全 文 ：收稿日期:2004-09-20
基金项目:内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJ03035);农业部草地资源生态重点开放实验室资助项目(203047)
作者简介:王铁娟(1969-),女 ,河北省任丘市人 ,内蒙古师范大学副教授 ,博士.
褐沙蒿遗传分化的研究
王铁娟1 , 王　静2 , 吴恩岐1
(1.内蒙古师范大学 生命科学与技术学院 ,内蒙古 呼和浩特 010022;
2.内蒙古科技大学 生命科学系 ,内蒙古 包头 014030)
摘　要:采用随机扩增多态性 DNA(RAPD)方法 , 对 5个褐沙蒿(Artemisia intramongolica H.C.Fu)种群的遗传
分化进行了研究.结果表明 , 15个引物共扩增出 283 个位点 , 其中多态位点有 269 个 ,多态位点百分率达95.1%.
各种群的多态位点百分率较高 , 在 84.1%～ 89.0%之间 , 除正镶白旗种群略高外 , 其他均比较接近.各种群间有一
定的遗传分化 , 基因分化系数 Gst=0.120 4 , 表明 87.96%的遗传变异存在于种群内.基因流 N＊m =3.652 4>1 ,说
明褐沙蒿种群间存在着广泛的基因交流.聚类分析显示 , 褐沙蒿种群之间的遗传距离与地理距离有一定的相关
性.
关键词:褐沙蒿;遗传分化;RAPD
中图分类号:Q 347　　文献标识码:A　　文章编号:1001--8735(2004)04--0428--04
褐沙蒿为蒿属龙蒿组的沙生半灌木 ,集中分布于典型草原带的浑善达克沙地中 ,是固定沙丘和沙地的重
要建群植物 ,也是当地防风固沙的重要植物[ 1] .目前对褐沙蒿的研究报道较少 ,主要集中于分类[ 1 ～ 2] 、生境特
征[ 3] 、防风固沙[ 4]等方面.本文利用 RAPD方法对不同地区的褐沙蒿种群进行遗传分化和遗传多样性的研
究 ,为褐沙蒿遗传资源的合理开发与利用提供科学的理论依据.
1　材料和方法
表 1　材料来源
序号 种群代号　 采集地点　 生境
1 HQ 内蒙古镶黄旗 固定沙地
2 BQ 内蒙古正镶白旗 固定沙地
3 DLH 内蒙古克什克腾旗达里湖南 固定沙地
4 DWZH1 内蒙古锡林浩特定位站 固定沙丘
5 DWZH2 内蒙古锡林浩特定位站 固定沙地
1.1　实验材料
供试材料采自内蒙古自治区浑善达克沙地
(见表 1).将采集的植物嫩叶编号 ,装入有封口
的塑料袋加硅胶快速干燥 , 带回实验室后 ,
-20 ℃保存.
