全 文 ：一株克服地黄连作障碍有益菌的鉴定及其 LuxAB基因标记
谭亚男 1, 2 , 马汇泉 1＊ , 温学森 2 , 刘 舒 1
(1.山东理工大学生命科学学院 ,山东淄博 255049;2.山东大学药学院 ,山东济南 250100)
摘要　[目的]研究对克服地黄(Rehmanniaglutinosa)连作障碍有益的 43号菌的性质及其对地黄连作障碍的作用效果。 [方法 ]利用细
菌 16SrDNA的保守序列进行比对 ,结合形态学观察、革兰氏染色和生理生化等特征对筛选得到的能够克服地黄连作障碍的 43号菌进
行鉴定;利用LuxAB发光酶基因对其进行标记 ,经抗性平板筛选 ,滴加葵醛在暗室进行检测 ,看是否得到了重组菌株;比较标记前后菌株
对培养基中加入生地提取液的组培苗的作用效果。 [结果]鉴定结果表明 , 43号菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。检测结果表
明 ,得到重组菌株 ,命名为 C-43。经过比较 ,标记前后菌株的生理生化特性基本没有变化 ,确定 C-43对克服地黄连作障碍仍然有益。
[结论]经过标记后的恶臭假单胞菌C-43号菌可用于后续的大田研究。
关键词　地黄;恶臭假单胞菌;生理生化特性;16SrDNA;LuxAB发光酶基因
中图分类号　S567.23+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)17-08967-03
IdentificationandLuxABBiochemicalMarkofACertainBacteriumContributestoSetleContinuousCroppingObstaclesofRehman-
niaglutinosa
TANYa-nanetal　(SchoolofLifeSciences, ShandongUniversityofTechnology, Zibo, Shandong255049)
Abstract　[ Objective] Theresearchaimedtostudythecharacterofacertainbacteriumwhichwasbenefittosetlecontinuouscroppingobstacles
ofRehmanniaglutinosaanditsefect.[Method] Combiningwithmorphologicalobservation, gramstainandcomparisonofphysiologicalandbio-
chemicalcharacteristics, conservativesequencealignmentofbacterial16SrDNAwasusedtoidentifyacertainbacterium43.Thisstrainwassepa-
ratedfromthesoilinwhichtheRehmanniaglutinosawasplantedandwasbenefittosettlecontinuouscroppingobstaclesofRehmanniaglutinosa.
Forafolow-upstudyinfieldexperiment, LuxABluminescentenzymegenewasusedtomarkthisstrain, thenchosetherecombinantstrainbyanti-
bioticselectionplateanddroppedkwaialdehydeinthepaneltodetectthecharactersinthedarkroom.Finaly, theeffectsofbacterium43andC-
43onseedlingcultivatedinculturemediumwithRehmanniaglutinosaextract.[Result] Bacterium43belongedtoPseudomonasputida.Andare-
combinationstrainC-43wasobtained, whichhadthesamebasicphysiologicalandbiochemicalcharacteristicscomparedtotheoriginalstrain.
ThereforetheC-43straincouldalsocontributetosettlethecontinuouscroppingobstaclesofRehmanniaglutinosa.[ Conclusion] Therecombina-
tionstrainC-43canbeusedforfolow-upstudyofthefieldexperiments.
