全 文 ：贵州农业科学 1 9 9 5年第 4期
0 .组 hou A g ir cu l ut ar l S e i e cn e s
应用R A P D技术证实节节麦和光俘
野燕麦的六倍体与八倍体杂种
张立异 江龙
贵州农学院麦作研究中心
张庆勤
贵阳 5 5 0 0 2 5 )
摘 要 本文采用 R A PD技术对节节麦 、 光释野燕麦及其杂交后代进行分析 , 目的是为了对它
们进行分子标记 , 确定杂种的真实性。 本次实验共选用 72 个随机引物对节节麦 、 光程野燕麦及其
杂种进行一次性 “ 扫描 , , 发现有 37 个引物能够扩增出节节麦和光俘野燕麦特异的多态性D N A片-
段 , 其中包括只在节节麦和杂种中出现的特异 D N A片断 ,只在光释野燕麦和杂种中出现的特异 D N A
片断 , 以及同时出现在节节麦和光释野燕麦的特异性 D N A片段 。 第一种情况约占 29 % , 第二种情
况约占17 % ,第三种情况约占5% 。
关 . 词 R A P D技术 添加系 分子标记
限制性片断长度多态 性 . ( R e s t r i e t i o n f r a g m e n t l e n g t h p o ly m 。 r p h i s m , R F L P ) 和
随机扩增多态性 的 D N A ( R a n d o m a m p l i f i e d p o l y m o r p h i e D N A , R A P D ) 是 用 于 检 测
D N A序列多态性的技术 , 即为进行遗传标记的方法 。 R F L P是应用限制性内切酶 将 基 因 组
D N A内切成不同长度 , 然后 用同位素标记的探针检测给定位点的长 度 多 态 性 的 同 源 性 。
R A P D方法是用一 个随意序 列的 1。个寡聚核普酸 作为聚合酶链式反应 ( P 。】y m o r “ s “ C h “ i n
R e a e t i o n , P C R ) 的引物 , 扩增的多态性 D N A 片断 , R A P D方 法 ( W i l l i a m s e t a l . 1 9 9 o )
同于随意引物的 P C R ( A r b i t r a r y p r im e d P C R , A P 一 P C R ) ( W e l s h a n d M e C l e l l a n d
1 9 9 0)
, 较之 R F L P , 是一种快速而简便的技术 。 目前巳广泛应用于遗传作 图 ( R e i t e r , e t
a l
。 1 9 9 2 )
, 外源染色体的检测 ( Q z i a s 一 A k i n s e t a l 。 1 9 9 3 ) , 种属特异性及物种演 化 ( S u s a n .
EW l l k i
e . 1 9 9 3 ) ( I
s m a i l D w e i k a t
.
1 9 9 3 ) 的研究 。 在小 麦 中 , 用 R A P D方 法 鉴 定 外 源
D N人通 过 添 加 和 替 换 进入小麦染色体中 , 或者外源 D N A片断通过易位 、 重组等的基因渗
入 , 都已得到证实 ( K 。 M . D e v o s a n d M . D 。 G a l e 1 9 9 2 ) 。
节节麦 ( A e。`忍娜 t a。 比`以 C r o s s . ) S e h 。 Z n = Z X = 14 )与光俘野燕麦 ( A ve n a f a t u a . L v a r ,
g lab
r a at
.
aP t Z
n = 6 x = 42 )分属 于小麦族和燕麦族 , 节节麦作为母本与光俘野燕麦作为父本
直接杂交成功 , 而且 F :代自然加倍后能自然结实 , 结实率较高 , 籽粒饱满 , 目前 巳 传 代 到
F
`代 。 从外形上比较 , 它既不同于节节麦 , 更与光俘野燕麦有很大的差异 , 从细 胞 学 上 分
析 , 光俘野燕麦的染色体作为添加系全部进入节节麦染色体中 , 它的染色体数为 s n = 8 x 7 =
5G (张庆勤 , 19 9 3 ) , 我们称之为节燕八倍体 , 而从节燕八倍体中分离出的普通小麦型 , 其
染色体数 目为 6 n = 6 x 7 = 42 , 它的外形也有很大的改变 , 同普通小麦类似 , 我们称它为·节燕
六倍体 , 这次将它们一起进行 R A P D分析 , 目的是证实它们的真实性 , 这对以后的研究和应
用都会有很大的帮助 。
收稿日期 1 , 9 5刃 4 j 2 2
1, 9 5年第 4 期
1 实验材料与方法
1
.
1 材料
节节麦 ( A e g￡10 ; 5 t a u s c h ii ( C r o s s . ) S e h . Z n 二 2 又 = 1 4 ) 2 9 5 7年 引自山西小麦研究所 。
光俘野燕麦 ( A , e “ a f a t u a L . v a r . g l a b r a t a P a t . Z n 二 6 又 = 4 2 ) , 1 9 7 5年采 自黑龙 江通
北镇 。
杂种节燕八倍体 、 节燕六倍体 。
1
.
