全 文 ：阿维菌素在土壤中的微生物降解研究*
张 卫1* * 虞云龙2 林匡飞1 李少南2 吴加伦2 樊德方2
( 1 华东理工大学资环学院,上海 200237; 2浙江大学农药环境毒理研究所,杭州 310029)
=摘要> 运用恒温培养法研究了阿维菌素在土壤中的降解动力学. 结果表明, 非生物+ 微生物降解、非生
物降解及微生物降解的半衰期分别为 341 8、2771 3 和 4919 d, 说明阿维菌素在土壤中的降解主要由微生物
引起. 从试验土壤中分离到 1 株高效降解阿维菌素的菌株, 经 16S rDNA 鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌
( Stenotrophomonas ma ltr ophilia ) .从该降解菌中提取的粗酶液米氏常数 (Km)为 6178 nmol#ml- 1 ,最大降
解速率为 811 5 nmol#min - 1#mg- 1 .
关键词 阿维菌素 土壤 微生物降解 优势菌 粗酶液
文章编号 1001- 9332(2004) 11- 2175- 04 中图分类号 X172 文献标识码 A
Microbial degradation of Abamectin in soil. ZHANG Wei1, YU Yunlong2, LIN Kuangfei1, LI Shaonan2 , WU
Jialun2, FAN Defang2 ( 1 Resources and Evironmental Engineering Institute, East China University of Science
and Technology , Shangha i 200237, China ; 2Pesticide Environmental Toxicologica l Resea rch Institute, Zhejiang
University, H angzhou 310029, China ) . 2Chin. J . Appl . Ecol . , 2004, 15( 11) : 2175~ 2178.
Incubation test on the degradation dynamics of Abamectin in soil showed that the half2life of its non2biodegrada2
tion plus microbial biodegradation, non2biodegradation, and microbial biodegradation was 34. 8, 277. 3 and 49. 9
d, respectively, and its degradation in soil was mostly by microbes. A dominant bacter ium which could effect ively
degrade Abamectin was isolated from test soil, and identified as Stenotrophomonas ma ltr ophilia by 16S rDNA.
The crude enzyme extr acted from the dominant bacteria had a Michaelis2Mentn. s constant 6. 78 nmol#ml- 1and
a maximum rate 81. 5 nmol#min - 1#mg- 1.
Key words Abamectin, Soil, Microbial degradation, Dominant bacter ia, Crude enzyme.
* 国家自然科学基金资助项目( 30270880) .
* * 通讯联系人.
2002- 10- 12收稿, 2003- 02- 28接受.
1 引 言
阿维菌素, 通用名为 Abamect in, 其杀虫活性之
强和杀虫谱之广具有划时代意义[1, 3, 4, 8, 12, 15] . 阿维
菌素适用作物有蔬菜、果树、棉花和花卉等, 目前已
在很多国家登记使用[16] . 近年来阿维菌素在我国已
成为甲胺磷等高毒农药的替代品,其单剂和混剂产
品在害虫防治工作中发挥着重要作用. 目前国外有
关该农药环境归趋的研究,主要集中于其光解动态,
而对其微生物降解方面的研究报道甚少[ 6, 9, 11] . 而
国内关于阿维菌素环境行为的研究尚未有人涉及,
亟待加强.
16S rDNA 序列分析法是最近十年来发展起来
的一种分子指纹技术, 广泛应用于分子的系统发育
分类学研究. 16S rDNA 有很高的保守性, 通过未知
菌与基因库中已知种属的 16S rDNA序列作同源性
比较,可以鉴定到种的水平[5] .目前,在国内这种核
酸测定方法用于农药降解菌种类鉴定的报道并不多
见.本文研究了阿维菌素在土壤中的微生物降解, 并
从试验土壤中分离到 1株高效降解菌株,利用 16S
rDNA序列分析法对其进行了种的鉴定,为进一步
开展农药污染治理提供了良好的微生物菌源.
2 材料与方法
21 1 仪器和试剂
HP1100G型液相色谱仪( DAD检测器, 色谱工作站) , 色
谱柱为长 250 mm, 涂有 YWG2C18的不锈钢柱, 内径 416
mm,国际型电动振荡机, 2FG285A型旋转蒸发仪, 50 Ll微量
进样器等仪器.
