全 文 ：RAPD 技术在昆虫学研究中的进展 3
胡艳红　迟德富 3 3
(东北林业大学 ,哈尔滨 150040)
【摘要】　综合论述了 RAPD 技术在昆虫分类学、物种的亲缘关系、系统发育、分子连锁图谱的构建、有害
生物鉴定、害虫抗药性诊断、分子标记辅助育种和生态学这几方面研究中的应用 ,指出 RAPD 技术存在的
问题 ,并提出一定的相关对策 ,阐明随着理论的发展和试验技术的进步 ,分子标记技术将使昆虫分子生物
学研究迈上一个新台阶.
关键词 　昆虫学 　RAPD 技术 　分子遗传标记
文章编号 　1001 - 9332 (2004) 08 - 1481 - 06 　中图分类号 　Q963 　文献标识码 　A
Research advance in application of RAPD techniques in entomology. HU Yanhong , CHI Defu ( Northeast
Forest ry U niversity , Harbin 150040 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2004 ,15 (8) :1481～1486.
This paper summarized the application of RAPD techniques in insect taxology and ecology ,relative of species ,sys2
temic development ,identification of pest ,diagnosing for pest resistance ,construction of molecular linkage map ,
and molecular assistant breeding. The problems existing in the applications of RAPD in entomology were indicat2
ed ,and their countermeasures were given. It was mentioned that with the development of theories and experi2
mental techniques ,insect molecular biology would make new progress and conquer all those problems.
Key words 　Entomology , RAPD technique , Molecular genetic markers.
3 国家自然科学基金项目 ( 39970620) 和教育部高校青年教师奖
(2000 年度)资助项目.3 3 通讯联系人.
2002 - 10 - 12 收稿 ,2003 - 02 - 28 接受.
1 　引 　　言
随机引物扩增 ( RAPD) 标记突破了表达型标记的局限
性 ,其变异只来源于基因 DNA 序列的差异 ,能快速而容易地
提供遗传变异的信息 ,具有信息含量高、不同层次和类群之
间广泛可比等优越性 ,因而成为遗传标记中强有力的工具.
此技术被大量的应用于昆虫的研究中.
2 　RAPD 技术在昆虫学研究中的应用
211 　分类学
现代遗传学表明 ,物种的遗传性状是由基因决定的 ,而
基因的变异是由于 DNA 分子中碱基序列的变化造成的 ,因
此人们采用分子生物学技术和生化技术 ,以 DNA 分子或其
它大分子为材料进行研究 ,希望从根本上解决形态分类不能
解决的问题.
嗜人锥蝇 ( Cochliomyia hominivorax)的幼虫是西半球牲
畜的主要害虫 ,其发育未成熟的早期阶段 (1～2 龄) 同次生
锥蝇 ( C1 m acellaria)极其相似. Skoda 等[39 ]使用 120 个随机
引物 ,对其进行了 RAPD2PCR 分析 ,经过筛选 ,有 21 个引物
可产生清晰且能够重复的谱带 ,完全能区分出这两个种.
Lery 等[19 ]用 RAPD 技术区分 11 种昆虫细胞系 ,6 个取自鳞
翅目的 5 个种 ,1 个取自双翅目 ,4 个取自鞘翅目 (其中一种
是克罗拉多马铃薯叶甲 Leptiontarasa decemlineata) ,通过单
一引物扩增的 DNA 指纹谱就能分辨十分接近的种. 用 Nei
统计分析法对 4 个独立分离的克罗拉多马铃薯甲细胞系分
析表明 ,培养的和田间收集的具有相似的谱带 ,但从一系列
的多态性标记还是能区分它们 ,因而证明通过 RAPD 指纹技
术 ,借助于合适的统计分析法 ,可以对处于不同发育阶段的
细胞系进行鉴定或对已知物种的细胞系进行描述. Wald2
schmidt 等[45 ] 用 RAPD 标记 ,分析了膜翅目蜜蜂科昆虫
Melipona quadrifasciata (“m andacaia”)的 69 个品系的遗传变
异 , 根 据 遗 传 距 离 将 其 区 分 为 M1 q1 anthidioides 和
M1 q1 quadrif asciata 两个不同的种群 ,与形态学分析相符.
