全 文 ：第 24 卷第 4期
2007 年 7月
中 国科学院 研究生院 学报
Journal of the Graduate School of the Chinese Academy of Sciences
Vol.24
July
　No.4
2007
＊国家自然科学基金资助项目(30370128 , 30570146)
通讯联系人.E-mail:tychai@gucas.ac.cn
文章编号:1002-1175(2007)04-0465-08
Zn Cd超富集植物天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)中
TcCaM2基因的克隆及在酵母中的重金属耐受性分析＊
韩　璐　魏　嵬　官子楸　徐　进　柴团耀
(中国科学院研究生院生物系 , 北京 100049)
(2007年 1月 8日收稿;2007年 3月 19日收修改稿)
Han L, Wei W , Guan ZQ , et al.A novel CAM gene from heavy metals hyperaccumulator(Thlaspi caerulescens)L.and
functional analysis in yeast.Journal of the Graduate School of the Chinese Academy of Sciences , 2007 , 24(4):465～ 472
摘　要　从重金属超富集植物天蓝遏蓝菜(T.caerulescens)Cd胁迫的 cDNA 文库中 ,通过基因
表达的差异筛选得到的阳性克隆之一 ,核苷酸序列分析表明 ,与拟南芥 CaM2的相似性高达
92%,故命名为 TcCaM2(T .caerulescens CaM2 , GenBank No.EF053035).其核苷酸序列与迄今已
知的钙调蛋白基因同源率在 83%以上;其氨基酸序列同源性高达 95%以上;与大多数高等植
物的 CaM ,如印度芥菜 、拟南芥 、水稻等同源性则更高.将 TcCaM2基因置于酵母表达启动子之
下 ,构建酵母表达载体 ,并将其转入重金属敏感型酵母突变菌株 ,酵母重金属耐受性实验表明 ,
TcCaM2在酵母中的过量表达提高了酵母对 Co2+或Ni2+的耐受性 ,增加了对 Cd2+的敏感性 ,对
Zn
2+胁迫抗性稍有增加但差异不显著.说明 TcCaM2通过其对重金属离子的结合作用及在信
号转导系统中的功能 ,在植物细胞对重金属的富集 、耐性中发挥了重要的调节作用.
关键词　TcCaM2 ,重金属 ,钙调蛋白(CaM),天蓝遏蓝菜 ,酵母
中图分类号　Q943.2
钙调蛋白(Calmodulin ,简称CaM)是广泛存在于高等动植物中一类结构高度保守的蛋白.作为 Ca2+
受体 ,在 Ca2+信号系统转导中起着关键的作用 ,它通过和Ca2+结合而激活一系列靶酶和非酶蛋白质 ,从
而调控细胞正常的生理代谢 、基因表达及对外界环境变化的响应[ 1 , 2] .Ca2+-CaM信号转导系统在植物对
环境刺激的感受 、转导和响应过程中起重要作用 ,许多环境刺激信号(如光 、风 、触摸 、干旱 、高盐 、低温 、
氧化及机械伤害)都能诱导CaM或 CaM相关基因的表达[ 3] .已有研究表明钙调蛋白与应答环境压力有
关 ,一些学者认为 ,钙调蛋白和其相关蛋白结合在植物抗盐 、抗脱水 、维持离子平衡等方面起着重要的作
用[ 4 ,5] .
目前土壤中重金属(Hg 、Cd 、As 、Cu 和 Al)污染日益严重 ,重金属污染治理迫在眉睫 ,利用能在高浓
度重金属环境中生长且能超累积重金属的植物对污染土壤进行修复的植物修复技术具有广泛的应用前
景.对超富集植物的重金属耐性和超富集机制研究 ,可进一步提高植物耐性 ,使其免受重金属毒害;同时
对于生产绿色食品 、治理环境污染和保护生态环境有重要意义[ 6 ～ 8] .
国内外对重金属超富集植物吸收 、运输 、储存及忍耐重金属的机制虽已取得一定进展 ,但在重金属
胁迫下植物传递外界信号方面的研究尚不多见 ,已有一些研究发现环境刺激与 Ca2+-CaM 系统有关[ 9] .
