全 文 ：应用乙炔还原法测定绿萍固氮酶活性的
一些技术问题的探讨 ’
浙江省 农业科学院土攘肥料研究所 色谱组
自从 B u r r i s , S e h 6 l l h o r n 和 D i l w o r t h
等人发现固氮酶具有还原 乙炔为乙烯的作用
后 ( 1 9 6 5一 1 9 6 7年 ) , 乙炔还原法随即得到
了许多有关研究者的关注 , 不久便被广泛用
于生物固氮的研究 。 至 70 年代初就有人应用
此法来测定绿萍的固氮酶活性 , 而且从实验
室进一步发展到田间直接测定 。 对于反应时
的乙炔分压 、 氧气和惰性气体的运用以及一
氧化碳 、 光照 、 温度对测定的影响等等 , 国
内外都进行了较详细的研究 , 且均有 了明确
的结论 。 然而 , 由于该法问世不久 , 还存在
不少问题 , 尚待不断改进 和 完 善。 我 们于
1 9 7 9年开始 , 也采用该法测定绿萍的固氮酶
活性 , 从中发现比例常数 K 、 换算系数 a 以
及测定时的环境条件和反应时间等等一系列
因素 , 都直接影响到测定结果 。 为此 , 对如
何确定合适的测定条件和较为合理的计算方
法 , 做了一些试验 , 现分别讨论如下 。
浅进行调节。 总的要求是使 瓶 内 空 间保持
10 0 立方厘米的刻度为准 ) 。 通过盐水 瓶上
口的橡皮塞注入 0 . 1分压 ( 10 毫升 ) 的乙炔 ,
待反应一定时间后 , 用 1 毫升注射器抽取气
样 , 以硅橡胶封闭气样 , 进入色谱仪定量 。
( 注射器与针头连接处应用活塞油涂抹 。 使
用前用硅橡胶检查是否漏气 , 即将针头插入
硅橡胶内 , 用手拉注射器芯 , 如能很快恢复
原状 , 则证明不漏气 ) 。
所用气相色谱仪系上海产 1 04 型 。 其主要
工作参数为 : 色 谱 柱 温 75 ℃ , 气化 温 度
10 0 ℃ , 鉴定器室温 80 ℃ , 载气流量 60 毫升 /
分 , 氢气流量 30 毫升 /分 , 空气流量 3 0 毫升
/分 , 色谱柱采用表面涂有真空油的氧 化 铝
充填不锈钢柱 , 并使用氢火焰鉴定器。
二 、 试验结果
一 、 试验条件与方法
待测萍为在自然条件下培养于装有无氮
培养液的陶瓷钵或玻璃缸中的萍体。 反应瓶
采用 50 。毫升去底或从中部切断 、 其高 度 根
据需要而定的盐水瓶 。 测定时将反应瓶罩住
萍体 , 瓶内空间体积为 1 0 立方厘米 (在浅缸
培养的 , 可用培养液的深浅进行调节 ; 在深
缸培养的 , 则用铁支架上的夹子上下移动进
行调节 ; 田间培养的 , 用反应瓶埋入土层深
1
. 关于比例常数 K问题 :
从气相色谱仪中 , 分别测得乙炔 、 乙烯
的峰高 , 再把反应瓶内的绿萍烘干称重 , 根
据下式计算所得的固氮量 :
N ( 单位摩尔数 /单位样重 · 单位时间 )
= 二 . A . Y · K
a
其中V : 乙炔进样体积 ,
Y
: 乙烯 、 乙炔峰高比 ,
A
: 换算因子 ,
a : 乙烯与氮的转换系数 ,
, 本文 由毛美飞同志执 笔。 参加本项探讨工作的有 毛美 飞 、 利卓桑 、 祖守先 、 王福来 、 赵 冰波等 同志 。
DOI : 10. 16178 /j . i ssn. 0528 -9017. 1982. 02. 012
n : , H ` / n e
: H:
h e
: H ` / h e
Z H Z
乙炔峰高ǎ毫米à
K
: 乙烯 、 乙炔含量比对峰高比的
比例常数 。
显而易见 , 上式中K 为常数。 这里是假定乙
烯 、 乙炔各自含量对其相应峰高的全部数量
范围都成简单的正比关系 , 即 :
h q H
` = C i + b
·
n e : H -
h e
: H , 二 C Z + d · n e : H ,
