全 文 ：中国农业科技导报 , 2009, 11(1):92-95
JournalofAgriculturalScienceandTechnology
　收稿日期:2008-04-16;修回日期:2008-07-08
　基金项目:“十一五 ”国家科技支撑计划项目(2006BAD16B03, 2006BA04A04);公益性行业(农业)科研专项经费项目(nyhyzx07-
022);农业部 948项目(2006-G38)资助。
　作者简介:杨秀芳 ,硕士研究生 ,研究方向为草地生态。 E-mail:yyrmm123@126.com。通讯作者:孙启忠 ,研究员 ,主要从事牧草生
产与加工技术研究。 Tel:0471-4926909;E-mail:sunqz@ 126.com
2个不同类型尖叶胡枝子的微形态和分子标记鉴定
杨秀芳 1 , 　孙启忠 2
(1.甘肃农业大学草业学院 , 兰州 730070;2.中国农业科学院草原研究所 , 呼和浩特 010010)
摘　要:通过扫描电镜观察到叶片浓绿型和叶片黄绿型 2个不同类型尖叶胡枝子的豆荚和种皮微形态具有明
显差异 , 其特征可作为 2个不同类型尖叶胡枝子的鉴定依据。还采用 ISSR-PCR分子标记方法对 2个不同类
型尖叶胡枝子进行了鉴定。实验共考察 8个引物 , 筛选出引物 UBC-880可以独立区分开 2个不同类型的尖叶
胡枝子 , 叶片浓绿型尖叶胡枝子可产生 1条 500 ～ 600 bp大小的多态性谱带 ,表明 ISSR-PCR方法可为鉴定 2
个不同类型尖叶胡枝子提供 DNA分子水平上的依据。
关键词:尖叶胡枝子;扫描电镜;ISSR-PCR;微形态;分子标记
中图分类号:S541+5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1008-0864(2009)01-0092-04
MicromorphologyandMolecularMarkerIdentificationof
TwoDiferentTypesofLespedezahedysaroides
YANGXiu-fang1 , SUNQi-zhong2
(1.ColegeofGrasslandScience, GansuAgriculturalUniversity, Lanzhou730070;
2.GrasslandResearchInstitute, ChineseAcademyofAgriculturalSciences, Hohhot010010, China)
Abstract:TwodifferenttypesofL.hedysaroideswithyelow-greenleafordark-greenleafshowedobviousdifferences
inmicromorphologicalfeaturesofpod-coatandseed-coatbyscanningelectronmicroscope(SEM)observation.These
micromorphologicalfeaturescanbeusedforidentificationoftwodifferenttypesofL.hedysaroides.ISSR-PCR
molecularmarkerwasalsousedtoidentifytwodiferenttypesofL.hedysaroides.Amongeightprimersfor
experiments, theprimerUBC-880 wasabletodistinguishtheexaminedtwodifferenttypesofL.hedysaroides.L.
hedysaroideswithdark-greenleafhasapolymorphicbandin500 ～ 600 bp.ISSR-PCRmolecularmarkercanbeused
toidentifytwodiferenttypesofL.hedysaroidesonDNAlevel.
Keywords:Lespedezahedysaroides;SEM;ISSR-PCR;micromorphology;molecularmarker
　　尖叶胡枝子 (Lespedezahedysaroides(Pal1.)
