全 文 ：利用隆线 趋光行为评价铬的生物毒性*
吴永贵1, 2* * 黄建国2 袁 玲2
( 1 华南农业大学资源环境学院,广州 510642; 2西南农业大学资源环境学院,重庆 400716)
摘要 报道了以隆线 单克隆 Dc42为生物监测器, 利用其趋光行为变化评价铬生物毒性的方法. 结果
表明, 隆线 趋光行为抑制率能较好地反映水中铬的污染程度. 在重铬酸钾标准毒物溶液中, 趋光指数
与 Cr6+ 的浓度呈极显著负相关( R 2= 0 8089, P< 0001) , Cr 6+ 浓度的检测下限为 0 056 mg!L - 1, 远低于
LC50和 EC50, 平均精度达到 5 46% , 说明 趋光指数法用于监测化学物质生物毒性灵敏度高、精确可靠.
关键词 铬 隆线 趋光行为 生物监测
文章编号 1001- 9332( 2005) 01- 0171- 04 中图分类号 Q948. 3 文献标识码 A
Phototactic behavior of Daphnia carinata as an indicator of chromium biotoxicity. WU Yonggui1, 2 , HUANG
Jianguo1, YUAN L ing1 ( 1 College of Resources and Environment , South China Agr icultural University ,
Guangzhou 510642, China; 2College of Resour ces and Envir onment , Southw est Agr icultural University ,
Chongqing 400716, China) . Chin . J . A pp l . Ecol . , 2005, 16( 1) : 171~ 174.
The study on the phototactic behavior of Daphnia car inata clone Dc42 as an indicator of chromium biotox icity
showed that the phototax is inhibition ratio ( Rpi) of D. car inata could better indicate the chromium status in
water. T here was a negativ e linear correlation between phototactic index ( Ip) and Cr
6+ concentration in stan
dardized K2Cr 2O7 solutions ( R
2= 0. 8089, P< 0. 001) . The detection limit of Cr6+ by I p w as 0 056 mg!L- 1 ,
much lower than that of LC50 or EC50 , and the mean precision index for detection reached up to 5. 46% , which
suggested the sensitivity, precision and reliability of this met hod in monitoring chemicals biotoxicity .
Key words Chromium, Daphnia car inata, Phototactic behavior, Biomonitor.
* 重庆市科委应用基础重点资助项目( 20027301) .
* * 通讯联系人.
2003- 11- 18收稿, 2004- 02- 15接受.
1 引 言
关于重金属对水生生物的影响, 国内外研究较
多的是用 及其他生物的 EC50、LC50、生殖生长及
群落消长等指标来进行评价[ 1, 5, 8] , 其结果可反映污
染物对生物的影响,但生物死亡造成的物种减少和
消亡,往往已是污染造成的晚期效应,这样的结果只
能评价污染对生态系统的最终影响[ 11] ,难以起到早
期预报控制和有效保护生物的作用.此外,这些方法
在实际运用中存在操作复杂、耗时长等局限, 从而限
制了生物监测法的应用范围. 为此,在当前环境污染
生物监测中,迫切要求研究和开发能综合体现污染
物对生物毒害作用的快速指标, 为环境监测与管理
提供及时有效的服务.
科 ( Daphniidae) 浮游生物对于水体中的有
害物质比较敏感,低浓度的重金属、农药和一些有毒
物质显著影响它们的生长繁殖、行为反应、形态特征
和生理生化过程等[ 1, 4, 6, 14, 13~ 16] .研究表明, 某些
具有较强的趋光性, 这种特性受遗传控制,并受环境
条件修饰[ 2~ 4, 6] , 利用它们趋光行为的变化可以指
示污染物的毒性大小[ 4~ 6, 15] . 有关 Cr 对隆线
( Daphnia car inata )的急性生物毒性及其趋光行为
影响的研究,国内外目前尚无相关报道.本实验利用
隆线 单克隆 Dc42为材料,研究了 ISO标准毒物
重铬酸钾对其趋光行为的影响, 并与常规的急性生
物毒性试验结果进行比较,为利用 趋光行为评价
化学物质的生物毒性提供实验方法和理论依据.