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA的提取　采用 CTAB法[ 5]
提取基因组 DNA ,并根据褐沙蒿的特点略作改
动.具体步骤如下:①称取 0.2 g 经硅胶干燥后的植物嫩叶至研钵中 ,加入少许石英砂和 PVP 干粉 ,在液氮
中迅速研磨成粉状 ,置于已灭菌的 7 mL 离心管中;②加2 mL预热至 90 ℃的CTAB提取液(2%(w/v)CTAB ,
1.4mol·L-1NaCl ,0.02mol·L-1EDTA pH=8.0 ,0.1 mol·L-1Tris-HCl pH=8.0 , 2%(v/v)巯基乙醇(使用前加
入)),充分混合后在 65 ℃水浴中浴 60 ～ 90 min ,期间不断颠倒摇匀 ,使其抽提完全;③加 2 mL 氯仿/异戊醇
(24∶1),5 000 g 离心 10 min , 取上清液放入新的灭过菌的 7 mL 试管中;④加 0.6倍体积的-20 ℃异丙醇 ,
摇匀 ,5 000 g离心5min;⑤弃上清液 ,加 1mL 65 ℃的CTAB ,摇匀 ,65 ℃水浴30 min ,使沉淀溶解;⑥加等体
积氯仿/异戊醇 ,再抽提一次 ,5 000 g 离心10 min;⑦取上清液到 1.5 mL的 Eppendorf管中 ,加 2/3体积-20
℃的异丙醇 ,混匀 ,静置 5 min;⑧200 r/ s离心 5min ,弃上清液;⑨用 76%冷乙醇冲洗 2次后风干;⑩依据
DNA的量 ,加 100 ～ 300μL 0.1TE缓冲液回溶.0.7%琼脂糖凝胶电泳检测各模板有无降解 ,并估计模板 DNA
第 33 卷 第 4期
2004 年 12 月
内蒙古师范大学学报 自然科学(汉文)版
Journal of Inner Mongolia Normal University(Natural Science Edition)
Vol.33 No.4
Dec.2004
的大致含量 ,调整各模板浓度至基本一致 ,合格样品用0.1×TE 稀释至 4 ng ·μL-1.
表 2　各引物对褐沙蒿扩增的结果
引物　 序列　 位点数 多态位点数 多态位点百分率(%)
S3 CATCCCCCTG 9 7 77.8
S8 GTCCACACGG 23 22 95.7
S12 CCTTGACGCA 17 17 100.0
S19 ACCCCCGAAG 20 19 95.0
S49 CTCTGGAGAC 24 24 100.0
S52 CACCGTATCC 19 17 89.4
S73 AAGCCTCGTC 25 25 100.0
S77 TTCCCCCCAG 18 17 94.4
S91 TGCCCGTCGT 25 24 96.0
S127 CCGATATCCCC 12 12 100.0
S156 GGTGACTGTG 15 13 86.7
S343 TCTCCGCTTG 14 14 100.0
S441 GGCACGTAAG 25 25 100.0
S452 CAGTGCTGTG 21 20 95.2
S453 GTCAGAGTCC 16 13 81.3
合计 283 269 95.1
1.2.2　引物筛选与扩增　采用上海生物工程
公司合成的 10碱基引物共 140个进行筛选 ,选
出能够扩增出稳定 、清晰 、可重复产物的 15 个
引物(引物序列见表 2),用于各种群样品的扩
增.反应体系总体积 25 μL ,其中含 5 μL 模板
(20 ng), 2 μL 0.025 mol·L-1MgCl2 , 2.5 μL PCR
10×buffer , 0.25 μL 0.01 mol·L-1dNTP , 0.2μL
(5u·μL-1)Taq酶 , 1μL (0.32×10-6 mol·L-1)
引物.扩增反应在 PTC-100TM 型 PCR 仪上进
行.扩增程序为:94 ℃预变性 3 min , 94 ℃变性
1 min , 37 ℃退火1 min , 72 ℃延伸 1.5 min , 进
行45个循环 , 72 ℃补平 5 min ,4 ℃保温.
1.2.3　扩增产物的检测 　扩增产物经1.5%
的琼脂糖凝胶电泳(含 EB 0.5 μg·mol-1)分离 ,
稳压 100 V 2.5 h ,用λDNA/EcoRⅠ +Hind Ⅲ为
分子量标记 ,电泳结果经紫外凝胶成像仪成像
拍照.
1.2.4　数据处理　RAPD为显性标记 ,同一引
物的扩增产物在电泳中迁移率相同的条带被认
为是同源性的 ,属于同一位点的条带按清晰可
见的强带或反复出现的弱带记为 1 ,无带记为 0 ,形成二元数据矩阵.使用 Popgen 32软件进行数据处理.计算
出褐沙蒿各种群的多态位点数(P)及其百分比[ 6] ,香农多样性指数(I＊)[ 7] ,基因多样度(H)[ 8] ,基因分化系
数(Gst),基因流(N＊m),各种群遗传一致度(I)和遗传距离(D)[ 9] .用 UPGMA法得到褐沙蒿种群聚类分析树
状图.