众多关于 Ca2+-CaM 信号转导系统在植物对环境刺激的研究中 ,植物在重金属胁迫下 ,CaM或 CaM 相关
基因的表达和 Ca2+-CaM 信号系统的作用不甚清楚 ,CaM 在植物忍耐重金属毒害方面的作用存在争议.
Arazi等的研究表明钙调蛋白与植物细胞膜上的离子通道蛋白结合 ,从而使植物表现出对 Ni2+的耐性 ,
并增强细胞积累 Pb2+的能力[ 10, 11] ;Jorge 等则认为钙调蛋白在玉米对铝的耐性中不起作用[ 12] ;另一些学
者的研究表明 ,CaM由于其特殊的结构能够和多种与Ca2+半径相近的金属离子 ,尤其是稀土离子结合 ,
从而增强了对某些金属离子的积累并产生细胞毒性 ,而 CaM的拮抗剂则降低这种毒性[ 13 ～ 15] .
天蓝遏蓝菜(T .caerulescens)是一种 Zn Cd 超富集植物 , Zn 累积量达 39600mg kg , Cd 累积量达
1800mg kg ,远远超出其他普通植物所能忍受的极限 ,然而其重金属超富集 、耐性机制仍然不清楚.为了
分离鉴定重金属胁迫响应基因 ,我们构建了 Cd 胁迫条件下天蓝遏蓝菜幼苗的 cDNA文库 ,通过差别筛
选 ,获得了 Cd胁迫下一个特异性表达的钙调蛋白 TcCaM2全长 cDNA片段 ,利用酵母功能互补试验对该
基因的功能进行了初步分析 ,并试图从钙调蛋白本身的作用以及信号转导途径为揭示植物富集重金属
的机理提供理论参考 ,这对于揭示钙信使系统在植物对逆境胁迫下的调节作用同样具有重要意义.
1　材料和方法
1.1　材料
天蓝遏蓝菜种子由 Dr.Mark G.M.Aarts 馈赠(Laboratory of Genetics , Plant Science Department ,
Wageningen University , The Netherlands);酵母菌株 YK44(ura3-52 his3-200 , ΔZRC , ΔCot1 , mating typeα)为
Zn Cd Ni Co敏感型 ,受赠于德国 Martin-Luther 大学微生物系的 Dietrich H.Nies 教授;克隆载体为
Promega公司的 pGEM-T Easy Vector(cat.A170);穿梭表达载体 pYES2带有 GAL1启动子 ,用于在酵母中
高效表达 TcCaM2.
1.2　方法
1.2.1　TcCaM2基因的克隆 、序列测定及同源性分析
以重金属镉(CdCl2)胁迫处理天蓝遏蓝菜为材料;应用 Stratagene 公司的 pBluescript® Ⅱ XR Library
Construction Kit构建 Cd2+胁迫的天蓝遏蓝菜 cDNA文库由本实验室保存;尼龙膜和地高辛标记与检测试
剂盒购自 Roche公司.文库菌体稀释适当浓度培养 、菌斑影印到尼龙膜以及随后的变性及固定处理参见
分子克隆第 3版并做适当调整;通过热酚法提取正常及 Cd2+胁迫下天蓝遏蓝菜的 mRNA ,反转录成
cDNA标记探针 ,尼龙膜与地高辛标记探针的杂交及显色按照地高辛标记与检测试剂盒说明书进行.对
文库差别筛选得到的阳性克隆进行 DNA序列分析 ,在 NCBI(www.ncbi.hlm.nih.gov BLAST)核酸数据库
中进行同源核苷酸检索 ,并进行蛋白质同源性比较 ,通过Treeview 进行系统进化树分析.
测序及引物合成工作由上海生工公司完成.
1.2.2　酵母菌株 、质粒及酵母表达载体构建
以Kpn Ⅰ BamH Ⅰ为酶切位点设计引物 ,构建 pYES2-TcCaM2穿梭表达载体.