面对昆虫分类的难题 ,一种简洁、快速、成本低的方法肯
定是受欢迎的 ,而 RAPD 技术正符合这种要求 ,所以它很快
被昆虫分类学家运用到实际工作中. 南美果蝇 ( A nast repha
f raterculus)的分类地位一直是一个具有争论性的问题 ,主要
是因为对其遗传变种的误解. Basso 等 [3 ]用 RAPDs2PCR 分离
多态性片段研究表明 ,被实验的变种属于 1 个种 ,但具有丰
富的多态性 ,不支持其丰富的染色体多态性所暗示的存在隐
含种复合体的假设. 在昆虫纲里 ,同翅目与半翅目的关系也
一直存在一些争论 ,目前分类学家大多支持将同翅目划为一
个独立的目 ,应用分子生物学手段分析的结果也证实了这一
观点.
212 　物种亲缘关系及系统发育
21211 物种的亲缘关系 　长期以来 ,昆虫系统关系的研究主
要以外部形态为依据 ,对近缘种种间关系的解释有其局限
性.分子生物学技术的不断发展和完善 ,为种间近缘度的解
应 用 生 态 学 报 　2004 年 8 月 　第 15 卷 　第 8 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Aug. 2004 ,15 (8)∶1481～1486
释提供了许多新的方法.
程道军等[5 ]选用重复性较好的 10 个引物 ,对 6 种绢丝
昆虫 23 个个体进行扩增 ,共得到 245 个 RAPD 标记. RAPD
分析结果表明 ,家蚕与野桑蚕两者之间遗传距离小 ,反映出
家蚕和野桑蚕亲缘关系较近 ;而天蚕、蓖麻蚕和柞蚕三者之
间以及分别与家蚕和野桑蚕之间的遗传距离较大 ,亲缘关系
远. 聚类分析的结果与之相同. 蒋国芳等 [15 ,16 ]用 RAPD 技术
对蚱属 5 种蚱基因组 DNA 的多态性进行了研究 ,在事先优
化的反应条件下用 12 个随机引物扩增 ,共得到 84 条清晰稳
定的多态性片段 ,根据扩增片段的共享度计算出相对遗传距
离指数 ,然后用 U PGMA 和 NJ 聚类方法对其进行分析 ,确
定了它们相互间的亲缘关系. 蒋国芳等 [53 ]还研究了中国蔗
蝗属的 3 种蝗虫基因组 DNA ,用 12 个引物扩增出 179 条清
晰稳定的多态性 DNA 片段. 结果表明 ,等歧蔗蝗与异歧蔗蝗
的亲缘关系较近 ,而与斑角蔗蝗较远. 朱道弘等[53 ] 采用
RAPD 方法 ,对日本主要稻蝗的 DNA 多态性进行了分析 ,得
到了几种稻蝗的种间相似系数和遗传距离 ,并建立了它们的
U PGMA 系统树 ,从而了解其亲缘关系. 谭声江等 [43 ]对采自
陕西师范大学校园和长安县不同巢穴的日本弓背蚁进行了
攻击行为测试和 RAPD2PCR 分析 ,探讨了它们的亲系识别
能力及其遗传背景. Janarthanan 等[14 ] 利用 RAPD 技术 ,用
40个随机引物揭示出种群存在多态性 ,认为斜纹夜蛾
( S podotera litura)的 3 个地理种群中 Chengalpattu 和 Chen2
nai 的亲缘关系较近 ,而与 Coimbatore 较远.
21212 物种的系统发育 　RAPD 技术能利用前人采集的标
本进行 DNA 分子多态分析 ,这可以极大地扩展了系统演化
的分子生物学研究范围 ,有助于建立正确和完善的分类体
系 ,推测正确的系统演化树.