2 材料与方法
2 1 材料
2 1 1 试验生物 隆线 采集于重庆三峡库区的自然水体,
经多代孤雌生殖, 纯化、筛选出具有较强趋光性的单克隆纯
生物株 Dc42.培养条件[ 7, 9, 13]为:温度 20 ∀ 0 5 # 、光照周期
14 h!d- 1、光强 1 200 Lx .在培养期间, 每周用制备的培养用
水换水 3 次,每次换掉培养容器中的 1/ 2,每日早晨 8 时投喂
新鲜斜生栅藻( Scenedesmus oblquus)为食物,藻类密度为 20
∃ 105 个细胞!ml- 1 .采集出生 48 h 的 备用.
2 1 2 试验用水 标准毒物的稀释水为 I SO 人工标准水, 溶
液用预先充氧至饱和 ( 20 # )的去离子水配制, pH 7 8, DO
%8 4 mg!L - 1, 静置 24 h 后使用. pH 及 DO分别用 PHS3C
pH 计及 JPB607 型溶氧分析仪(上海精科仪器公司)测定.
应 用 生 态 学 报 2005 年 1 月 第 16 卷 第 1 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Jan. 2005, 16( 1)&171~ 174
试验生物培养用水为充分曝气脱氯的自来水, pH 76,
电导率 230 s! cm- 1, 使用前用充氧机充氧, 使 DO >
8 mg!L- 1 .
213 标准毒物 采用 I SO6341 推荐的重铬酸钾( K2Cr 2O7 ,
分析纯) , 去离子水配成 10 mg!L - 1的母液备用.
22 测定装置
趋光行为测定装置见图 1. 其中光源为 150 W 卤素
灯,外带反射罩及散热装置, 所发出的光线经石英隔热玻璃、
透镜组、滤光片和毛玻璃处理后得到平行光束,并垂直进入
反应器.
图 1 水 趋光行为测试装置
Fig. 1 S etup for quant ifying Daphnia∋ s phototact ic behavior.
反应器为硬质玻璃容器, 规格为 40 mm ∃ 40 mm ∃ 120
mm, 容器内的水深为 100 mm, 并等分为 4 个光区,由上至下
分别标识为 U、M 1、M 2 和 L . 暗箱的规格为 100 mm ∃ 100
mm ∃ 180 mm, 在容器底部及暗室四周用黑色糙面憎水层防
止光线反射和散射.
23 试验方法
231 标准毒物溶液配制 将 K2Cr2O7 母液按等对数间距,
用 ISO人工标准水稀释至 0032、0 056、010、0 18、0 32、
056、1 00、1 80 mg!L- 1 ,并以 I SO 标准水为对照[ 9] .
232 半致死浓度 LC50和半有效抑制浓度 EC50的测定 根
据文献[ 10, 11]资料进行, 试验在 20 ∀ 0 5 # 的恒温环境中进
行.将 在 I SO 标准水中润洗 3 次, 每次 5 min, 然后用玻璃
吸管随机吸取 10 只幼 放入玻璃烧杯内 100 ml的待测液
中.试验期间除不喂食外, 其它条件与常规培养相同. 的死
亡以( 沉入水底, 轻转容器无任何反应)为死亡判断标准[ 9] ;
以( 在溶液轻微扰动下 15 s 内不能游泳活动的 (即使其触
角仍可活动))为活动受抑制标准. 试验开始后, 前 8 h 作连
续观察,然后在 24 h、48 h 及 96 h 对试验 的存活及活动受
抑制情况进行记录,试验过程中及时剔除死亡个体. 试验设
置 3 个平行组,重复 2 个批次.
233 趋光行为测定 在 20 ∀ 05 # 恒温环境中, 将 在
ISO标准水中润洗 3 次, 每次 5 min, 然后随机取 10 只, 放
入反应器内的待测液中,恒温光照培养 3 h(同培养条件) .然
后,将反应器移入测定装置, 使 暗适应 5 min 后, 开启光
源,光照刺激 10 min. 在照光期间, 从第 6 min 开始, 每隔 1
min 记录各光区内的 分布数目. 在测定过程中,同一 Cr6+
浓度设置 5 次重复, 共做 2 个批次. 按下式计算趋光指数
( phototactic index, Ip) [ 4, 7, 15] :
Ip =
U - L
U+ M 1+ M 2+ L
( 1)
式中, I p 为趋光指数, 变化于[- 1, 1] 之间,正值表示正趋光
性, 负值表示负趋光性或失去趋光性; U、M 1、M 2 和 L 是 在
对应区域内的分布数目.
