全 文 ：乙草胺和甲胺磷对农田黑土可培养真菌数量及
种群结构的影响*
李新宇1, 2 张惠文1* * 张 晶1 苏振成1 张成刚1
( 1 中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳 110016; 2 中国科学院研究生院,北京 100039)
摘要 应用传统及 PCRDGGE 方法( denaturing g radient gel electrophor esis) ,分别对不同浓度乙草胺、甲
胺磷胁迫下黑土中可培养真菌 CFU ( colony forming units)、种群丰富度( r ichness)及种群结构动态变化规律
进行了研究. 结果表明,在实验室微域条件下, 乙草胺对黑土可培养真菌 CFU 的影响随处理浓度的增加而
抑制作用增强, 表现出由低浓度( 50 mg!kg - 1)时的刺激生长到高浓度 ( 250 mg!kg- 1)时的长期抑制效应;
250 mg!kg - 1甲胺磷在 8 周处理过程中对土壤可培养真菌生长具有显著的刺激效应,使可培养真菌 CFU
比对照增加 10倍, 但50 和150 mg!kg- 1甲胺磷处理对土壤可培养真菌CFU 无显著影响.种群丰富度系数
分析结果表明, 高、中浓度乙草胺处理可使土壤可培养真菌种群丰富度不可逆地降低. 土壤真菌 rDNA 特
异 PCRDGGE 聚类分析结果表明,不同浓度乙草胺、甲胺磷处理均不同程度地对土壤可培养真菌的种群
组成和结构造成影响, 其中甲胺磷尤为显著.
关键词 乙草胺 甲胺磷 真菌种群 PCRDGGE 黑土
文章编号 1001- 9332( 2005) 06- 1099- 05 中图分类号 S154 36 文献标识码 A
Effects of acetochlor and methamidophos on culturable fungal population and community structure in black
soil. L I X inyu
1, 2
, ZHANG Huiw en
1
, ZHANG Jing
1
, SU Zhencheng
1
, ZHANG Chenggang
1
( 1 I nstitute of App lied
Ecology , Chinese A cademy of Sciences , Shenyang 110016, China; 2 Graduate School of Chinese A cademy of Sci
ences , Beij ing 100039, China) . Chin. J . A pp l . Ecol . , 2005, 16( 6) : 1099~ 1103.
By the methods of CFU and rDNAPCRDGGE, this paper studied the dynamic changes o f cultur able fungal pop
ulations, community structur e, and population r ichness in black so il under stress of acetochlo r and methami
dophos. The results showed t hat the grow th of fungi was pr omoted under lower concentration acetochlor ( 50 mg
!kg- 1 ) , but longstanding inhibited under its higher concentration ( 250 mg!kg- 1 ) . 250 mg!kg- 1 methami
dophos promoted the gr owth of culturable fungi intensively during 8week period, resulting in 10 times increase in
CFU of fungi than the control, w hile low concentration methamidophos ( 50 mg!kg- 1 ) had no evident effect.
The r ichness of culturable fung i in soil treated by medium and high concent rat ion acetochlor was decreased ir re
versibly. Cluster analysis of fungal rDNAPCRDGGE fingerprints profile showed that acetochlor and methami
dophos could change the cultur able fungal community structur e div ersely, and the effect of methomidophos was
more obvious.
Key words Acetochlor , Methamidophos, Fung i communit y, PCRDGGE, Black so il.
* 国家重点基础研究发展规划项目( 2004CB418503) 和中国科学院
沈阳应用生 态研究知识 所创新工程 领域前沿 资助项 目
( C12SFSLYQY0402) .
* * 通讯联系人.
2004- 12- 06收稿, 2005- 02- 24接受.