2 D N A 纯化
大约 5 9的叶片 , 用液氮在乳钵中充分磨碎 ,加入 1 6 m l提取液 [ l o o m M T r i s 一 H e l , p H s . o ,
5 0 m M E D T A
, p H S
。
0 , 5 0 0m M N a C I
, 1
.
2 5 % S D S ( w /
v ) 〕 , 在 6 5℃温 育 1 0~ 1 5m i n ,
然后加入 s M P o t a s s i u m a e e t a t e 5 m l , 摇 匀 , 放置于冰上 2 0m i n , 离心 2 0m i n , 取上清 液到一
新的离心管中 , 加入 2邝体积的异丙醇 , 捞出 D N A , 用70 %的酒精洗两次 , 千燥后 , 溶 解于
T E中 ,再加入 R N A酶 , 使其最终浓度达到 10 m g加 l , 在室温中放置 20 m i n 。 用已知浓度的 标准
D
、 , , 、 ~ ~ 二。 。 、 , ` 、 , L , _ 一 。 一 ~ _ _ , _ 、 _ ~ _一 一 一 ~ ` _ 二~ … _ _ … ` . _ 、 , ` 二 、 , _ 一刀N A 与提取 的D N A进行 电泳 , 使用 0 . 8 %琼醋糖 , E B染色后在紫外灯下比 较出D N A 的 浓度
大小 。
1
.
3 R A P D 分析
反应条件是在 Wil ia m s等 ( 19 9 。 ) 的基础上 , 稍微修改而成 。 反应总体积为 25 闪 , 其中
包括 Z o n g的模板 D N A , Z o o n m 的随机引物 ( O p e r o n ) , 1 0 0林m 的 4 种 d N T P ( P r o m g a ) ,
1
.
2 5U 的 T A G 聚合酶 (遗传所 ) , l x 的反应缓 冲液 ( z o m M T r i s 一 H e l , p H s . 3 , s o m M K C I ,
15 m M M g CI )
, 每个反应管加上 3 0闷的石蜡油 , P C R反应在 P E 一 48 0热循环仪 (美 国 ) 上 完
成 。 开始 5个循环为 9 7 O C l m i n , 3 6 O C l m i n , 7 2 O C Zm i n 。 接下来进行 4 0个循 环 : 9魂o C l m i n ,
3 6
O
e l m i n
, 7 2
O
e Zm i n
。 最后在 , Z O e保持 i o m i n 。 扩增产物在 1 . 4%的琼醋糖上 电泳 , 电 压
为 7 V / c m , 电泳缓冲液为 1 x T B E , 电泳后用 E B染色 2 0分钟 , 紫外灯观察并照相 。
2 实验结果及分析
基因组 D N A 的 P C R反应 , 随机选用了 A , B , H , F , N , M , V , O , Q , K 等试 剂盒
共 72 个引物进行扩增 , 大部分 引物都能扩增出特异的 D N A 片段 , 多态性的 D N A片断的分子
量约为 。 . 5~ Z K b , 其中有 “ 个 引物扩增的产物有多态性 , 经过多次 (5 次以上 ) 重复 , 结果
重复性较好 , 实验结果与我们预计的相符 , 经过电泳观察可分为 3种类型 : ( 1) 亲本特异带
在杂交后代中同时出现 , 这样的引物有 4个 , 约占 5 % , 它 们是 O P K 09 、 O P Q 04 、 O P Y 01 、
O P N 0 4
,如图 1 、 2所示 , 我们可以看到节节麦和光释野燕麦特征带都能在节燕八倍体和 节燕
六倍体中找到 ; (2 )燕麦的特异性片断出现在杂交后代中 , 这样的引物有 12 个 , 约 占 17 % ,
图中所示有 4个 : O P Q 07 、 O P O 1 5 、 O P N 1 2 、 O P A 18 , 我们可以看到光释 野燕麦的特征片
断 出现在节燕八倍体和节燕六倍体 , ( 3) 节节 麦的特异性片断出现在杂交后代中 , 这样的
引物有 2 1个 , 约占2 9 % , 如图 1 、 2中的引物 O P K o g 、 O P Q o 4 、 O P N 0 4就扩增 出现这样的片
段 。 从上我们可以得出这样的结论 : 节节麦 、 燕麦和它们的杂交后代有着 同源性 , 也就是说
我们基本上肯定节燕八倍体和节燕六倍体是节节麦和光释野燕麦杂交的真实杂种 。
1, 9 5年第 4 期
1 实验材料与方法
1
.