Keywords　Rehmanniaglutinosa;Pseudomonasputida;Physiologicalandbiochemicalcharacteristics;16SrDNA;LuxABluminescentenzyme
gene
基金项目　国家“十一五 ”支撑计划项目(2006BA109B03);国家自然科
学基金项目(30572326)。
作者简介　谭亚男(1984-),女 ,山东烟台人 ,硕士研究生 ,研究方向:
生物化学与分子生物学。 ＊通讯作者 , E-mail:mhqswp@
sdut.edu.cn。
收稿日期　2010-03-19
　　地黄(Rehmanniaglutinosa)为玄参科多年生草本植物 ,
其块根可作药用 ,具有滋阴清热 、补血止血等功效 ,在临床上
具有广泛的应用价值 ,主产于河南 、辽宁 、河北 、山东 、浙江等
地。地黄是多种中成药的主要原料 ,年需要量约 1 100万 kg,
已成为产区重要的经济来源之一 [ 1] 。地黄怕积水 ,忌连作 ,
一般种植过地黄的土地需隔 10年以后才能第 2次种植。近
年来 ,由于农民大量种植地黄 ,其连作障碍发生严重 ,种植面
积大幅减少 ,因此 ,克服地黄连作障碍成为亟待解决的问
题 [ 2] 。自 1978年 Bur等首次从马铃薯中发现了促生菌
(Plantgrowth-promotingrhizobacteria,简称 PGPR)以来 , PGPR
已广泛应用于作物增产增收及克服大豆 、草莓和人参等的连
作障碍。因此 ,施用 PGPR也可能是解决地黄连作障碍的有
效措施 [ 3-4] 。发光酶是生物体内催化发光反应的酶 ,它催化
的反应包括长链脂肪醛和黄素单核苷酸(FMN)的氧化 ,并产
生光 ,这些现象借助胶片 、CCD显微镜 、发光光度计或肉眼就
能观察到 [ 5] 。为此 ,笔者在前人分离到有增产 、减轻连作障
碍作用的细菌菌株 [ 6]的基础上 ,利用分子生物学与传统的生
理生化相结合的方法对作用最明显的 1株地黄连作障碍有
益菌——— 43号菌进行鉴定 ,并利用三亲本接合法对其进行发
光酶基因标记 [ 7] ,以期为研究菌株施用于大田后的定殖能力
的追踪及其对根系微生物种群的影响奠定基础。
1　材料与方法
1.1　菌株　供鉴定的菌株由山东大学药学院实验室人员分
离自种植地黄的土壤中 ,命名 43号菌 [ 6] ;Tra辅助菌 、Lux供
体菌由华中农业大学惠赠。
1.2　菌株的鉴定
1.2.1　形态学鉴定。经革兰氏染色 、芽孢染色确定菌株形
态学特征 [ 6] 。
1.2.2　生理生化指标鉴定 。根据 《常见细菌系统鉴定手
册 》[ 8]对 43号和 C-43号菌进行碳水化合物利用 、乙酰甲基
乙醇(V.P)试验 、甲基红(M.R)试验等生理生化试验。
1.2.3　16SrDNA序列分析鉴定。采用 CTAB法提取细菌总
DNA。PCR扩增采用以下引物:63F, 5′-CAGGCCTAACACAT-
GCAAGTC-3′;1494R, 5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′。反应
体系:2×TaqPCRMasterMix, 12.5μl;基因组 DNA模板 , 1.0
μl;引物 1494R, 1.0 μl;引物 63F, 1.0μl;ddH2 O, 9.5 μl。扩
增程序:95 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 1 min, 55 ℃退火 1
min, 72℃延伸 1 min, 30个循环;72 ℃延伸 10min;4 ℃保温
2 h。
PCR产物用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 ,纯化后利用
TaKaRa回收试剂盒回收 ,将目的条带连接 pUCm-Tvector,转
化 E.coliDH5α,送上海博尚生物技术有限公司测序。然后
利用 Blast软件在 GenBank中比对寻找具有较高同源性的
16SrDNA序列 ,并大致确定该阳性克隆来源菌株的系统发
育地位和与邻近菌的亲缘关系 ,将相关序列用 DNASTAR进
行比对 ,并构建系统发育树。
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(17):8967-8969 责任编辑　姜丽　责任校对　况玲玲