1 引 言
黑土是我国宝贵的自然土壤资源, 但由于长期
的高强度耕作方式造成了目前黑土土壤质量和土壤
肥力明显下降, 土壤生物活性降低,其中农药和化肥
等农用化学品的大量施用对黑土质量所产生的影响
一直受到人们的关注.研究表明,农药长期施用能够
导致土壤微生物群落组成、结构、数量、代谢方式与
功能等发生显著变化, 不仅使一些参与养分循环的
微生物和植物益生微生物数量明显减少, 也可使土
壤中潜在病原微生物富集, 增加了土传植物病害发
生的潜在风险[ 4, 6, 13] . 乙草胺是我国黑土地区农业
生产中常用的除草剂之一, 广泛用于玉米、大豆、棉
花、花生田. 甲胺磷是一种高效、高毒性的有机磷杀
虫剂,一般被大量应用于防治棉花、果树、谷类、森林
等的大多数害虫. 在我国二者的消耗量都超过
10 000 t!年- 1[ 5, 12] . 目前关于乙草胺对土壤微生物
影响的研究主要集中在对土壤细菌种群的影响方
面[ 7, 16, 17] ,而关于土壤真菌的研究报道较少. 甲胺
磷的研究也仅局限于对土壤微生物 CFU 和土壤酶
的活性研究方面[ 20, 21] . 真菌作为土壤微生物的重要
组成部分与细菌一样在维持土壤质量和物质循环等
方面发挥着重要作用. 在微生物生态学研究中, 传统
的 CFU 方法主要应用于可培养微生物数量变化规
应 用 生 态 学 报 2005 年 6 月 第 16 卷 第 6 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Jun. 2005, 16( 6)∀1099~ 1103
律研究方面,而 PCRDGGE方法在分析微生物种群
多样性和结构变化规律上具有其独特的优越
性[ 1, 3, 9, 11, 15] .本文采用这 2 种方法, 系统研究乙草
胺、甲胺磷对黑土中可培养真菌数量和种群结构所
产生的影响,为评价乙草胺、甲胺磷对黑土质量和土
壤真菌生态系统的生态风险提供科学依据.
2 材料与方法
21 供试土壤及土壤处理
供试土壤采集于中国科学院黑龙江海伦农业生态实验
站( 47#27∃N, 126#55∃E)肥水耦合实验地. 该样地采用小麦
玉米大豆轮作方式耕作, 至少 8 年以上未施用过任何农药.
土壤样品以叉花点式采样法采集, 分别采集 5 处表层 0~ 20
cm 土壤样品,共 10 kg, 充分混匀, 使用前置于 4 % 保存. 土
壤理化性状按常规方法测定(表 1) [ 8] . 用市售产品(禾耐斯
harness, 90%乳油, 美国孟山都公司)配制乙草胺甲醇( 225
mg!ml- 1 )储备液, 50%甲胺磷乳油(湖北省仙桃市农药厂)
配制甲胺磷( 200 mg!ml- 1)水溶液. 其他化学试剂均为分析
纯试剂. 取过 2 mm 筛的土壤共 7 份, 每份 900 g , 施以不同
剂量乙草胺、甲胺磷.实验处理设对照、乙草胺 3 个浓度 ( 50、
150 和 250 mg!kg - 1) ,甲胺磷 3 个浓度 ( 50、150 和 250 mg!
kg- 1)共 7 个处理. 将农药施入土壤, 充分混匀后, 放置 30
min 使乙草胺中甲醇挥发, 加水使土壤含水量达到田间最大
含水量的 60% . 每个处理设 3 个重复. 杯口用密封膜密封,
保证一定的通气性, 置于培养箱中 25 % 避光培养, 在培养过
程中不添加任何营养成分, 但以称重法定期补充水分. 每隔
7 d 取 1 次样.
表 1 供试土壤理化性质
Table 1 Physical and chemical characteri stics of soil s tested
采样深度
S ampling depth
( cm)
pH 有机质
Organic mat ter
( g!kg- 1)
全氮
Total N
( g!kg- 1)
全磷
Total P
( g!kg- 1)
全钾
T otal K
( g!kg- 1)
颗粒组成 Partuicle com posit ion ( % )
0. 01~ 1. 00
( mm)
0. 001~ 0. 01
( mm)
< 0. 001
( mm)
0~ 20 6. 58 37. 83 2. 56 0. 61 26. 00 51. 4 39. 6 26. 6
22 土壤真菌计数
土壤真菌计数采用马丁培养基表面涂布法[ 18] , 每个处
理设 3 次重复,同时测定土壤水分, 数据处理时将 CFU 值换
算为以每克干土为基准.