Kitag.)为豆科胡枝子属(LespedezaMichx.)草本
状半灌木 ,属多年生植物 。它抗逆性强 ,适应性
广 ,营养丰富 ,家畜喜食 ,是保持水土 、改良草地和
建植人工草地的优良豆科牧草 ,近几年来受到格
外重视 [ 1] 。在多年的栽培过程中 ,尖叶胡枝子种
群内明显地分化出叶片浓绿型和叶片黄绿型 2个
类型。
简单重复序列间扩增多态性(inter-simplese-
quencerepeats, ISSR)标记技术是近年发展起来的
一种新型分子标记技术[ 2] ,它是根据基因组内广
泛存在的微卫星基序列设计单一引物 ,对基因组
DNA进行扩增。它可以快速 、高效和准确地检测
出基因组 DNA的多态性 ,具有操作简单 ,结果稳
定 、可靠等优点 。因此 ISSR标记在品种鉴定 、指
纹图谱的建立和遗传多样性分析中已得到广泛应
用 [ 3 ～ 6] 。另外 ,有关植物种子微形态结构的研究
已成为当前种质资源保护的一个热点 ,在鉴定学
中的应用也有不少报道 ,涉及到植物检疫 、花卉栽
培 、中药鉴别等多个方面 [ 7, 8] ,但尚未见关于胡枝
子属种子微形态结构研究的报道。本文采用 IS-
SR-PCR分子标记方法对 2个不同类型尖叶胡枝
子进行鉴定 ,同时利用扫描电镜对 2个不同类型
尖叶胡枝子的豆荚和种皮微形态进行观察 ,为其
种质资源创新和保护提供依据 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
试验所用的材料采自内蒙古自治区林西县试
验基地 。林西县位于赤峰市北部 ,大兴安岭南麓 ,
东连巴林右旗 ,西与克什克腾旗毗邻 ,南以西拉沐
伦河为界 ,与翁牛特旗 、克什克腾旗隔河相望 ,北
与西乌珠穆沁旗接壤。地理坐标为东经 117°37′
～ 118°34′,北纬 43°14′～ 44°15′。平均海拔高度
为 900m,属半干旱大陆性季风气候 。供试材料
于 2006年 5月 26日播种 ,播种当年除两遍杂草 ,
秋季浇冻水 。
微形态鉴定所用材料为自然干燥的叶片浓绿
型和叶片黄绿型两年生尖叶胡枝子的豆荚和种
子 。分子标记鉴定材料是分单株采集两年生尖叶
胡枝子 2个不同类型开花期幼叶 ,将采集的样品
用纱布包裹置于液氮中 ,带回实验室后 -20℃保
存备用 。
1.2　实验仪器与试剂
主要仪器:扫描电子显微镜(S-530, 日本);
PCR扩增仪 (PTC-200 ,美国 MJ公司);电泳仪
(Power-PAC300,美国 Bio-Rad公司);紫外分光光
度计(BECKMAN-DU640,美国);多通道分子成像
系统(Fluor～STM Multilmager,美国 Bio-Rad公司)。
主要试剂:8条 ISSR引物(见表 1)由上海生
工生物技术公司合成 , 2×TaqPCRMasterMix(含
染料)和 100bpladder购自北京天根时代科技有
限公司 ,琼脂糖购自南京博尔迪生物科技有限公
司 , GoldViewTM核酸染料购自北京赛百盛基因技
术有限公司 ,其他试剂为国产分析纯 。
1.3　电子扫描显微镜鉴定
将自然干燥的豆荚或种子样品均匀地撒在载
物台上的双面胶纸上 ,并对不同的样品进行编号 ,
然后将此载物台经 IB-5型离子溅射仪(日本)进
行镀膜 。镀铂厚度控制在 250 。在电压 25 kV、
放大倍数 100倍和 600倍条件下观察豆荚表皮微
形态 ,放大倍数 8 000倍条件下对种子样品进行
观察。
表 1　ISSR引物序列及退火温度
Table1　ListofISSRprimers, theirsequences
andannealingtemperature.
引物
Primer
序列
Sequence
退火温度(℃)
Annealingtemperature(℃)
UBC-809 (AG)8G 52
UBC-811 (GA)8C 52
UBC-812 (GA)8A 50
UBC-824 (TC)8G 50
UBC-825 (AC)8T 52
UBC-827 (AC)8G 50
UBC-842 (GA)8YG 52
UBC-880 (GGAGA)3 50
　Y=C/T.