1.3　菌株的 LuxAB基因标记
1.3.1　菌株抗生素天然抗性的鉴定 。当氨苄青霉素(Amp)
浓度为 50 μg/ml、氯霉素(Cm)浓度为 50 μg/ml、链霉素
(Sm)浓度为 50μg/ml、四环素(Tet)浓度为 20 μg/ml、壮观
霉素(Spe)浓度为 50 μg/ml时 ,分别测定 LuxAB供体 、Tra
辅助菌 [ 9]和 43号菌的生长状况 ,以筛选重组菌株的抗生素。
1.3.2　发光酶基因 LuxAB标记菌株 。将 LuxAB供体菌 、Tra
辅助菌和 43号菌按 1∶1∶1的比例混合进行三亲本杂交 ,涂布
于含有 Cm50μg/ml、Tet20μg/ml的抗性平板中进行重组子
筛选 ,利用葵醛在暗室检测重组子发光情况。
1.4　标记后菌株性质研究
1.4.1　LuxAB基因在重组菌中的稳定性测定。首先在含 Tet
和 Cm的 LB液体培养基中活化菌种 ,然后接种于无抗生素
的 LB液体培养基中连续培养 50h,其中每隔 5h取样涂布于
无抗性 LB平板。待长出单菌落后挑取 300个单菌落于含
Tet和 Cm的抗性平板 ,以抗性菌株所占的百分比计算重组
菌株的遗传稳定性 。
1.4.2　重组子与出发菌株性质的比较。通过形态学观察 、
革兰氏染色 、生理生化特性和生长曲线等比较重组后菌株与
出发菌株的性质是否发生变化 。
1.4.3　重组子与出发菌株对组织培养地黄苗的作用比较。
精密称取生地药材 5 g于 100 ml圆底烧瓶中 ,精密加水 30
ml,置于电热套中回流 1 h,取出 ,放冷 ,补足水分至原重。过
滤 ,弃去初滤液 ,精密量取续滤液 15 ml,置于水浴上蒸干 ,残
渣用甲醇溶解 ,转移至 5 ml量瓶中 ,定容 ,得到生地提取液。
在组织培养基 MS中加入生地提取液 70 ml,进行 3组接种处
理:第 1组 ,直接接种地黄组培苗;第 2组 ,将组培苗在 43号
菌液中浸泡后接种;第 3组 ,将组培苗在 C-43号菌液中浸泡
后接种。培养 30 d后观察试验结果。
2　结果与分析
2.1　菌株的鉴定结果
2.1.1　形态学观察结果 。为圆形 ,呈白色 ,光滑 ,周边形状
规则 ,呈凸起状;为杆状菌 ,经革兰氏染色呈红色 ,为革兰氏
阴性菌;经芽孢染色没有芽孢 。
2.1.2　生理生化特征结果 。由表 1可知 , 43号和 C-43号菌
生理生化性质相同 ,都为杆状 、无芽孢的革兰氏阴性细菌 ,具
有能够利用葡萄糖 、果糖和乳糖作碳源及分解葡萄糖产生非
酸性物质 、还原硝酸盐等性质 ,对照 《伯杰氏细菌鉴定手
册 》[ 10]鉴定它们均为假单胞菌(Pseudomonassp.)。
表 1　43号和C-43号菌的生理生化特征比较
Table1　ComparisonofphysiologicalandbiochemicalcharacteristicsbetweenNo.43andC-43
菌株Strain 形状Shape 芽孢Sporule革兰氏染色Gramstain 葡萄糖Glucose 蔗糖Sucrose 果糖Fructose 木糖Xylose 乳糖Lactose V.P试验V.Ptest M.P试验 H2S试验
明胶液化试验Gelatinlique-factiontest
43号菌 Pole - - + - + - + + - + -
C-43号菌 Pole - - + - + - + + - + -
菌株Strain
吲哚试验Indoletest
淀粉水解试验Starchhydro-lysistest
硝酸盐还原试验Nitrateredu-ctiontest
氧化酶反应Oxidasereaction
反硝化Denitrification
肌酸利用试验Creatineusetest
精氨酸双水解酶Argininedihydrolase
苄胺Benzyla-mine
海藻糖Trehalose L-脯氨酸L-proline DL-精氨酸DL-arginine
间 -肌醇Inter-inositol
43号菌 - - + + - + + + - + + -
C-43号菌 - - + + - + + + - + + -
　注:+表示阳性;-表示阴性。下同。
　Note:+.Positive;-.Negative.Thesameasfolows.
