全 文 ：农业生物技术学报 J o rnua l
o f A ng
e u ltu r a l B io t e enh o lo爵 , 20() l , 9 ( 4 ): 3 9 1一 3 9 5
· 研究报告 ·
磨芋属 扭川叮功叩加lI us ) R A p D 标记遗传多样性研究初报 *
陈文炳 ’ 龙春林 ’ * * 张建福 ’
( 1福建省农业科学院农业遗传工程重点实验室 , 福州 3 500 ;3 2 中国科学院昆明植物研究所 , 昆明 65 02 04)
摘要 : 本研究利用随机扩增多态性 D N A (RA p D ) 技术对磨芋 (魔芋 ) 属内野生种和栽培种共 20 份材料进行基 因组 D N A
多态性分析 , 用 34 个随机引物扩增 , 有 23 个扩增出的产物电泳图谱较清晰 , 共获得 26 个位点 ( D N A 片段 ) , 其中 25 9 个
具有多态性 : 供试材料所用 23 个引物的扩增产物都存在种间多态性 , 7 个引物扩增出的产物中有 1 条 D N A 片段在花磨芋种
内样品 (系统 ) 间也存在多态性 。 以 RA P D 标记资料计算获得的遗传相似系数 ( J ac c ar d 相似系数 , jS ) 进行 U PG 入IA 聚类分
析 , 结果表明二 花磨芋种内系统间差异最小 , jS 系数在 0 .9 7一 1 00 间; 两份甜磨芋材料间没有差异 , jS 为 1 . 0 。 在已知的种
间, 两个栽培种花磨芋和甜魔芋间亲缘关系最近 , jS 在 .0 83 刁 . 85 间 , 与另一个栽培种白魔芋间亲缘关系都较远 , jS 在 .0 62 刁石6
间, 栽培种与野生种间亲缘关系都较远 , jS 在 0 . 48 刁石4 间。 在野生种中, 结节磨芋与栽培种系统间关系最远 , sj 在 0 4 8一住 54
间 , 未定名 4 个野生种 jS 在 .0 64 ~ 。名 9 问 , 系统 A . sP 05 与 A . sP 06 关系最近 , jS 为 0名 9 , 其次是 A . sP 01 与 A . sP 气 jS 为
仓73 。 根据亲缘关系树状图 , 当遗传相似系数 sj 在 0 . 5 一 .0 60 之 间时, 20 份材料刚好划分为栽培种与野生种两 个类群 。
关键词 : 磨芋属 ; RA P D二 遗传多样胜; 聚类分析 ; 亲缘关系
S tu 即 o n G e n e t i e D iv e r s ity o f RA P D M a r k e r s in A功。尽功丈p 加刀“ s
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磨芋属 (月刃 。尽功即力。!] us lB um e ex D ce ia sn e ) 系 白 、 果胶 、 多种氨基酸和 友体必需的微量元素 , 具
天南星科 (八招 c ea 目 植物的一个大属 , 计 13 0 余种 有 重要的食用 、 药用及工业的价值 , 开 发利 用前景
l] 。 我国西南地区具有丰富的磨芋种质资源 , 据 国 广 阔 , 是重要的资源植物 。 国内外对磨芋研究有 10 0
内磨芋属物种多样性的最新研究报道 阴 , 在过去的 多年的历史 13 } , 在其种质资源 、 遗传育种 、 系统分
2 0 年里 , 我国磨芋属植物的种数从 6 种增加到 2 2 化与分类等研究颇多 11一 0] : 但大多以传统的方法 从
种 , 其中 1 种为中国特有 , 1 种可供食用 云南 形 态学性状入手进行研 究 。 近年夹 , 随着分子生物
省是磨芋种类最多的省份 , 达 巧 种 , 且有 3 种为云 学的迅速发展 , 新兴的 D N A 指纹分析 (P c R , R A p D,
南省特有 。 据估计 , 还会有更多的新种将在中国发 A F L P 等 ) 技术被广泛应用于植物 的系统分化 、 分
现 。 磨芋属植物块茎富含葡甘聚糖 , 同时含有粗蛋 类 , 物种的起源进化等 ! ,卜 =] 。 但应用分子标记技术