则 : K 二
= C
」· n e : H ` + d
·
n e , H :
·
n 。 , `
C:
·
n c 。场 + b · n e Z H ; · n e : H Z
通常背景因子 C , , C: 均为零 , 故 K = d/ ob
因 b 、 d 皆为常数 , K 也应是常数。 ( 其中
b
、
d 分别为乙烯 、 乙炔单独进样测定时其峰
高对进样量的比值 , 即峰高函数对进样量变
量的斜率 ) 。
然而我们采用较优的内标法 , 所得的比
例常数 K 并非确为常数 , 而是乙烯 、 乙炔各
自量的函数 ( 见图 1 、 2 ) 。 由图 1 、 2 可
见 : b = b ( n c o H ) , d二 d ( n e , H Z ) 。 K 既 为 两
变量之比 , 理所当然也为变量 。 但也发现 ,
曲线上存在着直线段 , 乙烯的线性范围约 2
毫微克分子 , 乙炔的线性范围约 30 毫微克分
子 。 在两个线性范围互 相 覆 盖 的直线区域
内 , 混合气体呈线性关系 。 但在 实 际 测定
中 , 固氮体系的乙炔含量 , 远远超过线性范
围。 故一般来说 , K 将永远不会是常数 。 所
以必须详细地测定 n勿` / n e , H , 与 h e : H ` / h e o H ,
的比值 ( 见表 1 ) , 然后根据峰高比的线性
乙炔毫微克分子数
乙炔含量与其峰高曲线图
理想曲线
乙烯峰高ǎ毫米è
实际曲线
10 0 1石O
乙烯毫微克分子 数
乙 烯含量与其峰高曲线 图
即
;
!
l衅lj仁匹取
表 1 乙烯和 乙炔不同比 值下的 K 值
两气休分子数之 比 ) 乙烯峰高 (毫米 ) 乙炔峰 高 (毫米 ) } 乙烯峰高 / 乙炔 峰高
( q 氏 / q H Z )
10
一 3 ( 0
.
0 ! / 1 0 )
10
一 2 ( 0
.
1 / 1 0 )
10
一 1 ( 1 / 1 0 )
10 0 ( 1 / 1 )
1 01 ( 10 / l )
*
10空 ( 1 0 / 0
.
1 )
10 3 ( 10 / 0
.
0 1 )
二下二班二二二仁止巨二于一…’ · 5 3又” · 6 , x ` { 7 5 , x 6 4 ! 7· 4 5 x 6 4 } 3 ’ 0又 ’ o二` …3· “ 3 x ’ o丁` 11 ’ 3 · 2 2 X ` i ’ 5 · ” O X ` } 7 · “ 5义 6 4 { 了· 2 5 x “ 4 { 3 · 。 X ’ o一` { “ · ’ x ’ 0一 ` }…` · , s X ’ 6 { ` · 7 2 X ` 6 …7 · 3 3又 6 4 ! 了· 30又 6 4 {’ · O X ` o一 { ! ’ · O X ` 0了 {
{
8
·
4 X 6` { ` · 4 5又 6` { 7
, ” 又 6 4
{
7
· ” x ` 4 { ’
· ’ O X ’ 0” { ’
·
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1
` · s 3 X 6 `
{
9
· 。5 X 6 ` … 一 i 一 1 一 _ 卜 一 - 一…” · “ 2 X 6 4 1 “ · 7 5 X “ 4 1 4 · 2 0 X 2 …4 · 2 2 X 2 } “ · “ 7 X ’ 0{ { 。 · “ 7 X ’ o {】9 · ” X 6 4 ; “ · 9 X 6 4 { “ · 8 9 X ` …” · ` 4 X ’ 】” · 6 s x , o` }叼些i岁1 0` ’ · 5 , 5 2
. 由于仪器上 1 / 8衰减 比发生故障 , 溯定无结果 .
