
注 : :培养时间 15 天 。
注 2 :激素浓度 2 . 4 o Zm g八+ B A O . 7 m g / l+ N A A O. Zm g / l
我们采用 M s 和改 良 B S 两种基本培养基对草木糠悬浮细胞进行试验 , 结果表明这两
种培养基均适宜此种愈伤组织细胞的快速增殖 。
.2 4 2
,
4一 D 浓度的增殖效果根据 aT iar 的报告「7 ] , .2 d一 D 浓库是影响悬浮细胞分裂增
殖的重要因素 , 我们也 比较了不同 2 . 刁一 D 浓度对悬浮培养细胞增殖的影响 ,结果见表 4 。
表 4 2 ,月一 D 的不同浓度对草木柳单细胞分裂增殖的影响
2
,
4 D 浓度 m g / - 0 1 2 4 6
起始细胞数 X l护 /耐 1 . 5 1. 5 1 . 5 】. 5 1 . 5
终止细胞数 义 1护 / m1 0 . 9士 0 . 0 7 3 14士 0 . 7 1 5 . ! 士 0 . 0 5 1 . 2士 0 . 0 9 0 . 7士 0 . 0 8
比率 0 . 6士 0 . 0 4 2 . 3 6士 0 . 0 7 3 . 4土 0 0 3 0 . 8士 0 . 0 6 0 . 4士 0 . 0 5
注 t :培养时间 15 天
注 2 :基本培养基为改良 B S
注 3 : 其他激素浓度一样 ,即 : B A : 0 . 7m g/ l ; N A A : 0 . Zm g / l
从表 4 结果看出 , 2 , 」一 D 浓度在 l— 」m g l/ 的范围内均有不同程度的促进细胞分裂增殖的作用 , 2 , 」一 D 为 6 m g l/ 时 ,则抑制细胞分裂增殖 , 2 , 」一 D 为 Zm g l/ 时 , 细胞增殖
率最高 。
转入静止培养液中的单细胞 (见图 I ) , 两天后即观察到细胞开始分裂 , 形成两个细胞
(见图 2) 两个细胞进一步分裂为四个细胞 (见图 3 、 d ) , 又多个细胞 (见图 5 、 6 ) , 大约 20 天
形成愈伤组织小块 (直径 2一 3m m (图 7 示 ) 。
在静止改 良 B : 培养液内细胞分裂形成的愈伤组织团块在 2一 3m m 左 右 , 质地较坚
硬 ; 在 M s 培养液内细胞分裂增殖形成的愈伤组织小块直径在 l一 Zm m 左右 ,质地较软 。 将
这些愈伤组织转到继代培养基中培 养 ,在此过程中 , 其愈伤组织有芽点产生 ( 图 8 ) , 然后
将继代的愈伤组织转入去掉 2 . 刁一 D 的分化培养基中使其迅速生长 。
7 4
待苗长出 3一 4 片叶子时 ,将苗移到生根培养基中 。
从实验中我们观察到 , 培养基中外源激素为 L A A 5m即 l 、
撇 ]m g l/ 时 ,均得到较好的生根效果 。 草木择在无激素的培养基上也可生根 。 等根长到 5一 6c m 长时移入花盆
培养 ,极易成活 ( 图 9) 。 .
3 讨论
3
.
1 基本培养墓对悬浮培养单细胞分裂增殖和愈伤组
织生长的影响
培养基的成分以及诱导外植体的激素组合是组织和
细胞培养成功的关键氏幻 。 豆科植物可供选择的培养基十
分广泛 , 不下 15 种 , 最常用的是 MS 、 sB aLJ 。 本实验选用
sM 和改良 sB
。 实验结果表明 ,在悬浮培养液中 M S 和改 图 9
良 B : 培养基对草木择单细胞分裂增殖是适宜的 , 说明盐浓度较高的这两种培养基能比较
好地满足草木裤对盐含量的需求 。 在静止培养液中 , 改良 B : 中形成的愈伤组织质地比在
sM 中的好
,看来高含量 va : (改良 B : 中 Va ,是 M s 的 25 倍 ) ,低胺态氮 (改良息。 中 N H才态
氮是 M S )的十一分之一 ,有益于提高愈伤组织的质量 。
& 2 .2 ,一 D 浓度对悬浮培养中单细胞分裂增殖的影响 。
对草木择悬浮培养来说 , 2 . 刁一 D 的浓度是影响细胞分裂增殖的重要因素 。 .2 刁一 D 浓
度在 1 . o m g l/ 一 d . o m g l/ 的范围内均有不同程度促进细胞分裂增殖的作用 , 2 . 欢一D 在 2 .
7 5
。 m川 l 时 ,细胞增殖速度最快 。 可当 2 . 4一 D 为 6 . o m s/ l 时 , 又起抑制细胞分裂增殖的效
用 ,所以关于细胞生长素 2 . 4一D 的作用机制还有待进一步研究与探讨 .
本文对草木择子叶愈伤组织细胞进行悬浮培养 , 并对其培养条件作了初步的尝试性
研究 ,其结果得到了草木择的细胞无性系 .
. 考 文 献
l 东北草本植物志 , 1 9 76 ,科学出版社 . 5 : 70 . 75一 77
2 中国饲用植物志 , 1 9 8 7 ,农业出版社 ( 1 ) ; 2 8 7一 2 9 4
3 张谦 . 1 9 8 6 ,植物生理学通讯 , 5 : 6 6一 7 6
4 上海农科院 , x 9 8 6 , 国外作物组织培养 一9 : 5 5一 6 1
5 王成波 . 1 9 87 ,东北师大生物学硕士生毕业论文
6 王纪方等 . 1 983 ,蔬菜组织培养 ,上海科技出版社
7 aT s
r a , T
, 七因 . 1 9 7 7 , e r叩 反 1. 17 : 4 0 7一 4 1 1
S T U D Y O N T H E P L A N T R E G E N R A T I O N F R O M
C U L T U R E S D E R I V E D F R O M C O T Y L E D E N
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2
、
4一 D w as im P o r at n t a u x in t o i n d u e e e a l lu s in t h e p la n t a n d to a f f e e t d i v is i o n o f m o ane ll
.
M S a n d m o d i f i e d B
S m e d i u m
,
th e se t w
o k in d s
o
f m e d i u m w e r e b o th s u i t b le f o r e u lt u r i n g
,
P lan t
r e g e n e r a t io n t o o k P l a e e o n l y i n m e d ia w i th r e d u e e d e o n e e n t r a t io n o f e y t o k i n in s a n d
a U X l n S
-
5 0 f ar
.
n o w o r k w as er P
o r et d a b o u t p la n t r e g e n e r a t io n f r o m m o n o e e l l i n M
.
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·
K e y w o r d s : m o n o e e l l P la n t r e ge n e r a t io n
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