23 土壤真菌 PCRDGGE
231 真菌群落总 DNA 提取和 PCR 扩增 将生长在平板
上的所有菌落用牙签挑到 Ep 管中, 加入 1 ml ( 50 mmol!L - 1
T risHCl, pH 7. 5, 50 mmol!L- 1 EDTA, 3% SDS)提取液, 65
% 温育 30 min 后, 4 % 、12 000 r!min- 1离心 10 min,抽提上
清液加 0. 6倍体积异丙醇沉淀 2 h 后, 4 % 、12 000 r!min- 1
离心 30 min, 沉淀用 70%乙醇洗涤, 最后溶于 100 l灭菌的
去离子水中. 提取 DNA 不需纯化即可进行 PCR 扩增. 本文
选择 U1 ( 5&gTgAAATT gTTgAAAgggAA3& ) , U2GC ( 5&
CgCCCgCCgCgCgCggCgggCggggCgggggCACgggggggACTCCT
T ggTCCgTgTT3& ) [ 10]引物对扩增真菌 28SrDNA 中的大约
260 bp 长片段,使用 Thermo Hybaid PCR express 扩增仪, 反
应体系( 50 l)包括: 10 ∋ Buffer 5 l, 2. 5 mmol!L- 1dNTP 混
合液 4 l, 引物 U1, U2 + GC 各 10 pmol, DNA 模板 10 ng ,
T aq 酶 2. 5 U . PCR 反应条件为: 在 94 % 预变性 3 min 后进
行 94 % 变性 1 min, 50 % 退火 40 s, 72 % 延伸 1 min, 共 35
个循环,最后 72 % 延伸 10 min.
232 DGGE 条件 DGGE 采用 DCode system ( BioRad
Laboratories Inc. , Hercules, CA , USA) , 8% 聚丙烯酰胺凝胶,
变性梯度为 30% ~ 70% ( 100%变性相当于 7 mol!L - 1尿素
和 40%去离子甲酰胺) , PCR 产物加样量 40 l, 在 60 % 、1∋
TAE、200 V 条件下电泳 5 h, 电泳胶片利用改进的 Bassam 银
染方法[ 2]进行染色, 染色胶片干燥后,进行扫描分析, 并封片
保存.
233 实验数据处理 根据 DGGE 图谱信息,对所有处理土
壤 DGGE 图谱进行统计分析,得到每种处理土壤样品 DGGE
指纹图谱带数 ( N i ) , 通过计算每种处理土壤 DGGE 指纹条
带数量占所有 DGGE 指纹谱带总数的比率( P = N i/ N total) ,
作为各处理土壤真菌丰富度系数( P) , 同时将各处理谱带转
为 0、1 矩阵,利用 PHYLIP3. 0 软件对所有处理土壤样品进
行聚类分析.
3 结果与分析
31 乙草胺、甲胺磷对可培养真菌数量的影响
对不同时间乙草胺胁迫下土壤中可培养真菌
CFU 的动态变化规律研究表明,经 1 周处理后, 150
mg!kg- 1乙草胺处理土壤真菌 CFU 比对照增加
40. 05% , 50 mg!kg- 1乙草胺处理土壤增加 21. 27%
,而 250 mg!kg- 1乙草胺却使处理土壤真菌 CFU 比
对照降低 19. 95% .在此后第 2 周至第 6 周处理过
程中,除了 50 mg!kg- 1处理土壤真菌 CFU 比对照
土壤有所增加以外,其他 2种处理土壤真菌 CFU 均
表现出比对照降低的趋势. 7周以后 3 种处理土壤
真菌 CFU 均显著降低于对照土壤.经 8周后,乙草
胺由低到高 3种浓度处理土壤真菌 CFU 分别比对
照土壤降低 9. 18%、62. 24%和 62. 76%(图 1a) .从
8周处理结果分析, 不同浓度乙草胺对黑土可培养
真菌数量具有不同的影响和动态变化规律,尤其高
浓度的乙草胺不仅具有短期抑制作用, 而且表现出
显著的长期抑制效应.