* 中国科学院 ( K Z 95 1一A l 一 10 4) 、 福建省自然科学墓金 ( C9 8 10 0 4 6) 和云南省应甲基础研究基金 ( 19 99 C O0 78 M ) 资助项 目的部分内容
陈又炳 男 , 19 6 2 年生 . 博士 . 副杯 究员, 现工 作兰 位 : 福建出 、 坡检验 检疫 局技犬 由 七. 福州东街 131 号
二联 系作者 . E m a i l lo n g互m a , I k , b . a e e n
收稿 日期 2 0 0 0 一 12 一 1
农 业 生 物 技 术 学 报 20 1年
对磨芋进行系统分化与起源进化的研究 , 国内未见
报道 , 国外仅有少数人利用叶绿体 二 a tK 基 因标记
进行磨芋的系统学分析 (G . B . J . G or b , 19 9 , 私
人交流 ) 。 一些磨芋属植物 开花较难 , 其分类地位难
以确定 , 分子标记可以提供有力的判别证据 , 为此 ,
本研究以随机扩增多态性 D N A ( RA P D ) 技术对磨
芋属部分野生种和栽培种进行基因组的 D N A 多态
性分析 , 旨在探讨磨芋属内种间及栽培种内品种或
系统间的亲缘关系 , 为磨芋属内分类地位的确定提
供分子证据 。 也为磨芋的引种 、 育种和种质资源的
有效开发利用及其产业化发展提供理论依据与实践
指导 。
1 材料与方法
L l 材料 供试材料中有栽培种花磨芋 12 份 , 甜
磨芋 2 份 , 白磨芋 l 份 ; 野生种材料 5 份 , 其中结
节磨芋 1份 , 其它 4 份尚未定名 (表 l) 。 云南省的
材料由中国科学院昆明植物研究所提供 , 10 份福建
花磨芋材料与四川的万源花磨芋是从产地农家收集
来的 。 取初畏开的新叶保存在一 80 ℃ 的超低温冰箱
中备用 。
表 1供试磨芋材料名称与来源
几b le 1 L is t o f A知。印h o p hal l us m at e ir a l s te s te d an d het i r s o ur e e
5 . 旧P le N am e L a t in n别m
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9
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l 2
l 3
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l 7
l 8
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20
云南白魔芋 乃扭 。 , 石q劝叨出 alb us 栽培 云南省
A
.
sP 01 未定名 野生 云南省
A
.
sP O S 未定名 野生 云南省
A sP O6 未定名 野生 云南省
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* 未定名 野生 云南省
结节磨芋 沌功侧钟印力月动” P众诊 baln ~ 栽培 云南省甜磨芋 1 月m or hP 哪面叨 us dl盯 DI i ? 栽培 云南省
云南花磨芋 凡 m呷石弓劝心山 度邺咖` 栽培 云南省
甜磨芋 2 月 . 呷六哪血心璐动监叨厅? 栽培 云南省
屏南磨芋 月川呷五哪劝目的巧 盆哪归 c 栽培 福建省
周宁磨芋 月勿 O甲自`护五a刀出盆。蜘 c 栽培 福建省
政和磨芋 A口 。 , 自叼劝耐“ s k斑刀a C 栽培 福建省
顺昌磨芋 J4切 O甲 h〔 )P h司 IUS k侧勺 a c 栽培 福建省
万源磨芋 月勿口甲力印西 a刀出盆邺归 c 栽培 四 川省
建阳磨芋 J魂用 。 , 为〔帅创了“ s k`袒 aj c 栽培 福建省
武夷磨芋 月勿口切右哪劝 a刀出盖呵 . c 栽培 福建省
幸平磨芋 月勿 O甲 h OI劝 a l l“ 盆哪咖 c 栽培 福建省
邵武磨芋 月勿 O甲 h哪劝 a l 出左哪归 c 栽培 福建省
闽清磨芋 月勿创夕右勿劝曰出 左`坦角 c 栽培 福建省
尤溪磨芋 儿刃。叮泊印力日刀“ s k〔 )nj 自c 栽培 福建省
L Z 方法