1 材料
节节麦 ( A e g￡10 ; 5 t a u s c h ii ( C r o s s . ) S e h . Z n 二 2 又 = 1 4 ) 2 9 5 7年 引自山西小麦研究所 。
光俘野燕麦 ( A , e “ a f a t u a L . v a r . g l a b r a t a P a t . Z n 二 6 又 = 4 2 ) , 1 9 7 5年采 自黑龙 江通
北镇 。
杂种节燕八倍体 、 节燕六倍体 。
1
.
2 D N A 纯化
大约 5 9的叶片 , 用液氮在乳钵中充分磨碎 ,加入 1 6 m l提取液 [ l o o m M T r i s 一 H e l , p H s . o ,
5 0 m M E D T A
, p H S
。
0 , 5 0 0m M N a C I
, 1
.
2 5 % S D S ( w /
v ) 〕 , 在 6 5℃温 育 1 0~ 1 5m i n ,
然后加入 s M P o t a s s i u m a e e t a t e 5 m l , 摇 匀 , 放置于冰上 2 0m i n , 离心 2 0m i n , 取上清 液到一
新的离心管中 , 加入 2邝体积的异丙醇 , 捞出 D N A , 用70 %的酒精洗两次 , 千燥后 , 溶 解于
T E中 ,再加入 R N A酶 , 使其最终浓度达到 10 m g加 l , 在室温中放置 20 m i n 。 用已知浓度的 标准
D
、 , , 、 ~ ~ 二。 。 、 , ` 、 , L , _ 一 。 一 ~ _ _ , _ 、 _ ~ _一 一 一 ~ ` _ 二~ … _ _ … ` . _ 、 , ` 二 、 , _ 一刀N A 与提取 的D N A进行 电泳 , 使用 0 . 8 %琼醋糖 , E B染色后在紫外灯下比 较出D N A 的 浓度
大小 。
1
.
3 R A P D 分析
反应条件是在 Wil ia m s等 ( 19 9 。 ) 的基础上 , 稍微修改而成 。 反应总体积为 25 闪 , 其中
包括 Z o n g的模板 D N A , Z o o n m 的随机引物 ( O p e r o n ) , 1 0 0林m 的 4 种 d N T P ( P r o m g a ) ,
1
.
2 5U 的 T A G 聚合酶 (遗传所 ) , l x 的反应缓 冲液 ( z o m M T r i s 一 H e l , p H s . 3 , s o m M K C I ,
15 m M M g CI )
, 每个反应管加上 3 0闷的石蜡油 , P C R反应在 P E 一 48 0热循环仪 (美 国 ) 上 完
成 。 开始 5个循环为 9 7 O C l m i n , 3 6 O C l m i n , 7 2 O C Zm i n 。 接下来进行 4 0个循 环 : 9魂o C l m i n ,
3 6
O
e l m i n
, 7 2
O
e Zm i n
。 最后在 , Z O e保持 i o m i n 。 扩增产物在 1 . 4%的琼醋糖上 电泳 , 电 压
为 7 V / c m , 电泳缓冲液为 1 x T B E , 电泳后用 E B染色 2 0分钟 , 紫外灯观察并照相 。
2 实验结果及分析
基因组 D N A 的 P C R反应 , 随机选用了 A , B , H , F , N , M , V , O , Q , K 等试 剂盒
共 72 个引物进行扩增 , 大部分 引物都能扩增出特异的 D N A 片段 , 多态性的 D N A片断的分子
量约为 。 . 5~ Z K b , 其中有 “ 个 引物扩增的产物有多态性 , 经过多次 (5 次以上 ) 重复 , 结果
重复性较好 , 实验结果与我们预计的相符 , 经过电泳观察可分为 3种类型 : ( 1) 亲本特异带
在杂交后代中同时出现 , 这样的引物有 4个 , 约占 5 % , 它 们是 O P K 09 、 O P Q 04 、 O P Y 01 、
O P N 0 4
,如图 1 、 2所示 , 我们可以看到节节麦和光释野燕麦特征带都能在节燕八倍体和 节燕
六倍体中找到 ; (2 )燕麦的特异性片断出现在杂交后代中 , 这样的引物有 12 个 , 约 占 17 % ,
图中所示有 4个 : O P Q 07 、 O P O 1 5 、 O P N 1 2 、 O P A 18 , 我们可以看到光释 野燕麦的特征片
断 出现在节燕八倍体和节燕六倍体 , ( 3) 节节 麦的特异性片断出现在杂交后代中 , 这样的
引物有 2 1个 , 约占2 9 % , 如图 1 、 2中的引物 O P K o g 、 O P Q o 4 、 O P N 0 4就扩增 出现这样的片
段 。 从上我们可以得出这样的结论 : 节节麦 、 燕麦和它们的杂交后代有着 同源性 , 也就是说
我们基本上肯定节燕八倍体和节燕六倍体是节节麦和光释野燕麦杂交的真实杂种 。
1 95 9年第 4期 . 1 1.