不同浓度甲胺磷处理在各个时期对土壤可培养
真菌 CFU 具有不同的影响.其中高浓度甲胺磷( 250
1100 应 用 生 态 学 报 16卷
图 1 乙草胺( a)和甲胺磷( b)对黑土可培养真菌数量的影响
Fig. 1 Ef fect of acetochlor ( a) and methamidophos ( b) on culturable
fungal populat ions in black soil.
mg!kg - 1)处理使土壤可培养真菌 CFU 比对照增高
近十倍,而且这种趋势在实验过程中维持较长时期
(图 1b) ,而中( 150 mg!kg- 1)、低浓度( 50 mg!kg- 1)
甲胺磷处理与对照比较在处理 1 周后没有显著差
别,但在其他处理阶段,中浓度甲胺磷处理土壤真菌
CFU 显著高于对照. 到处理末期, 中浓度甲胺磷处
理土壤可培养真菌 CFU 比对照增长 60. 71%, 而低
浓度甲胺磷处理土壤与对照没有显著差别.
32 乙草胺、甲胺磷对可培养真菌种群丰富度及结
构的影响
分析 3种浓度乙草胺处理土壤可培养真菌种群
特异的 rDNAPCRDGGE 指纹图谱和特征谱带丰
富度表明,对照土壤种群丰富度在处理后第 1 和第
8周都较高,分别为 0. 36 和 0. 44,而乙草胺 3 个浓
度处理除在第 4周丰富度系数均略高于对照外, 其
他时期均低于对照(图 2a, 表 2) . 3 个浓度乙草胺
( 50、150和 250 mg!kg- 1)处理后 1周, 他们的种群
丰富度系数都显著低于对照, 分别为 0. 14、0. 27 和
0. 06.值得注意的是, 此时 50 mg!kg- 1乙草胺处理
土壤真菌 CFU 显著高于对照土壤,但是其种群丰富
度系数却显著低于对照土壤, 虽经 8 周后恢复为
040,接近于对照,可此时其种群结构与对照比较已
经发生了显著改变,聚类分析结果显示他们被分为
完全不同的单元 (图 3a) . 相应地中、高浓度乙草胺
处理土壤真菌的种群丰富度系数仍显著低于对照,
这个变化趋势与 CFU 结果相似. 就种群丰富度系数
而言, 高、中浓度不但有短期影响而且具有长期效
应,而低浓度仅表现出短期效应.
表 2 乙草胺、甲胺磷胁迫下黑土可培养真菌丰富度系数
Table 2 Richnessindex of culturable fungi in black soi l under ace
tochlor and methamidophos stress
取样日期
Sampling
time
( d)
乙草胺 Acet ochlor
乙草胺浓度
Acet ochlor
concentrat ion
(mg!kg- 1)
丰富度系数
Richness
index
甲胺磷M etham idophos
甲胺磷浓度
M etham idophos
concentrat ion
( mg!kg - 1)
丰富度系数
Richness
index
7 0 0. 36 0 0. 39
7 50 0. 14 50 0. 39
7 150 0. 27 150 0. 13
7 50 0. 06 50 0. 37
28 0 0. 19 0 0. 21
28 50 0. 25 50 0. 21
28 150 0. 23 150 0. 37
28 250 0. 29 250 0. 42
42 0 0. 29 0 0. 30
42 50 0. 25 50 0. 33
42 150 0. 23 150 0. 24
42 250 0. 29 250 0. 35
56 0 0. 44 0 0. 45
56 50 0. 40 50 0. 42
56 150 0. 27 150 0. 37
56 250 0. 23 250 0. 44
图 2 乙草胺( a)和甲胺磷(b)处理黑土可培养真菌 PCRDGGE电泳图谱
Fig. 2 PCRDGGE of culturable fungi in black soil under the st ress of
acetochlor ( a) an d methamidophos ( b) .
