全 文 ：北京大学学报(自然科学版) ,第 38 卷, 第 6 期, 2002 年 11 月
Acta Scientiarum Naturalium
Universitatis Pekinensis, Vol. 38, No. 6 (Nov, 2002)
1) 国家自然科学基金资助项目( 39830050, 39970044)
2) 通讯联系人
收稿日期: 2001- 12- 14; 修回日期: 2002- 05- 29
基于 RAPD标记的我国水青冈属
植物的分类研究1)
吉成均 沈海花 方精云2)
(北京大学城市与环境学系,北京大学地表过程分析模拟教育部重点实验室,北京, 100871)
谢长富
(台湾大学植物学系 ,台北, 106)
樊拥军
(南开大学生命科学学院,天津, 300071)
摘 要 应用随机引物扩增多态性 DNA( RAPD)方法, 对我国水青冈属( Fagus L . ) 6 种植物,即巴山
水青冈(F . pashanica )、长柄水青冈( F . longipetiolata )、米心水青冈( F . engleriana )、亮叶水青冈 ( F .
lucida )、台湾水青冈( F . hayatae )和浙江水青冈 ( F . hayatae var . zhejiangensis)进行基因组多态性分
析,选用 80个随机引物进行扩增,其中 56个引物扩增出清晰可重复的条带,片段大小在 250~ 3 050
bp之间。采用 UPGMA法对求出的遗传片段进行聚类分析。结果显示:台湾水青冈、巴山水青冈和
浙江水青冈的遗传距离较近,表明它们可归并为一种。这与我国水青冈属的生态解剖学研究结果
完全一致。根据结果将我国水青冈植物归并分为 4 种:长柄水青冈、米心水青冈、亮叶水青冈、台
湾水青冈(包括巴山水青冈和浙江水青冈)。
关键词 水青冈; RAPD技术; 遗传距离
中图分类号 Q 947
0 引 言
水青冈属( Fagus . L)是壳斗科中较原始的属[ 1] ,该属植物广布于北半球的温带区域, 是温
带落叶阔叶林的主要建群种之一。关于水青冈属植物的系统分类, 在种数上存在较大的不确
定性(如:中国高等植物图鉴中记载,全球有 10~ 14种, 我国 6种 1 亚种; Shen 认为全球有 13
种,我国 8种;张永田等指出全球有 10~ 12种,我国 5~ 7种等) [1~ 5 ] , 因而确定水青冈的种数是
植物学和生态学研究的一个首先要解决的基本问题。
关于水青冈属植物的系统分类,以往的研究多是依据一些形态学指标如叶片、壳斗、表皮
毛的大小和形态 [2, 3, 5]。由于植物的许多表型性状是由基因型和环境条件共同作用形成的,其
形态特征很大程度上受环境条件的影响,这使得利用以 DNA为基础的分子标记来鉴定种和品
种变得更为重要 [6]。RAPD技术是20世纪 90年代在 PCR反应基础上发展起来的一种分子标
记技术 [7] ,它使用单一随机引物进行基因组 DNA体外扩增, 扩增产物电泳分离后, 经 EB染色
DOI：10.13209/j.0479-8023.2002.142
就可直接检测扩增 DNA片段的多态性 [8]。由于它不需要 DNA克隆、Southern转移或带标记的
DNA探针杂交,因而具有快速、简便的特点, 并且 RAPD技术不受植物组织和发育阶段的影响,
具有较高的稳定性和可靠性[9 ]。前人工作表明:在群体到种甚至属水平检测核酸变异和群体
分化方面, RAPD是一种快速、准确、灵敏的技术 [10~ 13]。本文利用 RAPD 方法对我国的 6种水
青冈进行分析, 以期为探讨国产水青冈植物的亲缘关系提供分子水平的证据。
1 材料与方法
111 材料的获取
研究所用材料取自我国的四川、贵州、湖北、浙江、广西及台湾等地(见表 1)。巴山水青
冈、长柄水青冈、米心水青冈、亮叶水青冈在我国分布范围较广, 研究所用材料取自其主要分布
地;台湾水青冈和浙江水青冈研究材料取自我国仅有的两个分布地区台湾和浙江。在我国,水
青冈多分布于深山偏远地区, 交通不便,不易采集,因而我们采用 Chase& Hills的方法[14] ,在每
种水青冈主要分布区的自然种群中,选取不同大小的树木 3株,采集生长健康的叶片在取样地
点用硅胶及时干燥, 运回实验室,在干燥器内室温保存。
表 1 水青冈的种类和产地
Table 1 List of species and locality of samples
种 名 代 号 地 点 经度PbE 纬度PbN 海拔Pm
亮叶水青冈 GF1-A 贵州梵净山 108177 27185 1260
亮叶水青冈 GF2-A 贵州梵净山 108177 27185 1320
亮叶水青冈 GF3-A 贵州梵净山 108177 27185 1480
亮叶水青冈 GF4-A 贵州梵净山 108177 27185 1540
亮叶水青冈 GF5-A 贵州梵净山 108177 27185 1620