2　结果与分析
2.1　RAPD产物的多态性
通过 15个随机引物对褐沙蒿 5个种群 40个个体的 DNA样品进行 RAPD分析 , 扩增带清晰且稳定(见
图1),每个引物所得位点数 9 ～ 25不等 ,平均每个引物为 18.9个.15个引物共检测到 283个位点 ,其中多态
位点有269个 ,多态位点百分率达 95.1%(见表 2).
图 1　用引物S77扩增产生的 RAPD带型
左图:1～ 10 正镶白旗种群　　11～ 20 镶黄旗种群
右图:1～ 6 锡林浩特种群　　1 , 7～ 12 锡林浩特种群　　2 , 13～ 20 达里湖种群
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2.2　种群内遗传多样性
褐沙蒿各种群多态位点百分率较高 ,在 84.1%～ 89.0%之间 ,除正镶白旗种群略高外 ,其他均比较接近 ,
大小顺序为:BQ>DWZH2>DLH>HQ>DWZH1.香农多样性指数的结果不同 ,大小顺序为:BQ>HQ>DWZH1
>DLH>DWZH2 ,各种群在 0.194 3 ～ 0.234 6之间.而按Nei基因多样度计算的结果 ,大小顺序为:BQ>HQ>
DWZH1>DWZH2>DLH ,与香农多样性指数的结果相比 ,最后两个交换了位置(见表 3).
表 3　褐沙蒿种群 RAPD分析的遗传多态性
种群　 样本数 位点数 多 态位点数 多态位点百分率(%) 香农多样性指数(I＊)Nei 基因多样度(H)
HQ 10 182 156 85.7 0.210 3 0.129 1
BQ 10 200 178 89.0 0.234 6 0.143 3
DLH 8 171 147 86.0 0.195 1 0.118 8
DWZH1 6 157 132 84.1 0.199 7 0.125 2
DWZH2 6 141 122 86.5 0.194 3 0.123 5
物种水平 40 283 269 95.1 0.254 0 0.146 0
表 4　褐沙蒿 5 个种群间的遗传分化(由 Nei指数估算)
引物 总的基因多样性(Ht) 种群内的基因多样性(Hs) 种群间遗传分化(Gst) 基因流(N ＊m)
S3 0.097 9 0.089 1 0.090 2 5.044 8
S8 0.195 6 0.171 3 0.124 3 3.522 1
S12 0.133 3 0.106 0 0.204 9 1.939 9
S19 0.178 3 0.161 0 0.097 0 4.657 2
S49 0.041 3 0.140 0 0.080 7 5.696 9
S52 0.078 0 0.069 7 0.105 6 4.233 1
S73 0.202 6 0.172 9 0.146 6 2.910 0
S77 0.123 8 0.122 0 0.088 1 5.173 0
S91 0.117 2 0.101 9 0.130 4 3.334 6
S127 0.113 8 0.097 0 0.148 0 2.878 6
S156 0.168 0 0.134 3 0.200 4 1.994 9
S343 0.140 2 0.123 4 0.120 2 3.659 3
S441 0.120 8 0.108 2 0.103 9 4.310 3
S452 0.154 9 0.146 3 0.055 1 8.578 1
S453 0.144 5 0.126 3 0.125 5 3.485 2
平均 0.145 5 0.128 0 0.120 4 3.652 4
2.3　褐沙蒿种群遗传分化程度和基因流
褐沙蒿 5 个种群间的遗传分化见
表4.由表 4可知 , 根据 Nei指数 ,5 个褐
沙蒿种群总的遗传多样度 为 Ht =
0.145 5 ,其中种群内的遗传多样度为
Hs=0.128 0 ,种群间的遗传多样度为
Dst=0.017 5.各种群间有一定的遗传变
异 , 基因分化系数 Gst=0.120 4 , 即种群
间的遗传变异占种群总的遗传变异的
12.04%,87.96%的遗传变异存在于各种
群内.根据褐沙蒿种群间的遗传分化系数
计算的基因流N＊m =3.652 4>1 ,说明褐
沙蒿种群间存在着广泛的基因交流.