1 .2 1 总 D N A 提取 采用 C l ’A B 微量提取法 。 称
取 0 . 5 9置于一 8 0℃ 超低温冰箱中的供试材料 , 倒 人
适量的液态氮研磨 。 其余方法步骤参考文献 〔1 3] 。
L .2 2 R A p D
一
P CR 扩增体系 扩增反应所需引物与
lP us aT q 酶及其专用 1ox B u fe r 购自上海生工公司 。
PC R 扩增仪为美国 P e k in E加er 公司 9 6 0 0 型产品 。
dN T p s 购 自A m e r s ham p han
a e ia 公司 。 总体系为 2 5
协L , 其中 1 0 X B u fe r 2 . 5 林L , 2 . s m m o比 dN T p s 2 . 5 卜
L
,
4 pm o F拼L 的引物 2 . 5 拼L , 2 0一 3 o n g 基 因组 D N A ,
I U lP us aT q 酶 , 加双蒸水至 25 抖L 。 扩增反 应条件
为 : 9 4 ℃ 预变性 7 m in ; 9 4℃ 变性 l m in , 35 ℃ 退火
1 m in
,
7 2 ℃ 延伸 2 m in , 共 4 5 个循环 ; 最后 7 2 ℃
延伸 s m in 。 各样品至少重复两次 , 每次反应设一
个双蒸水对照 。
L .2 3 扩增产物的电泳检测与数据分析 扩增产物
在 1 . 5% 含澳化 乙锭 ( E B ) 的琼脂搪凝胶中电泳分
离 , 最后在紫光灯下用 B i于aR d 显像 仪系统拍照记
录结果 。 RA P D 条带的有无用 “ l ” 和 吧 ” 表示 ,
与双蒸水对照相同的带不加以统计 , 样品间的遗传
相似度用 J a e e ar d 相似系数 ( s im i liar yt e o e if e i e nt ,
即 sj 系数 ) 表示 , jS =a a/ + “ , 其中 a 为两个样品间
相同的 (均为 ` ,l’ ’ 或均为 “ 0’ ) 总带数 , “ 为两样
品间不同的带数总和 。 聚类分析采用 U’P G MA 聚类
法 , 在此基础上建立系统间亲缘关系树状图 。
2 结果与分析
.2 1 磨芋属种间 R A P D 遗传多样性分析 利用随机
扩增多态性 D N A (R A p D ) 技术对磨芋 (魔芋 ) 属
内野生种和栽培种共加 份材料进行基因组 D N A 多
态性分析 , 用 3 4 个随机引物扩增 , 其中 23 个扩增
出的产物电泳图谱较清晰 (图 1 ) , 共获得 2 6 6 个位
点 ( D N A 扩增片段 ) , 2 59 个位点具有多态性 (表
2 )
, 多态性高达 9 7 .4 % 。 供试材料所用 23 个引物的
扩增产物都存在种间位点多态性 。 以上结果表明 ,
磨芋属 内具有极其丰富的遗传多样性 。
.2 2 花磨芋 (A . 人D砚角c) 品种间 R A P D 位点多态
性分析 花磨芋 R A P D 扩增反应结果表明: 选用的
2 3 个引物中 , 16 个扩增出 5 3 个非多态性位点 , 另
外 7 个引物扩增出的 4 0 个位点中, 有 1 个位点在
花磨芋种内系统 (品种 ) 间存在多态性 (图 l , L an e
8
,
10 一 19 ; 表 3 ) , 仅占该种内获得的位点总数 93
的 n . 8 3% , 占磨芋属内 (本研究所用 的材料范 围
内) 获得的位点总数 2 6 6 的 4 , 14 % , 说明花磨芋种
内遗传多样性欠丰富 , 在磨芋属 内仅占一小部分 。
花磨芋品种 (系统 ) 之间的遗传相似度极高 , sj 系
数在 .0 9 7一 1 . 0 , 其中 8 号与 巧 号 、 10 号与 19 号及
2 0 号 、 12 号与 16 号 、 17 号与 1 8 号样品 J司 S j 都分

农 业 生 物 技 术 学 报 200 1年
谱完全相同 , 被鉴定为是同一个品种 。 12 个花磨芋
样品尽管来源地距离遥远 (福建 、 四川 、 云南) , 但
它们之 间的 R A P D 遗传差异却很小或没有差异 ( jS