,
1 0 0
·
范围来选取相应的 K值。 具体测定方法如下 :
所用乙烯取自上海高桥 化 工 厂的 精乙
烯 , 乙炔取自上海吴淞化工厂 。 选取 乙烯 、
乙炔体积比从 1 0 一 “ 、 1沪之间进行测定 。 两种
气体分别从钢瓶中抽出 , 不行 稀 释 充入球
胆 , 准备好 7 只 5 0 0毫升盐水瓶 ( 瓶的容 积
尽可能一致 ) , 瓶 中空气无须抽出 , 用针筒
从球胆中抽出所需量的气体 , 分别注入盐水
瓶 。 如 乙烯与乙炔体积比为 1 0 一 “ 的 , 则分 别
注入 0 . 01 毫升的乙烯和 10 毫升的乙炔 。 ( 其
中 1毫升以下的 , 应用微量注射器 ) 。 随后
抽盐水瓶内混合气体打入色谱仪定量 。 ( 因
仅须测相对量的峰高比 , 故对仪器进样体积
的准确度无严格要求 ) 。 结果见表 1 。 表 1
中第一栏为两气体的分子数之比 , 乃是 由于
两气体处在同一条件下 ( 指压力和温度 ) ,
根据理想气体状态方程 : P V 二 n R T , 在相同
温度和压力条件下 , 其体积比相当于分子数
之比。
如测得某一样品的乙烯 、 乙炔峰高比为
0
.
3 , 则选用 0 . 3 3 3 3为其K 值。
2
. 关于乙烯与氮的转换系数 a 及固氮率
问题 :
迄今为止 , 乙炔还原法仍限于间接定量
作相对比较 。 究其原因 , 除环境因素 ( 主要
是光照和温度 ) 时时刻刻影响绿萍的固氮强
度外 ( 见图 3 ) , 转换系数 a 在很大程度上
影响该法的准确性。 在结果计算式中 , a 为
定量因子 , 若排除其它定量因子的误差 , 则
根据误差原理 , 易知 a 有多大误差 , 结果也
有多大误差 。 很多研究者常取理论值 a = 3 ,
即固氮体系还原 3 份乙炔相 当 于 固定 1 份
氮 。 但也有研究指出 a 应略高于 3 。 还有报
导为 6 , 4 . 4 , 2 . 5等等。 可见转换系数至今
没有一个公认的统一的标准 。 为使结果接近
真实值 , a 的确定具有重要意义 。 我们曾试
图用易行的开氏法配合乙炔还原法求 a , 结
果得到不同萍种间 的 a 值 , 虽 可 在 2 . 86 、
3
.
89 范围内变动 ( 见表 2 ) , 但除美国细绿
萍外 , 其余萍种皆接近理论值 3 , 与理论值
的平均偏差仅为。 . 1 6。 又若把各萍种在一昼
夜内所得到的乙烯量除以理论值 3 , 计算得
到的固氮量与开氏法进行比较 , 其差异并不
显著 ( 见表 2 ) 。 由此是否可下 这 样 的 结
表 2 转换 系数 a 值的测 定结果 以 及 乙炔还原法与开氏法测得绿萍 固氮量的比较
每克干萍一昼
夜 繁 殖 量
(克 )
据实测乙 烯值 以 a
值为 3 换算出的固
氮量 (笔克分子 /克干萍 。昼夜 )
值a测实
测量动
一00。一一rl一11.11
!!
,一一朽147“8弘尼罗萍
小叶萍
卡州萍
墨西哥萍
细绿萍 (美 )
本地萍
细绿萍 (东德 ) 一巨0 。 4 20 . 6 20 。 5 30 . 5 70 . 7 80 . 7 70 . 7 3
) 每克干萍一昼 千萍含氮 量 用开 氏法测得 乙炔还原法测
萍种名称 { 夜 繁 殖 量 ( % ) 固 表二 量 得 乙 烯 量
l ( 克 ) (毫克份子 /克 (毫克分子 /干 萍 . 昼夜 ) 克千萍 。 昼夜 )
0
.
1 3 5 3 4
.
4 5 } 0
. 牛3
0
.
2 0 0 0 4
.
1 4 { 0
.
59
0
. 工7 5 7 4 . 4 7 0 . 56
0
.
15 6 6 5
.
1 4 0
.
5 7 {
细绿萍 (美 ) 0 . 1 5 2 0 5 . 5 5 1 。 . 6 0 {
0
.
2 0 4 0 4
.