鲁成等[25 ]对具有代表性的中国 11 个地区的野桑蚕进
行了 RAPD 分析. 结果表明 ,不同地区的野桑蚕的遗传距离
较大 ,同一地区不同个体野桑蚕的遗传距离也较大 ,它们均
远大于家蚕品种内个体间的遗传距离 ,甚至超过了家蚕品种
间的遗传距离 ,表明中国野桑蚕是一个十分混杂的、遗传多
样性非常丰富的群体 ,另外多数情况下 ,野桑蚕的遗传距离
表现出与空间距离呈正相关. Vandewoestijne 等[44 ]用 RAPD
和同功酶方法 ,对比利时 2 种蝶类的种群遗传结构进行了研
究.结果表明 ,RAPD 方法能更精确和及时地揭示出遗传结
构 ,从而了解其系统发育.
七星瓢虫 ( Coccinella septem punctata) 的迁移和分散及
对蚜虫的控制效果还没有真正了解 ,为定量其种内的遗传多
样性和监测其空间分布 ,Haubruge 等[12 ]从比利时取样 ,利用
RAPD 技术 ,分析了七星瓢虫 DNA 的多态性 ,用 20 个引物
扩增出 100 条多态性带 ,两者间的遗传距离根据 Nei 和Li 的
方法计算 ,然后构建系统图 ,比较种内和种群间的变异系数.
结果表明 ,对于种间的 RAPD 标记可能受多种因素的影响而
变得复杂 ,但对种内遗传多样性的分析则很有效.
21213 分子连锁图的构建 　对一些重要的经济昆虫和模式
昆虫 ,构建基因图谱有巨大的经济价值和理论意义. Prom2
boon[32 ]构建了含 169 个标记的家蚕 RAPD 图谱 ,构建了 29
个连锁群 ,总跨度约 900 cM. Hunt 等[13 ]利用 RAPD 标记构
建了蜜蜂的基因图谱 ,包括 26 个连锁群 ,平均每 10 bp 引物
筛选出的多态性位点达 218 个 ,并在此基础上 ,把决定性别
的 X位点、控制黑色体色的基因和苹果酸脱氢酶基因分别
定位于不同的连锁群上. 李斌等[20 ]已构建 RAPD 标记 200
多个 ,确定了 3 个 RAPD 标记分别与 Y、N11、od 和 sch 等几
个形态基因相连锁 ,还构建了许多高密度的家蚕连锁图谱.
Gakau 等[11 ]构建了熊蜂 ( Bombus terrest ris) 的遗传连锁图
谱 ,包含 79 个标记 (6 个微卫星 DNA 标记和 73 个 RAPD 标
记) ,都标记在 21 个连锁群内 ,计 93511 cM ,并用种群隔离
分析法定位了熊蜂的性别决定基因位点. Nagaraju 等[29 ]用
RAPD、RFL P、ISSR、STS、微卫星 DNA 等技术构建了家蚕的
遗传图谱 ,为基因功能鉴定、基因组对比、基因和染色体进化
提供了基础 ,也为基因功能的识别、基因和染色体组的进化
以及比较基因组学奠定了基础.
213 　生态学
分子标记技术使人们对昆虫的生态学 ,包括种群遗传分
化、种群间迁移扩散关系以及生殖策略等问题获得了更深入
的认识. 同一物种的不同种群可能发生遗传变异 ,在形态学
上通常难以发现这种差异 ,但在 DNA 水平却容易找出明显
的不同.
杨效文等[48 ]用 RAPD 方法 ,研究了我国烟蚜种群的寄
主分化和地理分化. 结果表明 ,我国烟蚜分化仅在种群水平
上 ,未达亚种分化程度. 孙姗等 [42 ]采用 RAPD 方法研究了我
国 5 个地区亚洲玉米螟种群的分化 ,这有助于了解我国玉米
螟的生物学特性和状况 ,而且对其防治工作也有重要意义.