二氯甲烷、甲醇、无水硫酸钠、氯化钠等均为 A. R.级, 二
次重蒸水.阿维菌素标样 ( B1a> 9615% )由浙江省钱江生化
股份有限公司提供.
21 2 培养基[ 13, 14]
21 21 1 基础培养基 MgSO4# 7H2O 0104 g, FeSO4# 7H2O
01 002 g, K2HPO4 012 g, ( NH4 ) 2SO4 012 g, CaSO4 01 08 g, 蒸
馏水 1 L, pH 值为 710, 121 e 湿热灭菌 30 min.
21 21 2 活化富集培养基 牛肉膏 3 g, 蛋白胨 5 g, NaCl 5 g,
蒸馏水 1 L, pH 值为 712, 121 e 湿热灭菌 30 min.
21 3 阿维菌素在土壤中的降解
土壤取自浙江大学华家池校区( pH= 61 71,有机质含量
1918 g#kg- 1 , CEC= 13128 ml#kg- 1 ,属粘壤土) .取 5~ 10 cm
应 用 生 态 学 报 2004年 11 月 第 15 卷 第 11 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Nov. 2004, 15( 11)B2175~ 2178
深度土壤样品,经风干后碾碎, 除去砂砾和植株残物, 过 40
目筛后备用.
取 20 g处理过的土样放入 250 ml锥型瓶中, 按 10 mg#
kg- 1的量加入阿维菌素,用玻璃棒搅匀,加入适量蒸馏水, 使
含水量为田间最大持水量的 60% . 对样品进行灭菌(湿热灭
菌)及未灭菌处理, 将所有土样放入 25 e 恒温培养箱内培养
(避光) ,定时取样测定阿维菌素的含量.
214 优势菌的选育
21411 降解菌的分离与纯化 将采集的试验土壤接种到含 5
mg#L - 1阿维菌素的 50 ml基础培养基中, 30 e 、150 r#min - 1
振荡培养 7 d.每个驯化周期结束后, 将培养物以无菌操作移
接到新鲜培养基中,开始下一个周期的培养, 并逐倍增加培
养液中阿维菌素浓度(从 5 到 200 mg#L - 1) . 培养结束后, 平
板划线分离、纯化, 挑取平板上单一菌落, 接种于斜面上, 培
养后放入冰箱( 4 e )中保存.
21412 菌悬母液的配制 取 30 e 下生长 24 h 的斜面菌种,
环于 100 ml活化富集培养基中, 振荡培养 24 h, 培养液以
4 000 r# min - 1离心分离 10 min, 收集菌体, 用 pH 710 的
0102 mol# L- 1 Na2HPO42NaH2PO4 缓冲液洗涤 3 次, 再用该
缓冲液将菌体配成 pH 710 的菌悬液备用, 以上操作在无菌
条件下进行.
21413 优势菌的筛选 分别吸取 01 5 ml 15% 的菌悬液于含
10 mg# L- 1阿维菌素的 20 ml基础培养基中, 30 e 、150 r#
min- 1振荡培养.每个处理设 4 次重复, 并用不加菌体的培养
液进行对照试验.定时取样测定阿维菌素含量,从而筛选出
降解能力强的优势菌株.
215 阿维菌素浓度的测定
21511 土样处理 称取 20 g 处理后的土样放入 250 ml锥形
瓶中,加入 80 ml甲醇提取液, 在振荡机上振荡提取 1 h, 抽
滤后用 50 ml甲醇洗残渣, 合并滤液于 250 ml圆底烧瓶中,
用旋转蒸发仪( 80 e 水浴)将甲醇浓缩至10 ml左右,剩余的
溶液转入 250 ml分液漏斗中,加入 60 g# L- 1氯化钠水溶液
60 ml, 用 3@50 ml二氯甲烷萃取, 有机相经无水硫酸钠过滤
后,收集到 250 ml圆底烧瓶中,用旋转蒸发仪( 50 e 水浴)将
二氯甲烷浓缩至 1~ 2 ml左右, 然后用高纯氮吹干, 色谱甲
醇定容至 5 ml后待测.