　　　　　　　　　Kpn Ⅰ
5′端引物:5′-TCT GGTACC ATGGCGGATCAGCTC-3′
3′端引物:5′-TTT GGATCC CTTGGCCATCATAACC-3′
　　　　　　　　BamH Ⅰ
采用醋酸锂法[ 17] 转化酵母菌株 YK44 ,通过尿嘧啶营养缺陷培养基筛选阳性克隆 ,并通过菌落 PCR
进行鉴定.
YPD培养基:1%酵母浸提液 ,2%蛋白胨 , 2%葡萄糖 , pH 5.8.继代用培养基为 SD-ura(2%葡萄糖 ,
尿嘧啶缺陷型培养基),参见分子克隆第 3版附录.诱导表达培养基为 SD-ura(2%半乳糖代替葡萄糖),
胁迫处理加相应浓度重金属.
1.2.3　酵母重金属耐受实验
(1)YK44-pYES 2 、YK44-pYES2-TcCaM2在SD-ura培养基中培养生长 1d ,OD600达到0.2左右 , 100μL 培
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养物接种到10mL SD-ura(2%半乳糖)+CdCl2(0.01 ～ 0.05mmol L)系列浓度 ,SD-ura(2%半乳糖)+NiCl2
(0.3 ～ 1.5mmol L)系列浓度 , SD-ura(2%半乳糖)+ZnCl2(0.04 ～ 0.2mmol L)系列浓度 , SD-ura(2%半乳
糖)+CoCl2(0.1 ～ 0.5mmol L)系列浓度培养基中 ,30℃,250r min ,培养 36h后测定 600nm 吸光值.每项实
验都设3个重复(挑取 3个酵母阳性克隆),取平均值并计算标准误差.
(2)YK44-pYES2 、YK44-pYES2-TcCaM2在SD-ura培养基中培养生长 1d ,OD600达到 0.6左右 ,并稀释
成10-1 ,10-2 ,10-3 , 10-4 4个梯度 ,取 2μL 分别接种于固体培养基 SD-ura(2%半乳糖),SD-ura(2%半乳
糖)+CdCl2(0.04mmol L), SD-ura(2%半乳糖)+ZnCl2(0.1mmol L), SD-ura(2%半乳糖)+NiCl2(1.0
mmol L),SD-ura(2%半乳糖)+CoCl2(0.2mmol L),30℃,倒置培养 72h ,观察酵母菌生长情况.
2　结果和分析
2.1　遏蓝菜钙调蛋白基因 TcCaM2的序列测定及相似性分析
图 1　天蓝遏蓝菜钙调蛋白基因 TcCaM2 cDNA
序列及编码蛋白
　
通过对文库的差异筛选 ,分离出的 cDNA克隆
之一(图 1),DNA序列测定表明 ,该片段长 689bp ,
其核苷酸序列与拟南芥 CaM2的相似性高达 92%,
故命名为 TcCaM2(T .caerulescens CaM , GenBank
No.EF053035).经 DNAman软件分析 ,证明该序列
编码了一个完整的读码框 , 含有一个 447bp 的
ORF ,编码一个由 149个氨基酸组成的蛋白质 ,分
子量 16.93ku.钙调蛋白在生物体的生命活动中起
重要作用 ,其活性部位的突变常常是致死的 ,因此
其结构和功能非常保守.将 TcCaM2编码区序列经
GenBank Blast 比对后 , 发现与大多数高等植物
CaM ,如印度芥菜 、拟南芥 、水稻等同源性都很高 ,
大于 90%.其编码蛋白质一级序列更显示了其蛋
白质的保守性 ,大于 98%.ClustalW分析(图 2)显示
该蛋白质与拟南芥 AtCaM2和甘蓝 BoCaM2编码的
蛋白质只在 118 位氨基酸不同 ,与水稻的 OsCaM2
则只有3个氨基酸的差别.几种钙调蛋白的系统进化关系如图 3所示 , TcCaM2位于一个独立的分支上.