2.4　种群间的遗传一致度和遗传距离
褐沙蒿各种群的遗传距离较小 , 其
中 ,镶黄旗(HQ)与正镶白旗(BQ)种群的
遗传距离最小 D =0.017 8 ,达里湖(DLH)
与定位站种群 1(DWZH1)之间的遗传距
离最大 D=0.031 2.从遗传一致度看 ,各
种群的遗传一致度很高(0.969 3 ～ 0.982
4),反映出连续分布的种群间有着较小的
遗传分化特点(见表 5).
聚类分析(见图 2)显示 ,镶黄旗种群
和正镶白旗种群被首先聚到一起 ,它们再
与达里湖种群聚到一起;定位站的两个
种群聚到了一起.这表明褐沙蒿种群的遗
传分化与地理距离有一定的相关性.
3　讨论
分析结果表明 ,褐沙蒿具有高的遗传多样性.分布区南部的正镶白旗种群和镶黄旗种群的香农多样性指
·430·　　　 内蒙古师范大学学报 自然科学(汉文)版 第 33 卷　
数和Nei基因多样度略高于北部的 3个种群.
在中国科学院内蒙古草原生态系统定位研究站北部的沙地上 ,我们发现 ,在固定沙丘顶部的褐沙蒿花序
卵形 , 已开始结实 ,一些小花还留有花瓣(DWZH1).但沙丘底部 、围栏附近的沙蒿还处于花期 , 花序圆形
(DWZH2).由于花序是卵形还是圆形是区别褐沙蒿与另一个种蒙古沙地蒿的重要性状 ,于是我们把两种类型
都取了样 ,以便检测它们的差异.从遗传多样性水平来看 ,两者差异不大(表 3),从遗传距离来看(表 5),它们
间的遗传距离(0.024 3)大于正镶白旗种群和镶黄旗种群间的遗传距离(0.017 8),但在各种群两两间的比较
中仍是小的.这说明它们之间亲缘关系很近 ,但有一定的分化.从聚类分析看(图 2),镶黄旗种群和正镶白旗
种群被首先聚到一起 ,它们再与达里湖种群聚到一起 ,然后与定位站的两个种群聚到一起.地理距离近的被
聚到了一起 ,反映出褐沙蒿种群的遗传分化与地理距离有一定的相关性.但是 ,定位站的两个种群的地理距
离最近 ,但没有首先相聚 ,表明它们之间有一定的分化 ,这种分化在形态上也表现了出来 ,即花序卵形与圆
形.那么 ,这是不同物种的差异还是同一种内种群的差异呢 ?
头状花序的形状是蒿属龙蒿组分类上的一个重要性状 ,野外观察结果显示 ,褐沙蒿及其近缘种的花序在
花蕾时均为球形 ,一直保持到花初开时;当花完全开放 ,则变为卵球形 ,先端平截;花后期先端向回收缩 ,变
尖 ,成为卵形;果期时 ,则为典型的卵形或长卵形.有的在同一植株中就可以看到这种变化 ,既有球形的又有
卵形的 ,如马春明 锡-08(锡林浩特市)、王铁娟 锡-12(锡林浩特市)、马春明-13(镶黄旗).这样 ,取自不同
时期的标本就容易被看作是不同形状的花序 ,从而出现鉴定上的问题.如关于蒙古沙地蒿(A.klementze
Krasch)的鉴定 ,富象乾于1982年发表了褐沙蒿的变种———小叶褐沙蒿(A.intramonglica H.C.Fu var.micro-
phylla H.C.Fu), 但在《内蒙古植物志》第二版中将其归并到蒙古沙地蒿 ,说明褐沙蒿与蒙古沙地蒿在鉴定
上存在一些混淆.根据《中国植物志》和《内蒙古植物志》描述 ,蒙古沙地蒿与褐沙蒿的主要区别是头状花序圆
形 ,叶纸质.但据《蒙古微管束植物检索表》[ 10]记载 ,蒙古沙地蒿的头状花序为卵形或长圆形.我们在中科院
植物所标本馆只见到一份蒙古沙地蒿的标本 ,是 1896年的 ,为俄文手写体记录 ,采集地看不清 ,但花序是卵
形的 ,且为多年生草本 ,与褐沙蒿有一定的差别.这就是说两个种的差异并不是花序圆形或卵形 ,仅以花序为
圆形就定为蒙古沙地蒿是不正确的.