21512 水样处理 将培养液用 3@30 ml二氯甲烷萃取,经无
水硫酸钠过滤后在旋转蒸发仪上浓缩至 1~ 2 ml左右, 然后
用高纯氮吹干,色谱甲醇定容至 5 ml后待测 .
采用液相色谱对阿维菌素浓度进行测定.流动相梯度洗
脱程序( A:水, B:乙腈) : 1) 0 min, ABB= 80B20( VBV, 下同) ;
2) 41 0 min, ABB= 55B45; 3) 51 0 min, ABB= 10B90; 4) 121 5
min, ABB= 10B90; 5) 131 0 min, ABB= 0B100, 流量 01 7 ml#
min- 1 ,检测波长 254 nm, 进样量 20 Ll, 按外标峰面积法定
量.在上述条件下, 阿维菌素的保留时间为 101733 min.
216 优势菌的鉴定
PCR引物为一对通用引物. 正向引物 BSF8/ 20: 5c2A2
GAGT T TGAT CCTGG CTCAG23c ( Escher ichia coli 对应位
置为 8227 ) ; 反向引物 BSR1541/ 20: 5. 2AAGGA GGTGA
TCCAG CCGCA23c ( E . coli对应位置为 154121522) .
PCR反应体系( 100 Ll)为: 10@5 Ll PCR 缓冲液 , MgCl2
( 01 025 mol# L- 1 ) 4 Ll, dNT P 2 Ll, 引物 BSF8/ 20 和引物
BSR1541/ 20 各 11 5 Ll, 模板 DNA 1 Ll, Taq 酶( 10 000 U#
ml- 1 ) 01 5 Ll, 重蒸水 3415 Ll, 甘油 50 Ll[ 10] . PCR 程序如下:
1) 94 e , 2 min; 2) 94 e , 1 min, 56 e , 1 min, 72 e , 2 min; 3)
第 2 步循环 29 次; 4) 72 e , 10 min; 5) 4e , 10 min; 6)室温放
置[ 7] . PCR 产物纯化和测序由上海申友生物技术有限责任
公司完成.
测序得到分离菌株 16S rDNA(约 700 bp)部分序列, 将
所得序列通过 Blast程序与 GenBank 中核酸数据进行对比分
析.
21 7 优势菌的酶促降解
21 71 1 粗酶液的提取 将培养好的菌体离心 ( 4 000 r#
min - 1) 10 min,去除沉淀菌体后的上清液, 即为胞外酶粗提
液.
将培养好的菌体离心( 4 000 r#min- 1 ) 10 min, 去除上清
液,沉淀菌体用 2@10 ml pH 71 5 的 0105 mol# L- 1 T ris2HCl
缓冲液洗涤,加入适量缓冲液, 然后用超声波细胞粉碎机处
理 20 min, 处理时进行间隔操作,然后用高速冷冻离心机离
心( 15 000 r#min- 1 ) 10 min,上清液即为胞内酶粗提液 .
21 71 2 蛋白质浓度的测定 粗酶液的蛋白含量按 Bradford
法测定[ 2] ,以 BSA 作为标准蛋白.
21 71 3 粗酶液米氏常数 Km 和最大反应速率 Vmax的测定
将 9 ml 含已知浓度 (分别为 111 45、221 91、34136、45181、
57127、911 63 和 1141 53 nmol# ml- 1)阿维菌素的 pH 715 的
01 05 mol# L - 1 Tris2HCl缓冲液和 1 ml粗酶液在 371 5 e 培养
箱中反应 20 min, 用三氯醋酸终止反应, 测定浓度对反应速
率的影响. 试验重复 3 次,同时设不加酶液的对照处理.
3 结果与分析
311 阿维菌素在土壤中的降解动力学
在土壤降解试验中,灭菌后样品的试验结果反
应了非生物的降解作用(包括水解和化学降解等) ,
而未灭菌样品的试验结果则反应了微生物和非生物
降解的共同作用, 因此微生物降解的试验数据应当
是由未灭菌试验数据减去相应时间灭菌试验数
据[ 17, 18] , 结果见表 1.
对阿维菌素残留量和时间进行指数相关回归分
析,发现相关系数都在 0196~ 0199 之间, 故用一级
动力学方程来描述阿维菌素在土壤中的降解过程是
合理的. 运用 DPS 软件进行方程拟合, 结果见表 2.