2.2　pYES2-TcCaM2表达载体的构建 、酵母转化及阳性克隆的筛选
为了进一步研究 TcCaM2 在重金属胁迫下的作用 ,将 TcCaM2 经 Kpn Ⅰ BamH Ⅰ双酶切后 ,插入
pYES2的 PGAL1之后 ,构建了酵母表达载体 pYES2-TcCaM2 ,转化酵母.pYES2是一种高拷贝的适用于酵母
的穿梭表达载体 ,带有氨卞抗性基因 ,含有半乳糖诱导型启动子GAL1及酵母 CYC1终止子.通过PCR分
析筛选得到含有 TcCaM2阳性克隆 ,提取的质粒DNA经双酶切后 ,5.9kb的 pYES2片段和450bp TcCaM2
片段清晰可见(图 4),表明 pYES2-TcCaM2表达载体构建成功.
将 pYES2-TcCaM2转化Zn Cd Ni Co敏感型酵母菌株 YK44 ,通过尿嘧啶营养缺陷型筛选和 PCR鉴
定 ,得到含有 TcCaM2的 YK44转化酵母(图5).
2.3　转 TcCaM2基因酵母重金属耐性分析
以转空载体 pYES2的酵母为对照 ,分别用不同浓度的CoCl2 、NiCl2 、ZnCl2或 CdCl2 胁迫处理 TcCaM2
转化酵母.结果表明 ,在半乳糖诱导下 , TcCaM2转化酵母在 SD-ura培养基中生长量稍低于对照(转空载
体pYES2),在 CoCl2 或NiCl2胁迫下 ,低浓度时转 TcCaM2 酵母与对照差异不明显 ,但当胁迫浓度提高
后 ,转基因酵母生长量的下降程度明显滞后于对照 ,说明 TcCaM2 的过量表达提高了酵母细胞对 Ni2+ 、
Co
2+的抗性;ZnCl2 系列浓度胁迫下 , TcCaM2转化酵母生长量稍高于对照 ,但与 SD-ura 培养基中的对照
467　第 4 期 韩　璐 ,等:Zn Cd 超富集植物天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)中 TcCaM2基因的克隆及在酵母中的… 　　 　
该图由ClustalW软件完成.
图 2　遏蓝菜 TcCaM2基因编码的氨基酸序列与其他植物 CaM基因编码氨基酸序列比较
　
AtCaM1(NM123137)、AtCaM2(AY065179)、AtCaM3(AY091301)、AtCaM4(NM105312)、AtCaM5(BT002351)、AtCaM7(AK227078)、AtCML26
(NM106021)均来自拟南芥;OsCaM(AF441190)、OsCaM2(AF042839)来自水稻;BjCaM(M88307)来自印度芥菜;BoCaM1(AJ427337)、
BoCaM2(AJ427338)来自甘蓝;PmCaM2(AJ843115)来自车前草;Bcm1(U10150)来自欧洲油菜.该图由TreeView软件完成.
图 3　钙调蛋白质序列系统进化树
　
相比差异不显著;CdCl2系列浓度胁迫下 ,转 TcCaM2的酵母生长量明显低于对照 ,说明 TcCaM2的过量
表达增加了细胞对 Cd2+的敏感性 ,结果如图6所示.
1:pYES2-TcCaM2的酶切结果;2:Marker
图 4　pYES2-TcCaM2表达载体
双酶切电泳图　
1 、9:Marker DL1500;2:阳性质粒;
3:YK44菌株阴性对照;4～ 8:5个阳性克隆.
图 5　转化酵母的 PCR鉴定　
468 中国科学院研究生院学报 第 24 卷
图中所示数据是 3个重复的平均值并计算标准误差 ,每组数据中不同字母表示差异显著(P≤0.05 , n=3).