趋光行为抑制率( phototax is inhibition ratio, R pi )按公式
( 2)和公式( 3)计算:
p m= ( U+ M 1) - ( M 2+ L) ( 2)
Rpi ( % ) =
1- p CrPck ∃ 100 ( 3)
式中, U、M 1、M 2 和 L 的意义同上. Pm 为某物质溶液中的
趋光 数, P > 0 表示正趋光, P< 0 时表示负趋光性或失
去趋光性; Pck和 PCr分别为对照( CK )溶液及含 Cr6+ 溶液
中的相对趋光 数.
2 3 4 数据处理 采用 DPS 2000 软件[ 15]进行数据处理, 利
用机率值法求得 24、48 和 96 h 的 LC50值及 EC50 . 对处理间
趋光指数进行方差分析( ANOVA)及 Duncan∋ s 多重比较, 得
出使 趋光行为发生显著改变的监测浓度下限.
3 结果与讨论
31 铬对 活动的抑制作用及其半致死浓度
Cr6+ 对隆线 的急性生物毒性效应见表 1. 由
表 1可知,各时段的 EC50与 LC50较为接近, 且随着
在毒物中暴露时间的推移,两者间的差值越小.这
一规律与其他的文献资料相似[ 1, 16] . 这就意味着,
在观测到半数生物活动受抑制的浓度( EC50)时, 毒
物的累积已接近半数生物死亡的浓度阈值( LC50) .
因而,在实际工作中, 当运用 EC50和 LC50来评价环
境污染物的生物毒性及生态风险时, 污染往往已经
到了使物种生存濒危及生态破坏较为严重的程
度[ 11, 12] .
表 1 铬对隆线 活动能力的抑制及半致死作用*
Table 1 Inhibi tion of the mobil ity and the mortal ity of D. carinata in
the chromates solution
暴露时间
Time( h)
EC50
( mg!L- 1)
LC50
(mg!L- 1)
24 0176( 0115~ 0245) 02373( 0165~ 0340)
48 0121( 0067~ 0174) 01436( 0086~ 0205)
96 0053( 0009~ 0096) 00710( 0022~ 0116)
* 95%置信区间 95% confidence interval.
由于重金属离子在水体中不易消失, 会在较长
的时期内对水生生物产生毒害作用. 因此,枝角类暴
露在低于 96 hLC50 Cr6+ 浓度下, 仍然可引起它们
功能上的非致死性伤害及至死亡, 从而破坏水生生
物链,并通过食物链,对鱼类、藻类及细菌等上下级
172 应 用 生 态 学 报 16卷
食物链生物种群产生影响, 最终影响到水生生态系
统的平衡[ 11, 16] . 因此, 有必要探索更为灵敏的生物
监测指标, 以供进一步研究重金属对水生生态系统
的影响及评价渔业水质时参考.
32 铬对隆线 趋光行为的影响
隆线 在重铬酸钾溶液中暴露达到 3 h后, 其
在恒定光源下的趋光行为受到了明显的影响 (图
2) ,表现在沿光照梯度递减方向,反应器中不同垂直
高度上 的分布产生显著差异. 当水中的 Cr6+ 高于
0056 mg!L- 1时, 群体中能游向光源的个体数目
开始下降,随着重金属浓度的提高,滞留于底层的
数量比例逐渐增多,表明 已经开始受到亚致死水
平上的毒害.
图 2 Cr6+对水 在反应器内分布的影响
Fig. 2 Ef fects of Cr6+ concent rations on the dist ribution of D . carinata
in reactor.
33 不同浓度铬与 趋光行为抑制率的关系
由图 3可知,较低浓度 Cr6+ 对 趋光行为的抑
制作用较小.随浓度升高, Cr6+ 对 Rp i从 0056 mg
!L- 1的 2518%增至18 mg!L- 1的 18705% . Cr6+
与 Rp i 间呈显著的线性关系 ( y = 253936 +
995350x , R 2= 08730, P< 001) .
图 3 Cr6+与 趋光行为抑制率的关系
Fig. 3 Relat ionship betw een Cr6+ concentrat ions and R pi .
34 不同浓度铬对 趋光指数的影响
如图 4 所示, 在待测的浓度范围内, 隆线 Ip
与待测液中的 Cr6+ 浓度呈线性负相关( y = 03908,
R
2= 0809, P< 0001) ,这与前人用 Cu2+ 、Cd2+ 对
大型 ( Daphnia magna) 趋光指数的试验结果类
似[ 4, 6, 15] .