亮叶水青冈 SN-A 四川南江 106185 32160 1980
亮叶水青冈 GL1-A 贵州雷公山 108125 26138 1300
亮叶水青冈 GL2-A 贵州雷公山 108125 26138 1720
巴山水青冈 ZL1- B 浙江临安 118193 30117 950
巴山水青冈 ZL2- B 浙江临安 118193 30117 1050
巴山水青冈 HS- B 湖北神龙架 110143 31147 1860
巴山水青冈 HX- B 湖北兴山 110172 31127 1570
巴山水青冈 SN- B 四川南江 106190 32163 1440
台湾水青冈 TY1- C 台湾玉山 120197 23145 1650
台湾水青冈 TY2- C 台湾玉山 120197 23145 1700
浙江水青冈 ZY-D 浙江永嘉 120173 28158 900
长柄水青冈 ZT1- E 浙江天台山 121103 29125 450
长柄水青冈 ZT2- E 浙江天台山 121103 29125 500
长柄水青冈 GF1- E 贵州梵净山 108177 27185 720
长柄水青冈 GF2- E 贵州梵净山 108177 27185 820
长柄水青冈 GF3- E 贵州梵净山 108177 27185 900
长柄水青冈 GF3- E 贵州梵净山 108177 27185 1000
长柄水青冈 GF4- E 贵州梵净山 108177 27185 1200
长柄水青冈 GF5- E 贵州梵净山 108177 27185 1260
长柄水青冈 GF6- E 贵州梵净山 108177 27185 1350
818 北 京 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 38 卷
续表 1
种 名 代 号 地 点 经度PbE 纬度PbN 海拔Pm
长柄水青冈 GY1- E 广西元宝山 109113 25138 1020
长柄水青冈 GY2- E 广西元宝山 109113 25138 1380
长柄水青冈 ZS- E 浙江态顺 119170 27167 1250
长柄水青冈 ZQ1- E 浙江庆元 119110 27175 950
长柄水青冈 ZQ2- E 浙江庆元 119110 27175 1120
长柄水青冈 HX- E 湖北兴山 110172 31127 1570
米心水青冈 HS1-F 湖北神龙架 110137 31147 1750
米心水青冈 HS2-F 湖北神龙架 110137 31147 1810
米心水青冈 SN1-F 四川南江 106190 32163 1440
米心水青冈 SN2-F 四川南江 106190 32163 1680
米心水青冈 SE-F 四川峨嵋 103147 29160 2300
米心水青冈 SD-F 四川都江堰 103157 31115 2300
112 基因组 DNA的提取
参照 Dellaporta 的方法[15 ] , 提取 2~ 3 g植物幼嫩叶片的基因组 DNA,溶解于 1mL TE 缓冲
液中,加入 50 LL 3molPLNaAc和 100mL1% CTAB,室温下放置 20min, 4 e 10 000 rPmin离心 10
min, 加入 115mL 70%乙醇洗 2次, 晾干沉淀后溶于 400 LL TE缓冲液,再加入 50 LL 3 molPL
NaAc和 1mL无水乙醇。 - 20 e 沉淀 30min, 4 e 10 000 rPmin离心 15 min,晾干沉淀后溶于 200
LL dd H2O中。
113 PCR反应体系
反应体积25LL, 包括H2O 1717LL,模板2LL, PCR缓冲液215LL, 200LmolPL dNTP 1LL, 200
LmolPL引物 1 LL, 3Utaq酶 013LL, 5Upfu 015LL
114 PCR扩增
扩增反应在Perkin Elmer 2400型PCR仪上进行。反应程序: 94 e 预热2min后, 94 e 1min,
37 e 1min, 72 e 2min,反应 45个循环, 72 e 10min,产物经 116%琼脂糖凝胶电泳, EB染色,紫
外灯下观察并照相。
115 数据分析
不同物种间随机扩增多态 DNA片段相似性计算依据 Nei等的公式[16 ] :
F = 2NXY ( NX + NY) ,
其中 F 为共享度, NXY为物种X 和物种Y所共有的片段数, NX 和NY 分别为物种X和物种
Y所拥有的片段数,任意两个物种间的遗传距离( P )根据两个物种的共享 RAPD片段相似性
F 来计算, 即: P= 1 - F。根据遗传距离采用不加权算术平均法( unweighted pair group method
with arithmetic mean,UPGMA)进行聚类分析, 构建树系图。
2 结果与讨论