今 考 文 献
1 1 5皿 i l Dwe ik at, S a l l y M , M o r .l i , L , H e户b e r t o , e t a l 。 T h eo r pA p l G e cn t , 功9 3 ( 8 5 ) 497 ~ 5 0 5
Z K
。
M
。
D o v o s a n d M
。
D
。
G
a l e
,
T h o o :
3 Q z i a s一 A k i n , P
,
L u b b e r , E L
,
H a n n 。
AP P I
W W
,
G en e t 1 9 9 2 ( 84 ) 弓6 7~ 5 7 2
e t a l
.
T h e o r A PP I OG
n e t
,
1 9 9 3 ( 85 )
: 6 2 3
R e i t o r R S
,
丫V e l , h J -
W i l l i
a m , J
,
F e l dm a n
M
e C l e l l a n d M
。
N u e l e又e
K
, e t a l
。
P .I o e
。
N a t l
.
S e i
。
U S A
,
1 9 9 2 ( 8 9 )
: 1 4 7 7~ 1 4 8 1
A e j d
, R e g 1 9 0 ( 1 8 ) 7 2 1 3~ 7 2 18
6 W i l l i a m
s J G
。
K u b e l i k A R
,
L i v a k K J
, e t a l
。
1 9 9 0 ( 1 8 ) 6 53 1~ 6 5 3 5
, Z h邵 19 Q . Q , S e o d 1 9 9 3
8 C r o w h u r , t R N
,
H . w t h o :助 B T , R i k k e r i n k E H A . e t a l . C u r r e n t G e n , t i e s 19 91 , ( 2 0 ) : 3 9 1
9 E e h t C S
,
E r da h l L A
,
a
nd M
e
oC y T J
.仇n 几m , , 灼 9 1 , ( 3引: 8 4
S T UD Y O N HYB R!D B ET W EEN A EG ILO P S T AU SC H!! A ND
A V EN A F A T UA B Y U SING RA PD ME T HOD
Z h a n g L i y i J i a n g L o n g Z h a n g Q i n g q i n
( G u i z h o o A g r i e . l t “ r a l C o l l . g . , G “ i少 “ . 9 5 50 02 5 )
A B ST RA C T
T h e r a dn o m a m p l i f i e d p o l y m o印 h i e D N A ( R A p T ) a n a l y s is w a s u s e d f o r p r o v i昭 t h e
t r u 止 o f a dd i t i on l i n e b e t w e e n A e g艺Zo p s t a u s e h i汇 a n d A , e冷 a f a t u a iw t h 7 2 r a n d o m
p r im e sr
.
oF
r t y o f s e v e n t y t e s t e d p r im e r s a m p xi f i e d t h e p o l y m o r p h i e D N A i n a d d i t i o n 一i n e . T b e
s
am
e r e s u l t s aw
s o b t a i n e d i n 泣o r e f i v e er p一i e a t so n s . T h e s i t u a ti o n w h i e h t h e 州丫口。印 h i e
D N A a即 e a r de i n A e g i忍。那 t a “ s e孔i玄 a n d t h e a d i it o n l i n e aw s 2 9 % , t h e s e e o dn s t iuat t io n
w h i e h t h e p o 一帅 o r p h i e D N A a即 e a r e d i n A v a n e f a t“ a a n d t h e a dd i t io n 一i en wa s 1 7% , t h e
t hi r d s i tu a t io n w h i e h t h e 妙 1帅。印h i e n N A a即 e a r e d sn A e g i王o p s t a u e h￡玄, A , e n a f a t u a a n d
th e ad d i t io n l i n e s j功 u l at n e ous ]
y w o s s %
.
5 0 t h i s m e t h o d w a s u s e f u l t o p r o v e t h e
p r od u e t i on o f w h e a t / a l i o n e h r o m : o m o a dd i ti o n a n d s u b s ti t u t i o n l i n e
.
K E Y W O R D S
:
R A P D , a dd i ti o n , m o l e e u l a r m a r k e r
更正 :
《 贵州农业科学 》 1 9 95年第 3期 《 光合微肥应用于水稻生产的肥效试验初报 》 一文的内容:
1
.
P47 1
.
2
。
2条第2行第1字漏掉 ` 理 , 。
2
.
P 48 2
.
1条倒数第2行倒数第 2字 “ 减 , 改为 “ 增 , 。
3
。
P 48 2
.
2条第4行 . 1 。 7% ~ 弓。 4%及0~ 3 . 9 9 , 改为 . 0~ 3 。 9 9及 1。 7% ~ 5 。 4% ’
2
.
2条第 S行 “ 一 1 。 1% ~ 3 。 4及一 2 。 2~ 0 . 犯 , 改为 一 2 . 2~ O。 5 9及一 1 . 1% ~ 3 . 4% ’ 。