我们在对中国北部 6种沙蒿进行的亲缘关系研究中 ,每个种均以种群为单位进行采样 ,用 RAPD方法进
行分析 ,结果显示 ,同一个种的不同种群均能聚在一起 ,不存在种间的混杂现象(另文发表).虽然褐沙蒿定位
站的两个种群的花序一为卵形 ,一为圆形 ,但它们仍然聚到一起 ,而且遗传距离很小 ,说明圆形花序的种群仍
是褐沙蒿 ,只是与其他种群所处的花期不同而已 ,这种差异的产生可能是生境不同产生的种群间的遗传分
化.对于蒙古沙地蒿在内蒙古境内的分布则需做进一步的研究.
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(下转第 436页)
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Females total length 5.40 ～ 6.03.Male total length 3.69 ～ 4.32.Examing specimen:36♀30♂, Ar Horqin Ban-
ner , Chifeng City , Inner Mongolia , China , 27 , July.1998 , coll.Tang Gui-Ming.
③Thanatus neimongol Urita &Song , 1987(Female , new discovery).Thanatus neimongol Urita &Song , 1987:
35 , fig.17;Song , Zhu &Chen , 1999:478 , fig.273K.
Males total length 4.10 ～ 5.71.Female total length 7.75.cephalothorax 2.70 long , cephalothorax 2.40 wide , ab-
domen 5.05 long , abdomen 3.60 wide.Examing specimen:1♀2♂, Helan mountain , Alxa League , Inner Mongolia , 14
Augue.1996 , coll.Tang Gui-ming;2♂1♀,12 May , 1992 , cool.Zhao Yong-wen;1♂,Daqing mountain , Huhhot ,
Inner Mongolia , 19 , May 1984.coll.Urita.
Key words:Inner Mongolia;spider;new species;male or female new discovery;Araneae.
【责任编辑 金淑兰】
(上接第 431页)
STUDY ON GENETIC DIFFERENTIATION
OF ARTEMISIA INTRAMONGOLICA
WANG Tie-juan1 , WANG Jing2 , WU En-qi1
(1.College of Life Sciences and Technology , Inner Mongolia Normal University , Huhhot 010022 , China;
`2.Department of Life Sciences , Inner Mongolia Science and Technology University , Baotou 014030 , China)
Abstract:Genetic differentiation of Artemisia intramongolica are analyzed by using random amplified polymorphic
DNA(RAPD)markers.A total of 283 loci are obtained from 15 random primers , among which 269 loci are polymorphic.
In species level , the percentage of polymorphic loci is 95.1%.Which is high too in populations ,being 84.1%～ 89.
0%, and the differences of their value are small except zhengxiangbaiqi population.There are genetic differentiation a-
mong populations , Gst is 0.120 4 ,which shows that 87.96%of variations existed within the populations.Gene flow is 3.
652 4>1 , it revealed there are widely gene flows among populations.The cluster analysis demonstrats that the genetic
differentiation among populations of A.intramongolica is correlated with geographic distance.
Key words:Artemisia intramongolica;genetic differentiation;RAPD
【责任编辑 金淑兰】
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