全 文 ：发光酶基因 l uxAB标记硅酸盐细菌 NBT
菌株的研究 3
何琳燕 3 3 　黄为一
(南京农业大学生命科学学院微生物学系 ,南京 210095)
【摘要】　外源基因标记技术为研究土壤引入细菌的生态行为提供了有效的检测手段. 通过选择不同的碳
源和降低碳氮比筛选获得 0125 %麦芽糖作为碳源的菌体制备培养基. 对硅酸盐细菌 B T 菌株进行紫外诱
变和抗生素抗性驯化获得一株抗利福平 200μg·ml - 1的 NB T2R200 菌株 ,含发光酶基因 l uxAB 的质粒
p TR102 ∷l uxAB 在辅助质粒 pR K2013 的帮助下转入该菌株中 ,从而赋予 NB T 菌株以发光活性和利福
平、卡那霉素、四环素三种抗生素抗性. 以对数生长期的菌体制备受体细胞 ,发现对数生长前期的细胞转移
频率最高 ,可达 6170 ×10 - 5 ,杂交比例以 1∶1∶1 适宜. 标记菌株 RL85 的释钾能力没有丧失且有提高 ,发光
特性稳定 ,连续转接 20 次后仍具有发光活性和 3 种抗生素抗性 ,适用于根际微生态学研究.
关键词 　硅酸盐细菌 　发光酶基因 　标记
文章编号 　1001 - 9332 (2004) 07 - 1241 - 04 　中图分类号 　Q93 　文献标识码 　A
Introduction of bioluminescence genes into silicate2dissolving bacteria strain NBT. HE Linyan , HUAN G Weiyi
( Depart ment of Microbiology , N anjing A gricultural U niversity , N anjing 210095 , China) . 2Chin. J . A ppl .
Ecol . ,2004 ,15 (7) :1241～1244.
In this study ,silicate2dissolving bacteria NB T strain was grown with 0. 25 % maltose as carbon source ,and the ri2
fampicin2resistance was generated by ultraviolet mutagenesis and streak naturalized to 200μg·ml - 1 . Through tri2
parental cross ,the l uxAB genes were introduced into NB T2R200 at the help of pR K2013. The luminescence ac2
tivity of the hybrid strain was tested , which indicated that all colonies had a high luminescence activity and
kanamycin2 ,tetracyctine2and rifampicin2resistance. The NB T2R200 cells prepared from initial logarithmic growth
phage were more likely to be sensitive to foreign DNA ,and the maximum translocation frequency was up to 6. 70
×10 - 5 . In addition ,the optimal mating ratio was 1∶1∶1. The potassium release ability from feldspar and the lu2
minescence of l uxAB genes marked silicate2dissolving bacteria RL85 strain were stable ,and hence ,the RL85 was
available to rhizosphere microecology researches.
Key words 　Silicate2dissolving bacteria , l ux marker genes , Triparental cross.3 上海市科技兴农重点攻关资助项目 (农科攻字 98 第 0522 号) .3 3 通讯联系人.
2003 - 07 - 28 收稿 ,2004 - 02 - 12 接受.
1 　引 　　言
硅酸盐细菌是土壤中特殊的植物促生根际细
菌 ,它能分解原始的仅仅由硅酸盐和铝硅酸盐组成
的岩石矿物 ,具有溶磷、释钾、保钾、分泌植物激素等
能力[11 ,17 ,18 ,20 ] ,是目前广泛应用的微生物肥料中的
一种重要功能菌. 保证该类菌株在田间应用稳定性
的关键是引入菌株在植物根际能够良好定殖 ,测量
引入细菌的根部定殖已成为揭示有益细菌的根圈微
生态学特征、提高其根圈适应性和增产效果必不可
少的研究内容[3 ,8 ,15 ,25 ] . 随着分子生态学向微生物
生态学的渗透 ,特别是基因标记技术的建立与发展 ,
为植物促生根际微生物 ( PGPR) 菌株的微生态学研
究提供了有效手段[4～7 ,10 ,13 ,21 ,22 ] . 目前 ,国内外有
用发光酶基因标记荧光假单胞菌、根瘤菌及巨大芽
胞杆 菌 等 来 研 究 其 在 作 物 根 际 的 定 殖 规
律[2 ,9 ,12 ,14 ,23 ] ,但还没有应用发光酶基因标记硅酸
盐细菌的报道. 本文利用发光酶基因 l uxAB 对硅酸
盐细菌 NB T 菌株进行标记 ,以期为微生物肥料功能
菌的根际微生态学研究提供合适材料.