图 6　高效诱导表达 TcCaM2基因酵母在不同浓度重金属液体培养基中的生长状况分析
　
　　为了进一步鉴定 TcCaM2在重金属胁迫下的作用 ,分析了 TcCaM2转化酵母在固体培养基上的生长
状况.设置的重金属浓度为:SD-ura(2%半乳糖),SD-ura(2%半乳糖)+CdCl2(0.04mmol L),SD-ura(2%半
乳糖)+ZnCl2(0.1mmol L), SD-ura(2%半乳糖)+NiCl2(1.0mmol L), SD-ura(2%半乳糖)+CoCl2
(0.2mmol L)的固体培养基 ,通过酵母生长状况的对比 ,结果表明在重金属胁迫下对照和转基因酵母都
较正常生长条件下生长缓慢 ,在Ni2+ 、Co2+的胁迫下转基因酵母生长状况明显强于对照 ,而Cd2+胁迫下
转基因酵母生长状况滞后于对照 ,在 Zn2+的胁迫下转基因酵母生长状况稍强于对照.更加直观的证明 ,
TcCaM2基因提高了细胞对Ni2+ 、Co2+的抗性 ,增加了细胞对 Cd2+的敏感性 ,而在 Zn2+的胁迫下差别不
显著.结果如图 7所示.
图 7　高效诱导表达 TcCaM2基因酵母在 4 种重金属胁迫下固体培养基上的生长状况分析
　
3　讨论
通过对Zn Cd超富集植物遏蓝菜属的 Thlaspi caerulescens Cd2+胁迫条件下 cDNA 文库进行差别筛
469　第 4 期 韩　璐 ,等:Zn Cd 超富集植物天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)中 TcCaM2基因的克隆及在酵母中的… 　　 　
选 ,希望分离到 Cd2+胁迫下特异性响应的基因.获得的一个 cDNA片段与核酸数据库中编码钙调蛋白基
因序列高度同源 ,将其命名为 TcCaM2.本研究证实了在 Cd2+胁迫下 , TcCaM2基因表达量上升 ,说明了
植物在重金属毒害的逆境下 ,CaM发挥了其重要的调节作用以抵御这种胁迫所造成的细胞伤害 ,以维持
植物正常的新陈代谢.这对于钙调蛋白在植物重金属胁迫下特异性响应的作用 、植物忍耐重金属毒害过
程中以及植物对重金属的抗性和累积中钙调蛋白作用的研究具有重要意义;同时证明了Ca2+-CaM 信号
转导系统在植物耐重金属和解毒过程中起着积极作用.
钙调蛋白在结构上非常保守 ,本研究通过差别筛选所得到的钙调蛋白 TcCaM2与印度芥菜 、拟南
芥 、水稻等钙调蛋白的蛋白质相似性达 98%以上 ,更说明这一点.虽然 TcCaM2与 CaM家族其他成员同
源性很高 ,但系统进化分析表明其位于一个独立的分支上 ,预示着 TcCaM2可能存在着与其家族其他成
员不尽相同的功能.CaM 是一种小分子量单链可溶性球蛋白 ,有4个 EF 臂 ,能结合 4个 Ca2+ ,由于钙调
蛋白特殊的结构及其在信号转导中的作用 ,使其在植物对外界环境刺激的反应中发挥着重要作用[ 18] .
目前有关钙调蛋白在植物忍耐重金属毒害方面的机制存在争议 ,但是研究表明钙调蛋白可能是通
过几个方面的共同作用从而使植物表现出对重金属离子的反应.通过在酵母中过表达 TcCaM2基因 ,检
测酵母在胁迫条件下的生长状况 ,有助于深入了解基因的功能.重金属敏感型酵母突变菌株的耐受实验
表明 ,转 TcCaM2基因的酵母细胞对Ni2+ 、Co2+的抗性增加 ,对Cd2+的敏感性增强 ,对Zn2+的胁迫抗性增
加但表现不显著.这其中过表达的钙调蛋白通过多方面发挥其调节作用 ,产生这种结果的原因可能有以
下几个方面.