张素方等[51 ]采用 RAPD 方法 ,对全周期桃蚜的有翅性母蚜、
无翅性母蚜、雄蚜、卵、有翅迁移蚜等蚜型的 DNA 遗传多态
性进行了分析 ,结果表明 ,不同蚜型 DNA 多态性不同. Skin2
ner 等[38 ]利用 RAPD 技术 ,研究了紫花苜蓿上一种叶蝉种群
内的遗传多样性. 结果表明 ,所有 48 个个体都具有特殊的
RAPD 片段 ,个体间存在随机交配. Dos Santos 等[7 ]为鉴定圣1 保罗州不同地理分布的种群 ,借助于 RAPD 技术分析埃及
按蚊 (Aedes aegypti)的遗传差异 ,绘制出埃及按蚊的系统树
图 ,发现在圣·保罗地区的埃及按蚊可被分为两个地理种群 ,
一个主要来自于圣·保罗地区 ,另一个则主要来自于拉丁美
洲的最大港口城市.
Nielsen 等[30 ]用 RAPD 技术 ,分析了从蚜虫分离出的 28
个接合菌纲虫霉目 Pandora Humber 属体外寄生真菌. 结果
表明 ,它与地理环境相关 ,而与寄主昆虫不相关 ,与 ITS分析
一致. Martinez 等[27 ]利用 RAPD 技术和 Operon 公司的 H216
引物 ,鉴定了巴西 Parana 州的粉虱 ( Bemisia tabaci)生物型 A
和 B ,发现生物型 A 比生物型 B 更广泛存在 ,同时还发现一
种新的生物型 ,这种生物型只在以木薯为寄主的植物种群中
出现. Abdullabi 等[1 ]分别从木薯和其他植物收集粉虱种群 ,
研究了粉虱同木薯的相关性 ,利用 RAPD2PCR 技术分析了
世界范围内和木薯主栽培区 (非洲亚撒哈拉地区) 种群的遗
2841 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
传结构 ,发现以木薯为寄主的粉虱仅取食木薯 ,而以其他植
物为寄主的是多食性 ,寄生于木薯的非洲种群为另一不同群
体. Luchai 等[26 ]用 RAPD 揭示出 ,模式昆虫水稻蚜的变异同
寄主植物相关 ,既包括在特殊植物上的特殊基因型 ,又包括
在培育的谷类和当地草上的一般基因型 ;蚜虫同其各自的寄
主植物在相同的地理区域并在同一时间出现 ,这是一个少有
的例子. 这项研究强调了对遗传多样性和农业环境中寄主类
型的理解的重要性.
214 　在有害生物鉴定和害虫抗药性诊断中的应用
在有害生物的鉴定过程中经常截获一些不同虫态的害
虫 ,对于幼虫和蛹往往还需羽化为成虫后才能鉴定 ,给鉴定
工作造成困难. 因此有必要提高诊断的准确性、灵敏度 ,缩短
检验时间 ,简化检测程序都十分必要。
Kethidi 等[18 ]通过分析 RAPD 片段中的序列特征扩增
区 (sequence characterized amplified region) ,鉴定出仅在亚洲
长角天牛 ( A noplophora glabripennis) 中存在 2 740 bp 的
DNA 片段 ,并设计出由 22 个碱基组成的嵌套式寡聚核苷酸
引物 ,利用引物 SCAR2 和 SCAR 3 ,分别扩增出 1 237 和 2
720 bp 的片段 ,这两个片断能够区分当地和紧密相关的非当
地种 ,并且可以对从亚洲长角天牛所有发育阶段的翅、腿、触
角、卵、幼虫、蛹、成虫的组织中提取的 DNA 进行扩增. 由此
可见 ,SCAR 标记可被用于亚洲长角天牛的鉴定. Rubio2Palis
等[35 ]也利用诊断性 RAPD ,对 Venezuela 地区的 4 种疟蚊
( A nopheles)进行了分析鉴定.