2 　材料与方法
211 　供试材料
21111 菌株 　硅酸盐细菌 NB T 菌株 ,由本系保存 ,菌体培养
用培养基为有氮培养基 [19 ] . 供体菌和辅助菌分别为大肠杆
菌 ( E1 coli ) WA803 (p TR102 ∷l uxAB , Kmr , Tcr ) 和 E1 coli
HB101(pR K2013 , tra + , Kmr ) ,由本系沈标教授提供 ,采用
LB 培养基进行培养.
21112 试剂 　10 %癸醛 [ CH3 ( CH2 ) 8CHO ] ,用无水乙醇配
制 ,培养皿菌落检测每次用 10μl. 抗生素卡那霉素 Km50μg
应 用 生 态 学 报 　2004 年 7 月 　第 15 卷 　第 7 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,J ul. 2004 ,15 (7)∶1241～1244
·ml - 1 、四环素 Tc50μg·ml - 1 、利福平 Rif 按实验设计要求制
备.
212 　实验方法
21211 菌体制备培养基的选择 　以有氮培养基为基础 ,分别
以蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和淀粉为碳源 ,接种 NB T 种子液 ,
28 ℃振荡培养 ,每隔 12 h 取样 ,稀释平板计数法测定细胞数
量 ,乙醇沉淀法测定复合多糖含量. 然后以 011 %、0125 %、
015 %、1 %、2 %的麦芽糖为碳源 ,接种 NB T 种子液 ,28 ℃振
荡培养 24 h 后 ,测定多糖含量 ,以有氮培养基为对照.
21212 NB T 抗药性突变株的诱变 　接无氮平板 [19 ]上一单菌
落于 100 ml 菌体制备培养液 ,150 rpm、28 ℃振荡培养 ,离心
收集处于对数生长期的菌体 ,用无菌水洗涤 ,悬浮于 10 ml
无菌水中 ,制成菌悬液. 各取 2 ml 菌悬液置于直径 6 cm 的
灭菌平皿 ,分别用 UV 照射 10、30、60、90、120 s ,然后分别取
1 ml 照射后的菌液和原液作系列稀释 ,涂布无氮平板 ,黑暗
28 ℃恒温培养 3 d 后计数. 计算细胞存活率 ,确定适当的 UV
照射时间进行诱变. 各取 011 ml 菌悬液 ,分别涂布于含有 0、
2、5、10、15、20μg·ml - 1利福平的无氮平板上 ,每个浓度作 3
皿 ,28 ℃培养 3 d ,观察平板上是否有菌落生长 ,确定初筛的
药物浓度. 选择适当的 UV 照射时间照射菌悬液. 各取 011
ml 涂布于加有不同浓度 (10、20、40、80、100μg·ml - 1)利福平
的无氮平板上 ,筛选突变株. 将在含有 80μg·ml - 1利福平的
无氮平板上生长的菌落划线于含有 80μg·ml - 1利福平的无
氮培养基上 ,再挑取生长于此平板上的抗性菌落进行摇瓶发
酵 ,涂布于含有更高浓度利福平 (100、150、200μg·ml - 1 ) 的
无氮平板上 ,诱导获得抗利福平浓度为 200μg·ml - 1的菌株.
21213 发光酶基因 l uxAB 标记利福平抗性突变株 　将硅酸
盐细菌抗利福平 200μg·ml - 1突变株接种于麦芽糖培养液 ,
28 ℃振荡培养 12、18 和 24 h ,离心收集菌体 ,无菌水洗涤两
次 ,制备成菌悬液. 将此菌悬液和含 p TR102 ∷ l uxAB、
pR K2013 (辅助质粒)的 E1 coli 以一定比例 (1∶1∶1、2∶1∶1、1∶
2∶1)混合在离心管中 ,用无菌水洗涤 ,离心得菌体 ,再加 1 ml
有氮培养液悬浮 ,置 28 ℃静止培养 24 h. 用无菌水将菌液稀
释成 10 - 1 、10 - 2和 10 - 5稀释度. 将 10 - 1 、10 - 2稀释度分别涂
布有氮 + Rif + Km + Tc 平板 ,28 ℃培养 3 d ,另外取 10 - 5稀
释度涂布有氮 + Rif 作为受体菌对照. 按下面的公式计算
p TR102 质粒的转移频率 :
转移频率 = (有氮 + Rif + Km + Tc 上长出的单菌落数/
有氮 + Rif 上长出的单菌落数) ×100 %
采用发光菌落平板计数法 ,或 X2射线胶片自显影检测 ,
在暗室中自显影的时间为 12～24 h. 参考《分子克隆实验指
南》进行杂交子质粒的快速检测 [16 ] . 采用摇瓶释钾试验[20 ] ,
比较发光菌株与出发菌株解钾能力. 参照文献 [24 ]进行发光
菌株稳定性试验.