1.4　DAN分子标记研究
1.4.1　DNA提取　用植物基因组 DNA提取试
剂盒(离心柱型)分别提取 2个不同类型夹叶胡
枝子的总 DNA, 用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测
DNA质量 , DNA的纯度和浓度通过紫外分光光度
计测定 。
1.4.2　ISSR反应体系及程序　本试验参照赵杨
等 [ 9]胡枝子属 ISSR-PCR优化体系及其中的 8条
引物进行。
ISSR反应体系为:总体积 20 μL,含有约 40
ng基因组 DNA, 0.2 μmol/L引物 , 10 μL2×Taq
PCRMasterMix(0.1 μLTaqPolymerase, 500
μmol/LdNTPeach, 20 mmol/LTris-HClpH8.3,
100mmol/LKCl, 3 mmol/LMgC12),用灭菌的双
蒸水补充体积至 20 μL。
PCR扩增程序为:94℃变性 5 min;94℃变性
30s, 50℃或 52℃(根据引物而定 ,具体见表 1)退
火 45s, 72℃延伸 1.5 min, 35个循环;72℃延伸 7
min;4℃终止反应。 PCR产物在 2.0%琼脂糖凝
胶上电泳分离 ,核酸染料染色显带 ,多通道分子成
像系统观察并成像。
2　结果与分析
2.1　电子扫描显微镜鉴定
2.1.1　豆荚表皮微形态鉴定　在放大倍数 100
倍时 ,尖叶胡枝子豆荚表面为绒毛状 。叶片黄绿
型尖叶胡枝子豆荚的绒毛分布比较稀疏 ,排列较
931期 杨秀芳等:2个不同类型尖叶胡枝子的微形态和分子标记鉴定
为杂乱无序 ,绒毛先端渐尖 ,且绒毛较短 ,平均为
250μm左右;叶片浓绿型尖叶胡枝子豆荚的绒毛
较密集 ,排列较为整齐一致 ,绒毛先端渐尖 ,且绒
毛较长 ,平均为 500 μm左右(图 1)。
2.1.2　种子表皮微形态鉴定　在放大倍数为
8 000倍以下时 , 尖叶胡枝子种子表面较为光滑 ,
没有看到任何特殊结构。当放大倍数达到 8 000
倍以上时 ,叶片浓绿型和叶片黄绿型尖叶胡枝子
的种子表皮微形态呈现具一定规律脑皱状纹饰但
有细微差别 。叶片黄绿型尖叶胡枝子的脑皱排列
较为紧密且较为规则 ,每个皱褶在 2.5 ～ 3 μm;叶
片浓绿型尖叶胡枝子的脑皱排列较为松散且较为
凌乱 ,每个皱褶在 2.0 ～ 2.5 μm(图 2)。
94 中 国 农 业 科 技 导 报 11卷
2.2　ISSR标记鉴定
应用于检测的 8条引物中 , UBC-880可以独
立区分开 2个不同类型的尖叶胡枝子(图 3),叶
片浓绿型尖叶胡枝子在 500 ～ 600bp之间产生了
1条多态性谱带 ,而叶片黄绿型尖叶胡枝子则没
有该谱带。
图 3　2个不同类型尖叶胡枝子的 ISSR-PCR扩增带谱
Fig.3　ISSR-PCRprofilesoftwodifferent
typesofL.hedysaroides.
M:DNA标准分子量;1:叶片浓绿型尖叶胡枝子;2:叶片黄绿型
尖叶胡枝子
M:DNAmarker;1:L.hedysaroideswithdark-greenleaf;2:L.
hedysaroideswithyellow-greenleaf.
3　讨论
扫描电镜鉴定结果表明豆荚和种皮微形态特
征可作为 2个不同类型尖叶胡枝子的鉴定依据。
Barthlot[ 10]认为在某些分类群中 ,种子表面微形
态特征可以反映生态型的不同 。那么 ,依据种子
表面微形态差异能否将 2个不同类型尖叶胡枝子
确定为两个生态型 ,还有待于进一步研究 。
在 PCR过程中 ,模板浓度 、引物浓度 、Mg2+浓
度 、退火温度 、pH等诸多因素均会影响实验结果。
其中 ,退火温度影响较大 ,同一物种 ,随引物的不
同 ,退火温度亦不一样 ,即使是同一引物 ,对于不
同的物种其退火温度也不尽相同 。一般认为 ,不
论引物的组成如何均可采用 50 ～ 52℃的退火温
度得到好的扩增结果 [ 11 ～ 15] 。本研究中 ,确定以
50℃作 为 引 物 UBC-812、 UBC-824、 UBC-827
和UBC-880的退火温度 ,以 52℃作为其余4种引物
的退火温度 。这与赵杨等胡枝子属 ISSR-PCR优
化体系中所确定的引物退火温度不同 ,但同样取
得了较好的结果 。使用 UBC-880引物可用一步
PCR鉴别两种不同类型尖叶胡枝子 ,说明 ISSR标
记法可为鉴定 2个不同类型尖叶胡枝子提供
DNA分子水平上的依据。
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