首先 ,由于 CaM 结构的特殊性 ,可直接和金属离子相互作用 ,离子半径在(0.1±0.02)nm 范围内的 2
价或 3价金属阳离子都和 CaM 有一定的结合能力.钙调蛋白成为许多微量元素毒性作用的位点 ,当它
们与钙调蛋白作用之后 ,或模拟Ca2+-CaM 中的 Ca2+离子的活性效应与 Ca2+竞争结合 ,或通过与辅助位
点结合对CaM 产生毒性作用 ,或通过与CaM的结合在细胞内累积.研究表明 ,与Ca2+相差很大的金属如
K
+ 、Na+ 、Be2+ 、Ba2+ 、Cu2+ 、Co2+ 、Ni2+与 CaM的作用或很弱或几乎无作用;与 Ca2+相近的离子如 Sr2+ 、
Mn
2+ 、Cd2+与 CaM 的作用力较强;而介于两者之间的离子如 Al3+ 、Mg2+ 、Zn2+与 CaM 的作用相对较
弱[ 13 , 19, 20] .由于 Co2+ 、Ni2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 4 种金属离子的半径不同 ,其中 Co2+ 、Ni2+与 CaM 几乎无作用 ,
Zn
2+的作用较弱 ,Cd2+与 CaM有较强的作用 ,能够代替 Ca2+与 CaM 结合激活下游的靶酶从而产生细胞
毒性 ,同时 Cd2+-CaM能够在细胞内形成沉淀 ,从而造成细胞内 Cd2+的积累 ,加入 CaM 的拮抗剂能降低
Cd
2+在细胞内的积累 ,防止镉的毒性 ,这充分证明 CaM 与 Cd2+的结合是细胞 Cd2+中毒的一个重要原
因[ 25 , 26] .TcCaM2通过这种结合作用造成酵母细胞的 Cd2+中毒 ,从而使转基因酵母对 Cd2+的敏感性增
强;同时 ,在重金属超富集植物天蓝遏蓝菜中 ,CaM 与Cd2+的这种结合作用可能是其 Cd2+富集的一个重
要原因 ,而该植物中存在其特殊的解毒机制使其对 Cd2+富集而不表现中毒.
其次 ,CaM可以通过和细胞膜上的离子通道蛋白 、离子转运蛋白 ,还有其他一些膜蛋白相互作用 ,直
接影响金属离子的输入和输出[ 2] .Arazi等的研究表明 ,烟草中一种 CaM结合蛋白 NtCPB4的过量表达明
显增强烟草对Ni2+的抗性并减少细胞内的累积作用 ,对 Pb2+的敏感性增强 ,细胞内 Pb2+浓度也大幅度
提高[ 10] .Kohler等从拟南芥中克隆得到一个家族的环核苷酸门控离子通道(CNG)蛋白基因 ,该通道是非
选择性的阳离子通道 ,其蛋白质序列中有一段 CaM特异性结合位点 ,并证明 CaM 通过这种结合对 K+的
运输起作用[ 11] .由于 Co2+ 、Ni2+ 、Zn2+都是动植物必需的重金属微量元素 ,酵母细胞膜上存在这些离子
运输的特殊离子通道 ,有些离子通道蛋白上有 CaM结合位点 , TcCaM2可能通过这种结合改变通道蛋白
的构象从而抑制了这些离子的过量进入 ,进而表现为转基因酵母对 Ni2+ 、Co2+ 、Zn2+的抗性增加;而
Cd
2+是生物非必需的且毒性较大的重金属离子 ,酵母细胞膜上没有专门的 Cd2+离子通道 ,它可能通过
一些非选择性的离子通道进入细胞内 ,通过与 Ca2+竞争结合 CaM而在细胞内形成沉淀造成细胞毒性.