害虫抗药性的产生是在杀虫剂使用量不断加大的条件
下 ,由于突变和选择作用 ,与抗药性有关的遗传变异在种群
中产生和扩散的结果. RAPD 技术一出现 ,便迅速被应用于
害虫抗性机理的研究. 利用 RAPD 技术检测抗性遗传变异 ,
即使在人们对有关抗性基因缺乏深入了解的情况下 ,也可依
赖于抗性基因连锁的 DNA 多态性标记 ,对种群的抗性遗传
变异进行鉴定. 梁革梅等 [22 ]利用 RAPD 技术 ,成功地扩增得
到 105 条多态性条带 ,并通过聚类分析发现 ,棉铃虫对 Bt 产
生抗性后在基因水平上发生了变异 ,说明 RAPD 技术不仅可
以用来鉴定棉铃虫对 Bt 是否产生抗性 ,而且可以区分不同
的 Bt 抗性种群. 程罗根等[6 ]用 RAPD 方法研究了小菜蛾对
杀虫双和杀螟丹的抗药性遗传标记 ,为进一步研究抗性基因
的分子结构和功能奠定了基础.
羟肟氨酸是小麦中抗蚜虫的活性诱变剂. Figueroa 等[9 ]
用 RAPD2PCR 标记分析了蚜虫 ( S itobion avenae Fabricius)遗
传多样性同寄主小麦异羟肟酸 ( Hx) 水平的相关性. 结果表
明 ,用高水平 Hx 品系、低水平品系和缺乏 Hx 品系处理 4～5
代后 ,分别出现两个变异标记、一个变异标记和没有变异标
记. Schlipalius 等[36 ]用 RAPD 指纹产生的遗传连锁图谱 ,探
测出 Rhyzopertha dominica 对磷化氢的高水平遗传抗性 ,图
谱包括 94 个显性 DNA 标记 (平均距离为 416 cM) ,还定义
了 9 个连锁群 (总重组距离为 39011 cM) ,鉴定出两个负责
高水平抗性的等位基因 ,其中一个提供 50 倍抗性 ,一个提供
1215 倍抗性 ,两抗性位点无重组. 如果两基因协同作用 ,可
达到敏感品系 250 倍的抗性. Dweikat 等[8 ]利用 RAPD 技术 ,
使用 2000 个引物 ,对小麦 ( Triticum aestivum ) 的相近基因
系进行了筛选 ,发现在生物型 B 中同 H6 基因相连的 DNA
标记对黑森蝇 ( Hessian f ly)具有抗性 ,其中有 6 个引物显示
的多态性片段同 H6 的抗性相关. 基于重组率构建的高分辨
率的遗传图谱还显示出 ,2 个标记是同 H6 紧密连锁的 ,没有
重组发生 ;有 3 个标记被成功地插入序列标签位点 ( STS) ,
其与 RAPD 引物可检验抗性基因的存在 ,说明标记鉴定和高
分辩率的遗传图谱可以定位抗性基因. Yao 等 [49 ]利用 RAPD
技术 ,对家蚕 3 个相近基因系的核型多角体病毒 (NPV) 的不
同抗性进行了分子标记的扫描. 结果表明 ,OPA218700 和
OPY211400 是同主要的抗性基因相联系的 ,其分子标记的有
效性在 F2 代中被证实. Sdorenko 等[37 ]用个体 RAPD 图谱 ,
对当地的科罗拉多马铃薯甲进行了聚类分析 ,认为基辅州的
种群为一种新的种群 ,这有助于解释这一害虫对拟除虫菊酯
的抗性.