为 .0 9 7一 1 . 00) , 多态性位点占该种内获得的位点数
的 n . 8 3% , 仅占磨芋属 (本研究所用材料范围内)
总扩增位点数的 4 . 1% , 此结果表明花磨芋遗传背景
可能较为单调 。甜磨芋与花磨芋之 间亲缘关系很近 ,
jS 在 .0 83 一 .0 8 5 之 间 , 且形态学性状差异不大 , 因
此甜磨芋是否可单独定为一个种 A . 动盯功万 , 有待进
一步研究 , 本文暂且在其后面加 “ ? ” (表 1 ) 。 白
魔芋与花磨芋及甜磨芋之间关系相对较远 , 这与形
态学性状上的表现吻合 。 在野生种中 , 未定名的系
统 A . sP 0 5 与 A . sP o 6 间亲缘关系十分接近 , sj 高
达 .0 89 , 二者可能同属一个种 , 是否属实 , 有待结
合其它分子标记如核 r D N A 的 IT S 片段 、 叶绿体基
因组 的 。 a tK 基因等及重要形态学性状的研究 , 并
进一步确定其种名 。 结节磨芋 A夕比诊右俪~ 形态学性状独特 , 与本研究范 围内其它种类 (包括栽培
种与野生种 ) 差异较大 , 这与 R A P D 标记结果一致 。
表 4 磨芋 RA P D 标记相似系数 ( jS ) 对称矩阵
几b le 4 S y n u n e itr e m a lt 认 o f j ac c ar d e o e if e ie nst ( jS ) o f RA P D m ar ke sr in J屯山卿劝哪功心比
材料编号 3 4 5 6 7 8 10 1 1 1 2 1 3 14 17
o
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注 : 7=9 , 8二 15 , 1卜 l卜 2 0 , 12= 16 , 17 = 18
员的支持与帮助 , 福建省农业科学院农业遗传工程重点实验
室陈松彪同志为本研究提出有益建议 , 特此表示衷心感谢!
参 考 文 献
图 2 2 0 个供试磨芋材料 R A卫D 遗传相似系数 ( Jac c ar d 系数 )
的 LJ’P G NlA 聚类分析树状图
F ig
.
2 D e n dr o gr aJ 叮 o f 2 0 了切1 0甲h OI 劝al o sam P le s bas de o n
R A P D da at w it h L)P G M A e lu st e r an a ly s i s
本研究仅仅是对应用分子标记技术进行磨芋属
植物系统分类和亲缘关系研究 , 做方法上的尝试 。
要真正弄清磨芋属植物的系统分化 、 亲缘关系和起
源进化途径 , 还必须 用尽量齐全的材料与更多的
R A P D 引物乃至其他更多类型的分子标记 , 结合重
要的形态学性状进行全面而细致的研究 。
致谢 : 不研究承蒙中国科学院昆明植物研究所李恒研究
1李恒 , 龙春林 . 中国磨芋的分类问题 . 云南植物研究 , 19 8,
20 (2 ): 16 7一 170
2 龙春林 , 李恒 , 陈文炳 . 中国磨芋的物种多样性 : 已知的
和未知的种类 . 中国磨芋协会第二次会员大会赞学术讨论会 ,
重庆 , 200 0 年 7 月
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Am o rp h o Phal lus
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R e v i s io n o f ht e e n d e m i e
A n 1 0 rp h o Ph a l lu s s pe e ie s o f M a d a g as e盯 B o t j a h r b s y s七 1 999 ,
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农业 生物技术学报 J o una l l o fAg i re u lt ua r1 B it oe ch i l o l ogy 1 2 00, 9 (4 ) : 3 95
·简报