泳道 1、2、3、4分别为对照、50、150和 250 m g kg- 1乙草胺处理( a) 和
甲胺磷处理( b)后第 7天的土壤样品;泳道 5、6、7、8分别为对照、50、
150和 250 mg kg- 1乙草胺处理( a)和甲胺磷处理( b)后第 28 d的土
壤样品;泳道 9、10、11、12分别为对照、50、150和 250 mg kg- 1乙草
胺处理( a)和甲胺磷处理( b)后第 42 d 的土壤样品; 泳道 13、14、15、
16分别为对照, 50, 150和 250 mg kg- 1乙草胺处理( a)和甲胺磷处理
( b)后第 56 d的土壤样品 Lane 1, 2, 3, 4 represent the 7th day soil
samples t reated by 0, 50, 150 and 250 m g ! kg- 1 acetochlor ( a) and
methamidophos ( b) ; Lane 5, 6, 7, 8 represent the 28th day soil sam ples
t reated by 0, 50, 150 and 250 mg ! kg- 1acetochlor ( a) and metham i
dophos ( b) ; Lane 9, 10, 11, 12 represent the 42nd day soil sam ples treat
ed by 0, 50, 150 and 250 mg ! kg- 1acetochlor ( a) and methamidophos
( b) ; Lane 13, 14, 15, 16 represent the 56th day soil samples t reated by
0, 50, 150 and 250 mg !kg- 1acetochlor (a) and metham idophos ( b) .
11016 期 李新宇等:乙草胺和甲胺磷对农田黑土可培养真菌数量及种群结构的影响
对不同浓度乙草胺处理 1和 8周后的土壤真菌
PCRDGGE谱带类型进行聚类分析表明,经 1周后
不同处理土壤之间真菌种群结构变化明显, 对照组
被单独聚到第(单元, 而其他 3 个处理分别被聚到
第)和第 ∗单元;处理 8周后由于乙草胺被不断降
解,由此减弱了对土壤可培养真菌种群结构的影响,
使土壤真菌类群结构趋于相似, 虽与对照相比仍有
一定差异,但都聚在第∗单元.
利用 PCRDGGE 方法,对不同浓度甲胺磷处理
土壤可培养真菌的种群进行了研究.结果表明, 经 8
周处理, 150 mg!kg- 1甲胺磷使土壤可培养真菌种
群丰富度系数部分降低, 以第 1周尤为显著, 250 mg
!kg- 1甲胺磷处理土壤的真菌丰富度系数比对照略
有变化, 但差异不显著, 50 mg!kg- 1处理土壤的丰
富度系数与对照也无显著差异(图 2b,表 2) . 根据不
同浓度甲胺磷处理后第 1和 8 周土壤可培养真菌
DGGE 谱带类型的相似性, 对各处理土壤可培养真
菌种群进行了聚类分析(图 3b) . 结果表明,经 1和 8
周处理的所有土壤可培养真菌的种群结构均发生了
不同程度的改变.其中经 1周处理,土壤可培养真菌
种群结构与对照相比发生了极显著变化, 分别被聚
类到第∗和第(单元;经 8周处理,土壤可培养真菌
的种群结构与第 1周不同,除 50 mg!kg- 1甲胺磷处
理土壤被聚到第 ∗单元以外, 其他处理与对照组被
同聚为第 )单元.
图 3 乙草胺( a)和甲胺磷( b)处理下黑土可培养真菌种群组成相似
性矩阵图
Fig. 3 S imilarit y matrix of community compos it ion of culturable fungi in
black soil under the stress of acetochlor ( a) and methamidophos ( b) .
图中 1CK、12、13、14代表 0、50、150、250 mg!kg- 1乙草胺处理( a)和甲胺磷处理( b)后第 7 d 的土壤样品; 8CK、82、83、84代表 0、
50、150、250 mg!kg- 1乙草胺处理( a)和甲胺磷处理( b)后第 56 d的
土壤样品 1CK, 12, 13, 14 represent the 7th day soil samples t reated
by 0, 50, 150 and 250 mg ! kg- 1 acetochlor ( a) and methamidophos
( b) ; 8CK, 82, 83, 84 represent the 56th day soil samples t reated by
0, 50, 150 and 250 mg !kg- 1acetochlor ( a) and methamidophos (b) .