3 　结果与讨论
311 　菌体制备培养基的选择
由于硅酸盐细菌 NB T 菌株在有氮培养基上能
产生丰厚的荚膜多糖 ,离心不易得到菌体 ,因此通过
选择不同的碳源和降低碳氮比来筛选受体菌培养
基. 在分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉为碳源的
有氮培养基中 ,每隔 12 h 取样分别测定细胞数量和
多糖含量. 由图 1 可知 ,多糖含量在 24 h 即可达到
最高峰 ,以后趋向稳定. 以麦芽糖为碳源时 ,细胞数
量上升很快 ,24 h 即可达到 8137 ×107个·ml - 1 ,48 h
以后细胞衰亡而数量减少. 葡萄糖和蔗糖次之 ,淀粉
作为缓效碳源 ,细胞数量上升最慢. 其中 24 h 时以
麦芽糖为碳源的培养基上细胞数量最多 ,复合多糖
产量最少 ,分别为 8137 ×107 个·ml - 1和 1185 mg·
ml - 1 ,与有氮培养基比较 ,细胞数量增加 44 倍而多
糖减少 4411 %.
图 1 　不同碳源对硅酸盐细菌 NBT 菌株多糖产量 (a) 和细胞数量
(b)的影响
Fig. 1 Effect of different carbon sources on complex polysaccharide yield
(a) and cell number (b) of strain NBT.
表 1 　不同麦芽糖浓度对硅酸盐细菌 NBT菌体数量的影响
Table 1 Effect of different concentration of maltose on cell number of
strain NBT
麦芽糖浓度
Concentration of maltose ( %)
011 0125 015 1 2 有氮培养基(CK)
碳氮比 C/ N ratio 119 417 914 1819 3717 1918
菌体数量 Cell number
( ×107 个·ml - 1) 3109 5121 5134 5197 3179 4156
　　由表 1 可知 ,以不同浓度的麦芽糖作碳源时 ,培
养 24 h 后 ,011 %麦芽糖浓度培养基上细胞数量较
少 ,0125 %、015 %、1 %麦芽糖浓度培养基上细胞数
量增加但无明显差异 ( F = 318 < F0105) ,故杂交时受
体菌培养基选择 0125 %麦芽糖作为碳源的有氮培
养基.
312 　NB T 抗药性突变株的诱变
31211 紫外线杀菌曲线 　NB T 菌株菌悬液经不同
时间 (10、30、60、90、120 s) 紫外线照射后 ,细胞存活
2421 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
率分别为 4113 %、3215 %、15 %、11 %、1125 % ,因此
选择 UV 最适诱变时间为 30 s.
31212 出发菌株自身耐药性浓度确定 　出发菌株在
加有 2、5、10、15μg·ml - 1利福平的有氮平板上能生
长 ,但在加有 20μg·ml - 1利福平的有氮平板上均不
生长. 因此 ,出发菌株自身耐利福平的最高浓度为
20μg·ml - 1 .
31213 突变株的筛选 　NB T 菌株菌悬液经 UV 30 s
照射后获得突变株 10 株 ,7 株抗利福平浓度为 20μg
·ml - 1 ,1 株抗利福平浓度为 80μg·ml - 1 .
31214 抗高利福平水平菌株的诱导 　选择抗利福平
浓度为 80μg·ml - 1的突变株 NB T2R80 进行诱导 ,
通过逐步提高培养基中利福平的添加量和在无氮平
板上纯化的方法 ,使 NB T2R80 抗利福平的浓度达到
200μg·ml - 1 ,记为 NB T2R200.
313 　发光酶基因 l uxAB 标记菌株的获得
由于供体菌和辅助菌不抗 Rif 而不能在含 3 种
抗生素的平板上生长 ,受体菌不抗 Km 和 Tc 也不能
在筛选平板上存活 ,因此经三亲本杂交 ,在含 3 种抗
生素的有氮平板上生长并挑取 200 个杂交子 ,暗室
中加癸醛检测均有发光活性 ,在有氮 + Rif + Km +
Tc 平板上划线纯化后 ,用 X2射线胶片记录发光活
性. 图 2 为部分杂交子用 X2射线胶片自显影 12 h 检
测的发光菌落情况.
图 2 　部分发光杂交子菌落的 X2射线胶片自显影
Fig. 2 Several colonies of l uxAB genes marked silicate2dissolving bacteri2
a.
　　根据杂交子计算出相应的转移频率 (表 2) . 实
验结果表明 ,受体菌 NB T - R200 培养 12 h 比培养
24 h 时杂交率高 ,前者为 10 - 5 ,后者仅为 10 - 7 ,说
明处于对数生长前期的细胞较易吸收外源 DNA. 随
受体菌培养时间延长 ,转移频率降低. 另外 ,受体菌
或供体菌在杂交中的比例提高 ,即菌量提高 ,杂交率
变化不大.