适用于 R A P D 分析的蚕卵基因组 D N A 快速提取方法的探讨
莫红丽 ’ 廖富孩 ’ * 林健荣 ’ 余爱群 2 文哲光 ’
( l 华南农业大学蚕业服装系 , 广州 51 064 2 ; 2 广东省丝绸集团公司 , 广州 51 01 80)
T h e R ap i d E xtr
a e t io n o f S ilk w o rm E g g
s G e n o m i e D N A F r a g m e n t of r R A PD nA
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M o H o gn l i
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g d o n g s i lk C o r训 art i o几 GanU g ht o u s l 064 2 )
目前所报道的家蚕基 因组 D N A 的提取方法
( Sh娜 e t a l, 19 8 8 ; aY n g e t a l , 19 9 3 : 夏庆友等 ,
19 % ; 王韵等 , 19 9 7) 基本上都是先应用离子型表
面活性荆 ( SD s) 及蛋 白酶 K 去除结合在核酸上的
蛋 白质 , 然后用酚 、 氛仿变性除去蛋 白, RN as e 去
除 RN A , 最后乙醇沉淀 D N A 获得 。 这些方法操作
过程繁复 、 耗时多 , 需用酚 、 氯仿等有毒试剂 。 本
实验尝试进行改良, 寻找适用于大量样品作 RA卫D
分析并简单 、 快捷 、 低成本的蚕 卵基 因组 D N A 的
提取方法 。
1 材料与方法
1
.
1 实验材料 实验用 9 3 2 、 7 5 3 2 、 芙蓉 、 湘晖 、 9
芙 、 7 湘的家蚕蚕 卵、 各品种的蚕卵人工解除滞育
后进行催青 , 于转青期将蚕卵冷藏备 用. 供作 D N A
的提取材料 。
1
.
2 D N A 提取方法
L .2 1 改良的 S D S 法 在夏庆友等 ( 19 9 6 ) 及王得
元等 ( 19 9 9) D N A 提取方法的基础上作了改进 , 将
莫红丽 : 女 . 2 7 岁 . 硕士 ” 联 系作者 E 一m ia L Jir m ca u e du . c n
枚稿 日期 : 2 0 0 0 一 10 一 30
半个蛾圈的蚕卵刮下 , 加入 6 0 0匹 预冷的提取液充
分研磨 , 倒入 1 . 5 m L 离心管 , 加蛋 白酶 K 至终浓
度为 10 0 n g/ m L , 5 6 ℃保温 Z h , 加 6 0 林L N aA e ( 3
m o比 , PH S . 2 ) , 4℃反应 15 m in , 离心 ( 10 0 0 0 r /
m in
,
10 m in
,
4℃ ) , 取上清 ,加等体积异丙醇 , 一 2 0 ℃
静里 15 m in , 离心弃上清 , 沉淀用 7 0% 乙醉洗涤两
次 , 室温风干 , 溶于 8 0 林L T E ( p H S . o 的 一o m o F
L irT
s 一H C I
,
I
nu
o比 ED AT ) , 一 2 0 ℃保存备用 。
L .2 2 改良的单颗蚕卵提取法 单颗蚕卵提取法在
王韵等 ( 19 9 7) 的方法的基础上加以改进 , 单颗蚕
卵放入 .0 5 m L 离心管中, 用解剖针刺破蚕卵 , 加入
10 0 林L 提取液 [ 10 0 m o比 N a e l
,
10 m m o陇 侧 s -
H C I ( PH S
.
0 )
,
10 r 。幻。 o比 ED AT , 2% SD S , 0 . 0 3 9
m o比 D T I 浸泡 , 加蛋白酶 K 至终浓度为 1o o n目
m L
,
5 6 ℃保温 3 h , 加 RN a s e 至终浓度为 1 0 0 林g/
爪L , 3 7℃ , 1 5 m in 。
(下转第 3 9 9 页 )
8 H e t e sr e h e id
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