图 4 Cr6+ 与 趋光数的关系
Fig. 4 Relationship betw een Cr6+ concent rat ions and Ip .
统计结果(表 2)表明,不同浓度 Cr6+ 对 的 I p
影响差异显著( P= 0001) . 导致 I p 发生显著改
变的 Cr6+ 浓度下限为 0056 mg!L - 1,远低于 48 h
LC50( 0144 mg!L- 1)和 EC50 ( 0131 mg!L- 1 ) . 此
外,测定数据的精确度平均为 546% .虽然当 Ip 在
接近零时,精确度偏大,但这是由于测定数据出现正
负抵消,致使平均值减少, 标准差积累引起,说明
Ip 用于评价铬的浓度及生物毒性较为可靠.
表 2 Cr6+浓度对水 趋光指数的影响
Table 2 Effects of Cr6+ concentrations on the phototactic index of D .
car inata
Cr6+
( mg!L- 1)
IP 精确度
Precision( % )
0032 0550 ∀ 0028( a) 16
0( CK) 0506 ∀ 0016( a) 10
0056 0386 ∀ 0037( b) 32
0100 0248 ∀ 0025( c) 32
0180 0224 ∀ 0043( c) 61
0320 0122 ∀ 0044( d) 114
0560 0074 ∀ 0033( d) 141
1000 - 0200 ∀ 0038( e) 60
1800 - 0454 ∀ 0037( f) 26
注: Ip 栏中,在平均值 ∀ 标准误 ( Se) 后标有不同字母,表示在 P =
005上的差异显著水平 Note: In Ip column, mean values ∀ standard
error followed by dif ferent let ters are signif icant ly diff erent at P = 005
( Duncan∋ s test ) .
试验结果表明,利用隆线 趋光行为的变化,在
3 h内就能监测到远低于 24~ 48 h 时 EC50和 LC50
的毒物浓度.因此,使用隆线 趋光行为监测水体污
染物的生物毒性时, 往往能在生物刚开始受到轻微
影响时就能及时发现污染造成的潜在危害,并有足
够的时间和空间采取应急措施以防止更严重更广泛
的污染带来的损失.值得注意的是,实验中利用隆线
趋光行为( 3 h- Ip )变化监测到的 Cr6+ 最小浓度
( 0056 mg !L - 1) , 与传统 96 hLC50 ( 0071 mg!
L - 1)和 96 hEC50 ( 0053 mg!L - 1)相当接近, 预示
1731 期 吴永贵等:利用隆线 趋光行为评价铬的生物毒性
着利用 3 hIp 可能预测毒物 96 h 的急性毒性.
是水生食物链中的关键生物, 体积小、繁殖
快、生命周期短, 对于水体中的有害物质较为敏感,
是比较理想的生物监测器[ 1, 16] . 利用 趋光行为作
为生物标志物( Biomarker) , 对毒物的生物毒性进行
检测和评价,在国外是最近几年才发展起来的一种
崭新的生物监测技术[ 2~ 7, 7~ 9, 15] . 作为一种监测指
标, 趋光行为的变化可灵敏地反映发生在较低生
物水平(细胞或分子水平)所产生的综合效应. 趋光
行为的强弱,可反映 体内物质和能量代谢及神经
传导过程的正常与否[ 14] , 同时也是生物健康状况的
一种综合体现. 因此,利用灵敏的行为监测装置测定
有毒物质对 趋光行为的影响, 可大大缩短试验持
续时间,快速可靠地评价水体中化学物质及其他污
染物对水生生物的危害. 通过对监测装置的改进和
完善,进一步结合计算机图像分析技术,可以实现对
水质自动、连续的监测与预警作用.
4 结 论
隆线 的趋光行为抑制率与 Cr6+ 浓度之间存
在着显著负相关, 趋光指数可以很好地指示水体
中 Cr6+ 的浓度, 3 h内导致 趋光指数发生显著改
变的监测下限浓度远低于 LC50和 EC50.因此, 作为
生物监测器,利用 趋光行为的变化来评价环境中
有毒化学物质的生物毒性,具有灵敏度高、监测速度
快、数据重现性好等优点.
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作者简介 吴永贵, 男, 1972 年生, 博士, 讲师, 现为华南农
业大学资源环境学院在站博士后, 主要从事植物营养与环境
生态方面的教学研究工作, 发表论文多篇.
174 应 用 生 态 学 报 16卷