对Operon公司的 A、D、F、Y 4组共 80个 10 bp的随机引物进行扩增,其中 56个引物扩增
出完整、清晰且可检出变异的条带(表 2)。每个引物扩增出 3~ 11个明显的条带,只统计清晰
的带做进一步计算。56个引物共扩增出 377个条带。图 1显示引物OPA-08, OPD-19扩增产物
819 第 6 期 吉成均等: 基于 RAPD标记的我国水青冈属植物的分类研究
电泳条带。
表 2 可扩增出明显条带的引物
Table 2 primers used in RAPD analysis
引物 序 列 引 物 序 列 引 物 序 列
OPA01 5c-CAGGCCTTC- 3c OPD05 TGAGCGGAGA OPF20 GGTCTAGAGG
OPA02 TGCCGAGCTG OPD08 GTGTGCCCCA OPY01 GTGGCATCTC
OPA03 AGTCAGCCAC OPD10 GGTCTACACC OPY02 CATCGCCGCA
OPA04 AATCGGGCTG OPD12 CACCGTATCC OPY03 ACAGCCTGCT
OPA05 AGGGGTCTTG OPD13 GGGGTGACGA OPY04 GGCTGCAATG
OPA06 GGTCCCTGAC OPD18 GGTGCGCGAA OPY05 GGCTGCGACA
OPA07 GAAACGGGTG OPD19 TGTCGACCGA OPY06 AAGGCTCACC
OPA08 GTACGGTAGG OPD20 ACCCGGTCAC OPY08 AGGCAGAGCA
OPA09 GGGTAACGCC OPF01 ACGGATCCTG OPY09 AGCAGCGCAC
OPA10 GTGATCGCAG OPF03 CCTGATCACC OPY10 CAAACGTGGG
OPA11 CAATCGCCGT OPF04 GGTGATCAGG OPY12 AAGCCTGCGA
OPA12 TCGGCGATAG OPF06 GGGAATTCGG OPY13 GGGTCTCGGT
OPA13 CAGCACCCAG OPF07 CCGATATCCC OPY14 GGTCGATCTG
OPA15 TTCCGAACCC OPF09 CCAAGCTTCC OPY15 AGTCGCCCTT
OPA16 AGCCAGCGAA OPF10 GGAAGCTTGG OPY17 GACGTGGTGA
OPA17 GACCGCTTGT OPF11 TTGGTACCCC OPY18 GTGGAGTCAG
OPA19 CAAACGTCGG OPF14 TGCTGCAGGT OPY19 TGAGGGTCCC
OPD01 TGGACCGGTG OPE15 CCAGTACTCC OPY20 AGCCGTGGAA
OPD03 GTCGCCGTCA OPF18 TTCCCGGGTT
11 GF1- A; 21 ZL1- B; 31 TY1-C; 41 ZY- D; 51 GF1-E; 61 HS1-F; 71 G. 其中 A:亮叶水青冈;
B:巴山水青冈; C:台湾水青冈; D:浙江水青冈; E:长柄水青冈; F:米心水青冈; G:对照
图 1 6种水青冈基因组 DNA用随机引物 OPA-08, OPD-19扩增产物电泳图
Fig. 1 The electrophoretic patterns of RAPDs from six Fagus species amplified with primers OPA-08, OPD-19
根据Nei的公式[16 ] ,作者计算了 6种水青冈之间的遗传距离指数(表 3) ,并构建了树系图
(图 2)。
UPGMA聚类结果表明:巴山水青冈和浙江水青冈的遗传距离最近, 台湾水青冈、浙江水青
冈和巴山水青冈的遗传距离较近。亮叶水青冈和米心水青冈、长柄水青冈的遗传距离相对较
远,而和台湾水青冈、巴山水青冈、浙江水青冈的遗传距离较近;米心水青冈和长柄水青冈的遗
传距离较近,而与其他水青冈的遗传距离较远。6种水青冈根据遗传距离结果可分为 2组,长
820 北 京 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 38 卷
柄水青冈和米心水青冈为一组,其余的为另一组。
图 2 根据遗传距离, 用 UPGMA
方法得到的树系图
Fig. 2 Dendrogram based on the gen-
etic distance matrices with the
method of UPGMA
表 3 6 种水青冈间的遗传距离( 1 - F )
Table 3 The genetic distance among six species of Fagus( 1 - F )
种 名 F .hayatae F .hayatae var
zhejiangensis
F .pashanica F . lucida F .engleriana
F . hayatae var .