8 8 0
. 了1
0
. 土9 5 0 5 . 5 4 ; 0 . 了7
{
注 : 1 . 乙炔还原法测得的乙烯 量 。 为 4 次重复平均值 口
2
. 根据对 开氏法与乙炔还原法所测得的固氮量之问 , 进行 t 测验结果 。 差异不显著 。
论 , 即乙烯量与氮分子的转换比率仍可按理
论值 3 : 1 为基础进行计算 , 而直接测得绿
萍的固氮量 。
关于固氮产率问题 , 从测定各绿萍种在
不同季节中和同一季节不同气候条件下 ( 如
晴天与雨天 ) 以及一昼夜的固氮酶活性变化
( 见图 3 和表 3 、 4 ) 表明 , 各绿萍种的固
氮酶活性因季节气候条件而各异 。 图 3 还明
显可见 , 在一昼夜的 12 个测定点上 ,每点的固
氮率都不一样 ( 其实每天的这种 N 一 t 图均
1 0 1
各异 )。 由此可见 , 用某一时刻的产率来代
表一昼夜的平均产率是不合适的 , 更不宜用
在一天的任何时刻测定的产率来代表一季甚
至一年的产率 。 试验表明 , 在一昼夜里 , 每
隔 2 小时测定一次 , 然后累计一昼夜的总固
氮量 , 与开氏法测定结果颇为接近 , 差异不
显著 。 由此认为 , 在给定的时间单位内 , 多
次取样测平均产率 , 较接近实际 。 如果要估
算各萍种在不同季节的固氮量 , 则必须选取
有代表性的天气 ( 晴、 阴 、 雨 ) , 分别测其
一昼夜的固氮总量 , 再根据气象资料求得较
符合实际的固氮产率 。
/
一 。 、 一
/
。 、
, ` 丈一 、
一 。一 。一 小 歼落一 .一 .一 卡州萍
-— -— 本地萍- - - - - -一 东铸细 绿萍
1 峥止 `
0
.
8 / 二》 、 声 ` .欢之 ~ ` ~ ~
0 戌
0
.
1
乙姆ǎ毫微克分子/平萍·à
笙助 气温
3。 , 0 0 0 光
照
, 1
,
0 0 0 勒
竟
1 。。。 堑
l 践 2几
叶 封
图 3 各种绿萍 1 昼夜内固氮酶活性变化图 ( 又称 N 一 t 图 )
注 : 1 9 8 0年 9 月 , 8一 2 9日 ( 阴天 ) 测定 。
表 3 不同时期绿萍固氮酶活性 变化表
固氮醉活性 ( 乙烯毫微克分子 /克千萍 . 分 )
萍种编 号 i亏百6车 一 {一~ i亏百J三莽
5 j J 12 」6 月 16
、 一 1 3日 } 一 1了日
19 8 0年 1 9 8 0年
1 1月 4 1 月 1 5
一 5 日 一 16 日
表 4 同一季节内不同天气条件对
绿萍固氮酶活性的影响
( 19 80年 )
固氯酶活性 (乙烯毫微 克分子 /克千萍 ·分 )
O
尹
Rù`OJOō j比UO矛 r入U一了
1 0 1 0
1 0 92
5 6 6
2 3 6 ()
5 7 2
12 6 9
2 52
2 2 6 7
6 5 4
13 8
2 8 3
2 8 2
2 3 2
1 2 4
4 3 8
4 3 6
4 1 4
1 2 5 7
绿种编 号 晴 天 } 雨 天
( 9 月 1 2
一 1 3日 )
( 9月 18
一 19 日 )
{ 阴 天
{ ( 9 月 2 8
{ 一 2 9日 )
1 2 8 1
1 10 9
1 1 95
16 19
16 10
15 2 7
10 13
9 3 4
1 1 0 4
8 7 5
9 0 2
1 02 7
84 7
9 4 1
J斗八U一才一了月件1石1aCn八厂nō合
J人J孟U,乙q伪月任几ù6。凸月峥l该一勺乙声,Jù嫂
J.工
飞ùn口盆斗;é一护。丹qJ.l、j
` .工,上
注 : 表中数字为 1 昼夜 中每隔 2 小时测定 1 次 , 计
12次的平均值。
3
. 关于培养时间 :
对 乙炔还原法正确性影响较大的还有取
1 0 2
-
样因子 。 其中在 乙炔饱和下的培养时间 , 便
决定着所取气样是否对固氮体系 具 有代 表
性。 我们曾分别在室内和室外探求最佳的培
养时间 , 从中发现 , 在绿萍的固氮体系中 ,