2.1.3　16SrDNA的序列分析结果。将菌株的 16SrDNA核
苷酸序列在 GenBank中进行 Blast比对 ,利用 DNASTAR软件
构建系统发育树(图 1),结合生理生化特征确定其为恶臭假
单胞菌。
图 1　43号菌株基于 16SrDNA序列构建的系统发育树
Fig.1　PhylogenetictreeconstructedbyNo.43strainbasedon
16SrDNAsequence
2.2　菌株的生化标记结果
2.2.1　抗生素的筛选结果。见表 2。
2.2.2　发光酶基因标记菌株结果。重组后菌株能够在含有
Tet和 Cm的抗性平板中生长 ,滴加葵醛后在暗室能够发光 ,
得到重组菌株 C-43(图 2)。
表 2　菌株抗生素鉴定结果
Table2　Strainidentificationresultsofantibiotic
菌株
Strain Amp Em Cm Sm Tet Spe
43号菌 - - + - - +
No.43strain
LuxAB供体菌 - - - - + -
LuxABdonorbacteria
Tra辅助菌 - - - - - +
Trasecondarybacteria
2.3　标记后菌株的性质
2.3.1　LuxAB基因在重组菌中的稳定性测定结果 。选取
312个克隆进行培养 ,结果在抗性平板中未长出的有 8个 ,遗
传稳定性为 97.4%。
2.3.2　C-43号与 43号菌的性质比较。 43号与 C-43号菌株
的形态 、生理生化特征基本一致 ,标记前后没有明显变化。
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图 2　C-43号菌发光检测
Fig.2　C-43luminousdetectionresult
2.3.3　重组子与出发菌株对组织培养地黄苗的作用比较结
果。由图 3可知 ,第 1组中地黄苗全部死亡;第 2、3组中地黄
苗生长良好 ,苗长势没有太大差别 ,说明标记后菌株与标记
前菌株性质基本没有发生改变 。
3　结论与讨论
该研究对 1株具有克服地黄连作障碍作用的菌株 43号
菌进行了鉴定 ,确定其为恶臭假单胞菌;根据假单胞菌能够
通过接合作用转移获得外源质粒的特性 ,利用三亲本接合法
对其进行了遗传标记 ,结果经过 LuxAB基因标记后 ,菌株的
生理生化特性均没有变化;在 MS培养基中添加生地提取液
后研究地黄组培苗在其中的生长情况 ,发现地黄在添加生地
提取液的 MS培养基中不能生长 ,但加入 43号菌和 C-43号
菌的培养基中地黄组培苗生长良好 ,说明 C-43号菌对克服
地黄连作障碍的作用没有变化 ,可用于后续研究。
该研究发现 ,地黄分泌物对地黄有自毒作用 ,证实地黄
的自毒作用是导致地黄连作障碍的一个重要因素;43号菌能
够利用地黄分泌物 ,促进地黄生长 ,经过 LuxAB基因标记后
其性质及对地黄连作障碍的作用没有改变 。因此可以将其
施用于田间 ,利用其生物发光特性追踪其在土壤中的定殖能
力 ,并研究其对土壤性质及土壤微生物种群结构的影响 ,以
找到地黄连作障碍的根本原因 ,为进一步克服地黄连作障碍
奠定基础。
图 3　重组子与出发菌株对组织培养地黄苗的作用比较
Fig.3　Comparisonofefectsofrecombinantstrainandoriginalstrainonyellowseedlingintissueculturefield
参考文献
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(上接第 8952页)
　　由图 1可知 ,从小紫金牛挥发油中共分离出 99种物质 ,
已鉴定出 56种 ,占挥发油总馏出物的 56.6%,占色谱峰总峰
面积的 84.1%,主要有烯烃 、酮 、醇 、酯和酸类物质 ,还有少量
的醛 、烷烃及芳香烃类物质等。其中 ,含量最高的物质为石
竹烯 , 相对含量为 10.65%,其次 ,棕榈酸相对含量为
10.02%, α-法呢烯相对含量为 6.54%, 王古王巴烯相对含量为
5.58%, 6, 10, 14-三甲基-2-十五烷酮的相对含量为 4.69%,
水杨酸甲酯相对含量为 4.20%。另外 ,相对含量在 2.00%以
上的还有 3, 9-杜松二烯(3.93%)、2, 6-二甲基-6-[ 4-甲基-3-
戊烯基 ] -2-降蒎烯(3.70%)、τ-衣兰油烯(3.03%)和 1, 2, 4a,
5, 6, 8a-六氢化-4, 7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-萘(2.57%)。
3　结论与讨论
该研究结果表明 ,小紫金牛挥发油化学成分复杂 ,含有
丰富的烯类物质 ,其中 ,萜烯类及其含氧衍生物占小紫金牛
挥发油总量的 48.3%。萜类化合物是广泛存在于植物界中
的一大类化合物。已有研究表明 ,萜类化合物具有多种生物
活性 ,并且是某些中药的主要有效成分 ,如在小紫金牛挥发
油中的石竹烯 、α-石竹烯 、异石竹烯具有平喘作用 ,是治疗老
年慢性支气管炎的有效成分之一 [ 4] 。该研究为让人们认识
小紫金牛的化学成分与其药效之间的关系 ,并为进一步合理
开发利用小紫金牛资源提供了科学依据。
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