zhejiangensis 0113
F . pashanica 0117 0111
F . lucida 0127 0125 0124
F . engleriana 0155 0149 0150 0141
F . longipetiolata 0138 0131 0143 0136 0126
水青冈属植物的亲缘关系, 已有一些报道[1~ 5,17 ] , 但存在
较大的争议。除米心水青冈从形态(尤其是多为丛生)、树干、
果实以及叶形态解剖特征等方面容易与其他水青冈种类分开
以外,其余水青冈在形态、解剖特征上较为类似,不易区分, 特别是巴山水青冈和浙江水青冈的
归属问题。巴山水青冈自从杨钦周 1978年发现并定名该种之后, 曾得到分类学界的广泛认
同[1~ 3 ] ,但Shen [4]则将其归为台湾水青冈的一个变种,最近出版的5中国植物志6 [5 ]则将其归为
台湾水青冈(包括浙江水青冈)。因此, 它是否是一个独立的种一直存在争议。浙江水青冈仅
分布在永嘉四海山的一个窄长地带,该地地势险陡、土层较浅而瘠薄,无论在分布立地、外貌和
解剖特征上与巴山水青冈都十分相似[18]。解剖研究发现:巴山水青冈、浙江水青冈、台湾水青
冈的叶表面特征十分相似 [17 ]。RAPD聚类分析表明:台湾水青冈、浙江水青冈、巴山水青冈的
遗传距离很近。因此,作者赞同5中国植物志6的观点, 主张将台湾水青冈、浙江水青冈、巴山水
青冈其归为一种。长柄水青冈、米心水青冈种内各个居群间遗传距离相对较大,这可能与其取
样范围广,海拔、降水等环境因子的变化幅度大有关。依照 RAPD分析结果,将水青冈分为两
组,一组包括长柄水青冈和米心水青冈, 另一组为亮叶水青冈和台湾水青冈(包括浙江水青冈
和巴山水青冈)。
北京大学城市与环境学系费松林、陈安平、朴世龙等同学参与材料的野外采集, 北京大学
生命科学学院叶波平博士参与部分实验工作,在此一并致谢。
参 考 文 献
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RAPD Analyses of Fagus Species in China
JI Chengjun SHEN Haihua FANG Jingyun
( Department of Urban & Environmenta l Science , MOE Laboratory for Earth surface processes,
Peking University, Beijing, 100871 )
XIE Changfu
(Department of Botany, National Taiwan University, Ta ibei, 106 )
FAN Yongjun
( College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin, 300071 )
Abstr act Random amplified polymorphic DNA ( RAPD) technique was applied to assess six Fagus species in
China. Fifty- six of eighty tested arbitrary primers generated obvious bands with size ranging from 250 to 3 050 bp.
An index of genetic similarity( F )was calculated and the value of (1 - F ) was used to evaluate genetic distances
between species to construct dendrogram. The result suggested that three species, F . pashanica , F . hayaatae and
F . hayatae var . zhejiangensis, had closer relationship and should be clustered into a single species. This was in
good agreement with our morphological work. Based on RAPDmarkers, we suggested that Chinese beech species
should be divided into four species, F . longipetiolata , F . engleriana , F . lucida and F . hayaatae ( including
F . pashanica and F . hayatae var . zhejiangensis) .
Key words Fagus; RAPD technique; genetic distance
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