活化时间极短 , 通常10 分钟内就足以使其活
化 , 并且其固氮率随培养时间的增长而降低
( 表 5 ) 。 这可能是由于在 绿萍 固 氮体系
中 , 其固氮酶迅速活化 , 致使能量消耗瞬间
突然增多 , 而乙炔还原产生的乙烯 , 对绿萍
并无用处 , 因此产生上述结果 。 为此建议 ,
在绿萍固氮体系中 , 以培养 10 分钟左 右 为
宜 。 但考虑到大批样 品 测定 , 手续费时较
长 , 则可酌量增加反应时间 。
下面举一应用实例 , 作为参考 。
表 5
培养时间
最佳培养时间测定结果表
单位时间内所产 生的乙烯量 (毫微克分子八 分钟 · 克干萍 )
“ ” 场 “
1
( 分 )
{
-石丽矛下翻而万飞鑫严一卜二蔺下窄寥一履氰黔
一— { , 。 … : 8 … : : { 14 8 1 : : } : 9 5 … : 4
… “ 0 … 5 } 9 } 了2 { 5 } , 4 1一上王) 一 -
1
1。
{
: 9 8
1
; 。。
1
4 0 5 … 2 9 4 1 3 5 1 { 一
人工气候 室内 l ’ 。 1 “ 了 l ’ “ 1 3“ { ` 6了 1 ” “ l -
1 6 0 { 5 4 } 1 3 0 } 14
2
}
3了
1
1 4匕
1 二
注 : 室外的测定 日期为 19 8 0年 1 月 2 1日 , 光照为38 , 0 0勒克斯 , 气温为 1 ℃ 。 人工气候 室内的测定 日期为 1 9 81 年
1 月 2 4 日 , 光照为 2 7 , 0 0 0勒克 斯 , 气温为 1 7 , 5℃ 。
于 50 0毫升去底盐水瓶内 , 平铺一层小叶
萍 , 注入 10 毫升乙炔 , 在 15 ℃下 作 用 10 分
钟 , 用 1毫升注射器抽取气样 , 进 0 . 5毫升左
右入色谱仪分析 , 测得乙烯峰高为 7 . 75 x l
毫米 , 乙炔峰高为 1 . 41 x 64 毫米 。 最后把盐
水瓶内的绿萍取 出烘 干 , 称 得其 重 量 为
0
.
0 7 3 2克。 计算结果如下 :
以毫微克分子为单位。 将以上结 果 再乘 以
几护, 便可得到以毫微克分子 为 单 位的数值
( 即 5 0 6毫微克分子八 克千萍 · 1 分钟 ) 。
小 结
把在
子数 ,
根据气体状态方程式 P V = n R T , 首 先
1个大气压下的 1 。毫升乙炔换算成克分
即 : I X 10
10 0 0
= n
·
0
.
0 52 ( 2 7 3 + 1 5 )
,
n = 42 x l o一克分子 。 乙烯 、 乙炔峰 高比为
二二里兰L 一 s . 6 x i o 一 “ 。 查 表 1 , 取 K
1 4
.
I X 6 4
= 0
.
3 0 7 8
。 最后算得单位绿萍在单位时间内
所固定的氮量为 :
n _ , , , 1
到 = 一 · Y , 八—a 、V 4 2 X 1 0
一 5
3
X 8
.
6 X 1 0
一 3 X 0
.
3 0 7 8 X
1
0
.
0 7 3 2 X 1 0
= 5
.
06 X 10
一 7 克分子 /克千萍 · 1 分钟 。
由于这个计量单位过大 , 目前国内外都
1
. 应用 乙炔还原法测定绿萍的固氮酶活
性 , 其比例常数K 的取法 , 应使试样的烯 、
块峰高范围与标准 h 一 n 图吻合 , 再取相应
的斜率作为 K 值。
2
. 由于固氮酶活性随时随刻受环境条件
的影响 , 因此 , 须多点短时间取样测定 , 其
平均值方具代表性 。
3
.若仅仅 比较不同萍种间的固氮强度 ,
只要计算还原所得的乙烯量即可 ; 但若要求
其绝对固氮量 , 一般仍可取理论 a 值为 3 作
为乙烯与氮的换算比率。
4
. 在绿萍的固氮体系中 , 活 化 时 间 较
短 , 一般 10 分钟就足以使其活化 。 因此 , 少
量样品测定 , 以10 分钟为宜 。 大批样品测定
时 , 虽可酌量增加反应时间 , 但 也 不 宜 过
长 。
1 0 3