4 讨 论
在评价土壤微生物动态变化规律的实践中, 传
统的微生物检测方法( CFU)被广泛应用. 但是由于
该方法本身的局限性, 在对土壤微生物种群组成和
结构变化进行预测和研究方面不能做出科学的判
断.因此,在对土壤中可培养真菌数量做出判断的基
础上,对其中的种群组成和结构以及丰富度等进行
研究,综合多方面的分析结果,才能在实验基础上对
土壤真菌的变化规律做出科学评价. 本研究利用传
统真菌 CFU 和土壤可培养真菌 PCRDGGE分析方
法,对黑土土壤中真菌的数量、种群丰富度以及种群
结构进行研究的结果表明, 单纯的 CFU 和 PCR
DGGE的方法均不能对土壤可培养真菌的动态变化
规律做出完整的科学判断. 因为从实验结果分析,虽
然甲胺磷处理使土壤可培养真菌 CFU 明显高于对
照,丰富度系数相当或大于对照,但是其种群结构已
经与对照相距甚远, 由于甲胺磷的胁迫和富集效应
使部分土著真菌被抑制或致死, 其他原始低丰度种
群被富集,结果使土壤可培养真菌的组成和结构发
生改变,而且这种改变可以维持到整个处理过程.同
时,在 50 mg!kg- 1乙草胺处理土壤中可培养真菌
CFU 的变化与对照比差异不显著, 但是其种群丰富
度系数和种群结构均已发生了显著改变, 不仅其中
部分原始主要种群被抑制或致死,导致谱带丢失,同
时由于乙草胺的富集效应使土壤中出现一些新的类
群,这可能是原来低丰度种群被不断富集的结果.土
壤中可培养真菌种群结构和数量的变化对土壤生态
系统潜在的效应是目前难以估量的, 因为这种变化
不仅对土壤真菌的区系结构和功能产生影响,同时
也将大大影响到同一栖息环境中细菌种群的组成和
结构,使原始的微生物生态系统的稳定结构和功能
被不同程度地破坏; 另外一种潜在的风险是, 土壤
中真菌数量的骤增将有可能成为土壤中植物土传病
菌爆发的可能因素之一.
本实验所设计的 3个浓度乙草胺处理均对土壤
可培养真菌种群结构和数量产生影响, 而且随处理
浓度增加,这种影响越显著. 特别是高浓度乙草胺,
不仅表现为强烈的短期效应,同时具有显著的长期
效应.这种效应的结果可以维持到整个处理过程,难
以恢复. 高浓度乙草胺的这种对可培养真菌的长期
效应应引起我们重视. 乙草胺由于其较短的半衰期,
一直被认为是一种低毒和对环境友好的农药之一,
被鼓励使用.大量的研究表明,乙草胺尽管在环境中
的残留时间较短, 但对土壤微生物的影响却是长期
和不可逆的[ 15] . 因此, 不要因为它毒性较低[ 19] , 降
解周期短( 5~ 7 d) [ 14]而过度或频繁施用.
1102 应 用 生 态 学 报 16卷
与乙草胺不同,甲胺磷是一种毒性大、效率高、
应用范围广的广谱杀虫剂, 在土壤中的半衰期较
短[ 22] .本实验结果表明, 不同浓度甲胺磷处理均对
土壤可培养真菌的生长具有刺激效应, 使土壤可培
养真菌数量增加,同时使土壤可培养真菌的种群结
构发生改变.在处理初期, 种群结构变化剧烈, 随着
处理时间延长, 种群数量仍然维持在较高水平,种群
结构虽然仍与对照有明显差异, 但与初期相比却在
一定程度上得到恢复. 甲胺磷的这种效应虽然对土
壤中部分养分循环和土壤碳库等养分保持在某种程
度上具有一定的积极意义, 但同时也具有潜在的使
土壤中微生物生态系统结构和功能破坏、土壤中病
原真菌爆发的风险. 因此,在评价其环境风险时应当
引起重视.
参考文献
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作者简介 李新宇, 女, 1976 年生,博士生. 主要从事土壤微
生物生态学的研究. Email: lx ygir l2002@ yahoo . com. cn
11036 期 李新宇等:乙草胺和甲胺磷对农田黑土可培养真菌数量及种群结构的影响