215 　分子标记辅助育种
如何提高育种的效率 ,一直是育种学家关注的问题 ,研
究的重点之一是利用目标性状与标记间的关联性进行标记
辅助选择. 周强等[52 ]提出捕食性节肢动物对信息化合物的
接受、识别和学习等行为及与这些行为相关的生理生化和分
了基础可作为对水稻挥发性化合物的进一步研究方向. 陈克
平等[4 ] 用 200 个 RAPD 随机引物进行扩增 ,获得了 OPB2
08850 和 OPB210917 两个与家蚕耐氟性有关的分子标记. 汪
林等[46 ] 筛选到一个与 K 基因有关的 RAPD 标记 OPV2
10700.苏松坤等[40 ]利用 RAPD 标记 ,估测蜜蜂性别决定位
点与低幼虫存活率位点的标记序列位置 ,构建了蜜蜂遗传连
锁图 ,确定了蜜蜂性基因位点、黑色体色基因位点、苹果酸脱
氢酶 I 位点 ,从而确定了影响蜜蜂采粉、报警信息素水平等
数量性状的基因座位. O’Donnell[31 ] 对劫掠蜂染色体组
DNA 进行了 RAPD 标记 ,评估了不同 RAPD 标记段得出的
劫掠蜂的遗传基因相似性. 对 20 个不同群体的随机性测试
表明 ,两个蜂群内的 RAPD 标记段特化性是非常恒定的.
Myburg等[28 ]应用 RAPD 分析来识别俄罗斯麦蚜抗性
基因 Dn2 的分子标记 ,有 2 700 个 RAPD 位置被筛选 ,用来
连接抗性基因座 ,其中有 4 个多态 RAPD 片段 (两个是耦合
相位 ,两个是排斥相位) 被鉴定为 Dn2 基因的 RAPD 标记.
通过 F 2 种群离析分析及分离抗性基因表明 ,这 4 种引物都
与 Dn2 基因座紧密相连 , F 2 种群的测序扩增区段 ( SCAR)
以及对其它的抗性或敏感性南方小麦的培育分析 ,更确证了
Dn2 抗性基因座的 RAPD 标记连锁 ,这些标记对抗性育种和
Dn2 基因辅助标记选择都有很大的帮助. Gadau 等[10 ] 用
RAPD 技术分析揭示出 ,单双倍体昆虫 N asonia vit ripennis
和 N1 gi raulti 雄性翅长不同. 应用数量性状等位基因 (Q TL)
全基因扫描分析表明 ,种间翅的不同主要是由于 Q TL 的影
响和等位基因的上位相互作用.
3 　RAPD 技术应用中的一些问题及对策
RAPD 标记是否可靠 ,可从序列同源性、结果重复性和
38418 期 　　　　　　　　　　　　　　胡艳红等 :RAPD 技术在昆虫学研究中的进展 　　　　　　　　　　　
系统学价值等三个方面来考察. 所谓序列同源性 ,是指 PCR
扩增产物经电泳分离后 ,具有相同迁移率的谱带具有序列同
源性 ;结果重复性 ,是指相同实验人员前后实验的结果是否
一致和同一实验在不同的实验室所获结果是否重复 ;系统学
价值则考察用 RAPD 标记构建的亲缘关系图谱与传统图谱
或 RFL P 图谱的相同或相似程度 1 共迁移谱带是否具有序
列同源性 ,这是 RAPD 技术可靠性问题的关键 [23 ,50 ] .