表 2 　pTR102 质粒对 NBT2R200 菌株的转移频率
Table 2 Transfer frequency of plasmid pTR102 to antibiotic2resistant
mutant strain NBT2R200
受体菌培养时间
Culture time of
recipient strain (h)
转移频率 Transfer frequency
杂交比例 Mating rate (供体菌∶辅助菌∶受体菌
Donor∶Helper∶Recipient)
1∶1∶1 2∶1∶1 1∶1∶2
12 6170 ×10 - 5 7190 ×10 - 5 2123 ×10 - 6
18 9126 ×10 - 5 3189 ×10 - 5 8151 ×10 - 6
24 2161 ×10 - 7 2116 ×10 - 7 2102 ×10 - 7
　　随机挑取生长较快、菌落粘稠的发光杂交进行
质粒检测 (图 3) . 由于出发菌株 NB T 和 NB T2R200
均未提取检测到质粒 ,可能菌株不含质粒. 在含 3 种
抗生素的有氮平板上生长的粘稠菌落发现有质粒存
在 ,且质粒大小与 p TR102 一致 ,说明 p TR102 已经
转移到受体菌 NB T2R200 中 ,从而使杂交子具有 3
种抗生素抗性和发光特性.
图 3 　部分 l uxAB 标记菌株的质粒图谱
Fig. 3 Plasmid profiles of the strains marked by l uxAB genes.
泳道 Lines :A～G1Marked strains ; H1p TR102 ; I1λ+ HindIII DNA.
314 　发光菌株的释钾能力和稳定性
在本次实验中共挑取 200 个杂交子 ,均检测到
发光活性. 对其中发光较强的标记菌株 RL85 和出
发菌株 NB T、NB T2R200 的释钾能力测定 (图 4) ,发
现培养 5 d ,RL85 可以从钾长石中释放出 5513 mg·
L - 1钾 ,比接灭活菌对照增加 5516 % ,而 NB T 和
NB T2R200 从钾长石中释放增加的钾分别为 4814 %
和 3910 % ,说明标记菌株的释钾活性没有丧失反有
提高.
标记于质粒上的发光系统存在的主要问题是
l ux 的不稳定 ,而标记基因插入染色体上将提高其
稳定性[1 ] . 引入的发光酶基因 l uxAB 在细胞中的稳
定性试验表明 ,标记菌株 RL85 在不含抗生素的斜
面上连续转接 20 次后仍能检测到发光活性和 3 种
抗生素抗性 ,说明 l uxAB 在细胞中能较稳定存在 ,
为在田间检测根际微生物的生态行为提供了稳定的
菌株.
34217 期 　　　　　　　　　　　何琳燕等 :发光酶基因 l uxAB 标记硅酸盐细菌 NB T 菌株的研究 　　　　　　　　　　　
图 4 　发光酶基因标记菌株和出发菌株解钾作用
Fig. 4 Potassium release from feldspar by l uxAB genes marked silicate2
dissolving bacteria and starting strains.
Ⅰ1 不接菌 Non2inoculated with bacteria , Ⅱ1 接灭活菌 Inoculated with
dead bacteria , Ⅲ1 接活菌 Inoculated with bacteria.
4 　结 　　论
411 　为减少荚膜多糖对菌体收集、质粒转化的影
响 ,筛选获得 0125 %麦芽糖作为碳源的菌体制备培
养基.
412 　通过对硅酸盐细菌 NB T 菌株进行紫外诱变和
抗生素抗性驯化获得一株抗利福平 200μg·ml - 1的
NB T2R200 菌株 , 含发光酶基因 l uxAB 的质粒
p TR102 ∷l uxAB 在辅助质粒 pR K2013 的帮助下转
入该菌株中 ,从而赋予 NB T 菌株以发光活性和利福
平、卡那霉素、四环素三种抗生素抗性. 以对数生长
期的菌体制备受体细胞 ,发现对数生长前期的细胞
易接受外源 DNA ,转移频率最高可达 6170 ×10 - 5 ,
杂交比例以 1∶1∶1 适宜.
413 　发光酶标记菌株 RL85 的释钾能力与出发菌
株 NB T 相当 ,且转接 20 次仍保持抗生素抗性和发
光特性 ,性质稳定 ,适用于硅酸盐细菌根际微生态学
研究.
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作者简介 　何琳燕 ,女 ,1976 年生 ,博士 ,主要从事土壤微生
物分类和生态学研究 ,发表论文 2 篇. E2mail : hlyan0974 @
yahoo. com. cn
4421 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