除了直接作用于金属离子和细胞膜上的蛋白 ,CaM 更重要的功能表现在其间接作用上.一方面 ,
Ca
2+-CaM 系统发挥其信号转导功能 ,通过作用于 Ca2+-CaM依赖性蛋白激酶(Ca2+-CaM-PKs),如NAD激
酶 、PDE 、Ca2+-ATPase 、CaM 激酶等 ,进而磷酸化多种蛋白质和酶.蛋白质磷酸化和脱磷酸化涉及所有的
470 中国科学院研究生院学报 第 24 卷
生物过程 ,活化了的 CaMK通过磷酸化作用 ,促使植物产生一系列复杂的生理生化反应抵御环境胁迫对
细胞的损害 ,这其中就包括细胞对重金属离子的忍耐 ,促进有害重金属离子的外排 、转运至液泡 、解毒 、
还原至无毒低价态 、细胞自身损害修复等多个复杂的生物过程[ 21] .另一方面 ,Ca2+-CaM 系统通过参与真
核基因的表达调控 ,进而使植物对外界的变化产生反应.首先 ,Ca2+-CaM 系统通过蛋白质磷酸化作用 ,
进而控制转录因子的核内定向 、与 DNA 结合活性 、反式作用活性等 ,调节基因的表达.目前已有研究表
明 ,Ca2+-CaM 通过这种作用调节植物雄性不育基因的表达;在植物热激过程中 ,是通过激活热激转录因
子(HSF)的 DNA 结合活性进而促进热激基因的表达和热激蛋白的合成[ 21 ～ 23] .另外 ,Moo JC等人的最新
研究表明 ,CaM本身可以通过和一些特定的转录因子上的 CaM 结合区域结合 ,进而直接调节基因的表
达.从拟南芥中克隆得到MYB2和WRKYⅡd型转录因子其蛋白质序列中均有 CaM结合位点 ,并且通过
这种结合发挥了调节作用进而增强了拟南芥的耐盐性[ 4 , 24] .因此有理由认为 ,CaM 的这些功能同样发挥
在植物抗重金属的过程中.Olmos E等研究发现 ,在 Cd2+诱导下烟草细胞内的氧化爆发(oxidative burst)
现象是由 Ca2+-CaM信号系统引发的[ 27] .该系统通过其细胞内第 2信使的作用 ,引起蛋白质的磷酸化和
脱磷酸化 ,进而引起一系列生理生化反应 ,促使细胞对重金属产生的毒害作用做出反应.CaM 也极有可
能作用于某个与重金属和逆境相关的转录因子或者重金属相关基因的启动子 ,通过转录激活作用调节
与重金属转运 、抗性 、解毒 、或者富集相关基因的表达发挥其作用.
总之 ,有关于CaM和 Ca2+-CaM信号系统在植物重金属胁迫下的作用机理研究的报道还很少 ,但可
以肯定这是个相当复杂的过程 ,CaM 在其中多个方面多个层次发挥着不同的作用达到最后的结果.我们
的研究结果表明 , TcCaM2的过表达使得酵母对 Co2+ 、Ni2+的抗性增加而提高了对 Cd2+的敏感性 ,这可
能是 CaM 发挥其作用的综合结果 ,其机理有待于进一步研究.
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A novel CAM gene from heavy metals hyperaccumulator Thlaspi
caerulescens L.and functional analysis in yeast
HAN Lu　WEI Wei　GUAN Zi-Qiu　XU Jin　CHAI Tuan-Yao
(Department of Biology , Graduate University of Chinese Academy of Sciences , Beijing 100049 , China)
Abstract　Calmodulin , the predominant calcium receptor , is one of the best-characterized calcium sensors in
eukaryotes which regulates diverse cellular functions by modulating the activity of a variety of enzymes and proteins.
Research workers have evidences suggesting Ca
2+
and calmodulin are involved in various environment stimulation
reaction.By differential screen , we isolated a positive clone in the T.caerulescens cDNA library induced in
response to Cd
2+.The result of cDNA sequence analysis showed that the positive clone shared more than 92%
homologies for nucleotide sequences with CaM2 gene from Arabidopsis thanliana , named TcCaM2.The TcCaM2
gene consists of 447 nucleotides and encodes 149 amino acids , and it shares more than 83% homologies for
nucleotide sequences and 95% for encoding amino acid sequences as compared with those of calmodulin genes of
other plants.A yeast-expressed plasmid with TcCaM2 was constructed and transferred into heavy metal sensitive
yeast mutant cells.Further study about the growth patterns of TcCaM2-expressed yeast indicated that over
expression of TcCaM2 improved Co
2+ 、Ni2+ resistance and increased Cd2+ hypersensitivity in the yeast cells.As an
important role in the T .caerulescens s response to heavy metal , TcCaM2 can work as a significant gene tool in the
phytoremediation of heavy metal pollution.
Key words　TcCaM2 , heavy metal , calmodulin(CaM), Thlaspi caerulescens , yeast
472 中国科学院研究生院学报 第 24 卷