311 　重复性问题
RAPD 分析中重复性不太高的原因是在 PCR 反应中会
引起一些扩增产物的改变 ,及不同的研究者采用的程序、仪
器的类型不同. 如常用的离心管除有厚壁管和薄壁管之分
外 ,不同厂家的材料也有差异 ,因此不同研究者虽然设置的
反应程序相同 ,但由于使用的离心管差异较大 ,也可能影响
扩增产物[24 ] . Penner 等[31 ]认为 ,在相似反应条件下 ,特别在
保证管内反应温度一致的条件下 ,不同实验室试验结果可以
重复. RAPD 校正虽能通过调整模板 DNA 的用量 ,提高
RAPD 扩增的可重复性 ,但用依据少数几个引物所建立的标
准 RAPD 校正图谱 ,来校正模板 DNA 用量 ,对小样本而言还
是可行的 ,可对大样本而言 ,在多个引物的条件下实施起来
有很多困难. 另外 ,RAPD 实验结果的可重复性差的一个重
要原因是 ,在扩增反应过程中 ,引物的熔点值较低 ,反应易受
环境条件的影响 ,导致引物降解 ,扩增失败 [54 ] . 大多学者认
为 ,引物浓度对扩增影响不大. Bandi 等 [2 ]则认为 ,“饱和”浓
度可补偿试验误差 ,建议使用高浓度引物 ,如 60 mg·L - 1 . 为
了便于不同实验室间的结果比较 ,也有专家建议用不同的标
准引物 ,最常用的有测序引物 MB - 20、T7、T3、KpnR 及
Mc G1 等引物 ,这为该问题的解决提出了新的途径. 需要注
意的是 ,使用不同批次的引物 ,即使其它反应条件都保持一
致 ,也会有不同的结果.
为了克服 RAPD 重复性差的问题 ,应设置重复实验. 重
复性好是最重要的取舍指标 ,而带的强弱不应该作为取舍的
指标. 分析一个位点时 ,要作全面分析 ,若某一个体的全部带
均弱 ,其模板可能有问题 (浓度、分子量) ;若某一个体的大部
分带与其它个体强度一致 ,仅有一条或少数几条带弱 ,可能
存在拷贝数差异. 重复性不好的弱带 (无规律出现的带) 可能
由非专一性扩增、产物间退火或其它人为因素造成 ,不能记
录[41 ] . 因此 ,优化 RAPD 实验条件是增强其实验结果可重复
性 ,从而提高 RAPD 标记可靠性的有效手段. 实验条件优化
的关键是提高扩增的特异性 ,重要环节是建立合适的反应体
系和设置合适的反应程序. 从昆虫样品制备 DNA 模板是成
功地进行 PCR 的关健前提. 传统的苯酚 - 氯仿抽提法较复
杂 ,而且不能提取痕量样品的 DNA. Wen 等 [47 ]推荐了一种
适用于不同目昆虫的制备 DNA 的方法 ,能够成功地扩增不
同样品的基因 ,包括新鲜的、冷冻的、干的或者保存在酒精和
福尔马林中的样品 ,并且还能扩增核和线粒体的基因.
312 　序列同源性问题
31211 异源双链问题 　在研究蜜蜂中发现了异源双链相似
问题. 这种条带可以用单链核酸酶消除 ,也可以将电泳温度
提高到 60 度以上 ,使异源双链变性 ,以消除其影响.
31212 非孟德尔遗传的条带 　Hunt 等 [12 ]分析 ,在显示多态
性的非模糊条带中有 9215 %表现为孟德尔显性遗传 ,其余
的条带不符合孟德尔遗传 ,认为可能由不同的序列组成. 一
般试验中大多采用符合孟德尔遗传的条带进行分析 ,在连锁
图谱分析中 ,基因型错误可以部分消除 ,即在 F1 代或 1∶1 混
合物中没有出现的条带 ,在其父母本中应尽可能去掉.
31213 同一条带的同源性问题 　由于存在共迁移问题 ,在不
同个体中出现相同分子量的带后 ,并不能保证这些个体拥有
同源的片段 ;同时在胶上看见的一条带也有可能包含了不同
的扩增产物 ,因为所用的凝胶电泳类型 (一般是琼脂糖凝胶
电泳)只能分开不同大小的片段 ,而不能分开不同碱基序列
但有相同大小的片段 [21 ] . Thormann 用 RAPD 产物标记作探
针表明 ,在电泳结果的同一个带中 ,有可能存在序列不同而
分子量相同的几条带 ,RAPD 无法检测 ,这种可能在种内较
少发生 ,而在种间可能性较大. Castagna 用 RFL P 和 RAPD
进行研究 ,也得出了相同的结论.
31214 电泳分辨率问题 　电泳时 ,不同分子量的扩增产物可
能在电泳时没有分开而形成一条带 ,凝胶分离系统和基因组
的亲缘关系有可能提高这种概率. 一般而言 ,聚丙烯酰胺和
银染的分辨效果比琼脂糖和溴化乙铵要高 ,用较长 (可达到
20 cm)或浓度更高 (2 %)的琼脂糖凝胶有助于提高分辨率.
31215 显性标记问题 　RAPD 标记为显性标记 ,不能鉴别纯
合子和杂合子 ,易受反应条件的影响 ,稳定性较差. 解决的办
法之一是以测序扩增区段标记取代 RAPD ,即对特异 RAPD
条带进行克隆并测序 ,以测出序列一端的寡聚核苷酸引物 ,
以此引物进行基因组常规 PCR 扩增分析 [34 ] ;其二 ,使用该
法时要注意严格控制模板 DNA 和镁离子浓度以及反应条
件 ,以保证其扩增稳定性.
313 系统学研究中的问题
系统学是应用 RAPD 技术最为迅速的领域. 许多昆虫都
用 RAPD 作过亲缘关系分析 ,大部分结果和形态分类结果相
类似 ,仅有少数例外. 但是近年来 ,有人对其结果的可靠性提
出不同的看法 ,主要有以下几点 :1)值得注意的是 ,由于引物
的竞争性等 ,基因组的 RAPD 位点有时不能全部检出 ,造成
假象上的差异. 根据这种情况 ,RAPD 可以应用于种间乃至
近缘属之间关系的研究 ,但有一定的局限性. 由于不同种的
扩增产物难以作同源性分析 ,只能作表征分析 ,所以只能从
相似性或遗传距离上去分析亲缘关系 ,其结果可能与真实的
系统关系不同 ,这是由实验条件不当所造成的 ,可以通过多
次重复试验加以克服. 2)因 RAPD 在种间或属间的变异水平
很高 ,样品的代表性是一个较大的问题 ,即利用某一个体代
表一个种或用一个种代表一个属都可能造成偏差. 因而 ,最
好能找到群体特异或种特异性的条带. 3)在表征分析中另一
个值得注意的问题是 ,一些 RAPD 产物的出现存在相关关
系 ,即一个位点与另一个位点相连锁. 若将这个差异单独计
算 ,相当于对某一性状极度加权. 4) 在系统发育学分析中 ,
RAPD 条带具有显性的遗传特征 ,多态性信息量较低. 这样
4841 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
估算的基因多样性值的标准差 ,理论上会比有多个核基因蛋
白座位的大. 其非编码区在一些昆虫类群中的进化速度很
快 ,因此做种上水平研究时 ,将会影响结果的准确性 ,但对种
下水平影响较小. 有些昆虫存在着趋同进化和趋异进化的情
况 ,因此用 RAPD 作系统分析 ,应结合其它方法 ,结果才更有
说服力[17 ] .
4 　结 　　语
由于 RAPD 技术可以对整个基因组作地毯式的多态分
析 ,所以其灵敏程度可以与 DNA 序列分析和 DNA 指纹媲
美 ,同时 RAPD 技术还可以和其它 DNA 分子技术结合 ,这样
就大大扩展了分子生物学技术的应用范围. 综上所述 ,
RAPD 技术在昆虫学研究中有着广泛的应用前景 ,而且它的
前景随着技术和统计方法的完善将变得更加广阔. 每一种技
术和方法都有其优势和缺陷 ,只有仔细研究 ,在实际运用中
注意取长补短 ,才能发挥出其最大的作用. RAPD 技术也是
如此 ,对此进行的一系列研究 ,会使 RAPD 技术日益成熟和
完善 ,并在人类认识自然生命现象中发挥更大的作用.
参考文献
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作者简介 　胡艳红 ,女 ,1978 年生 ,硕士研究生 ,主要从事昆
虫分子生物学研究. Tel : 0451282163086 ; E2mail : huyan2
hong1024 @Yahoo. com. cn
6841 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