由表 2可知, 阿维菌素在未灭菌和灭菌条件下的降
解半衰期分别为 3418 和 27713 d, 灭菌条件下的半
衰期是未灭菌的8倍,说明阿维菌素在土壤中的降
2176 应 用 生 态 学 报 15卷
表 1 阿维菌素在土壤中的降解动力学
Table 1 Degradation dynamics of Abamectin in soil
时 间
T ime
( d)
阿维菌素残留量 Abamect in residue( mg#kg- 1)
未灭菌土壤( A)
Non2 sterilized soil
灭菌土壤( B)
Sterilized soil
微生物降解( A2B)
Microbial degradation
0 9174 9175 9174
5 8187 9164 8198
10 8145 9132 8188
20 7153 9117 8111
30 5132 9103 6104
40 4121 8198 4198
60 3114 8129 4160
表 2 阿维菌素在灭菌与未灭菌土壤中降解的动力学参数
Table 2 Degr adation kinetic parameters of Abamectin in steri lized and
non2sterili zed soil
处 理
Treatment
降解动力学方程
Degradation
kinetic equation
相关系数
Correlation
coefficient
降解速率常数
Degradation
rate constant
半衰期
Half2life
( d)
未灭菌土壤
Non2sterilized soil
Ct= 10103@e
- 010199t 01 9898 010199 3418
灭菌土壤
Sterilized soil
Ct = 91 70@e
- 010025 t 01 9739 010025 2771 3
微生物降解
Microbial degradation
Ct = 91 79@e
- 010139 t 01 9684 010139 4919
解主要由微生物引起, 而非生物降解作用引起的阿
维菌素降解较少,这与 Joan AL等[ 11]报道的结果基
本一致.
312 菌株的分离与筛选
通过对菌株的富集培养、划线分离与纯化,共得
到 6株降解菌. 对这些菌株进行筛选试验,结果见表
3. 从表 3可以看出,菌株 ZF24降解阿维菌素能力最
强,降解速率常数达到 011310, 半衰期仅 513 d, 可
见其为阿维菌素的优势降解菌.
表 3 不同菌株对阿维菌素降解的动力学参数
Table 3 Degradat ion kinet ic parameter s of different st rains to
Abamectin
菌株
Strains
降解动力学方程
Degradation
kinetic equat ion
相关系数
Correlat ion
coefficient
降解速率常数
Degradation
rate constant
半衰期
Half2life
( d)
ZF21 Ct= 9171@e
- 010589 t 019916 010589 1118
ZF22 Ct= 91 92 @e- 010787t 019834 010787 818
ZF23 Ct= 91 86 @e- 010706t 019875 010706 918
ZF24 Ct= 81 81 @e- 011310t 019942 011310 513
ZF25 Ct= 10160@e- 010833 t 019851 010833 813
ZF26 Ct= 10117@e- 010768 t 019713 010768 910
313 优势菌的鉴定( 16S rDNA序列分析及其分子
鉴定)
以细菌总 DNA为模板,利用细菌 16S rDNA通
用引物 BSF8/ 20和 BSR1541/ 20进行 PCR扩增,得
到长约 115 kb的 PCR扩增产物, 测定了分离菌株
部分长度的 16S rDNA(约 613 bp)序列(图 1) . 将所
测序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数据进行
比对分析.结果表明,分离菌株与多株菌 16S rDNA
核苷酸序列同源性均在 90%以上, 与三株嗜麦芽寡
养单胞菌 16S rDNA序列的同源性高达 99% ,故在
分子系统发育分类学上属于寡养单胞菌属嗜麦芽寡
养单胞菌( Stenotrophomonas mal trophil ia ) .
AACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACAGTAAGAGGTTGCTCTTATGGGTGGCGAGTGGCGGA
CGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACCTTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTA
ATACCGCATACGACCTTCGGGTGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGGATAGATGANC
CGATGTCGGATTAACTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTC
TGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG
TGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCC
TTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAAAGCAATCGGCTAATACCCGGTTGTTCTG
ACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGT
GCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTGTTTAAGTCTGTTGT
GAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAATTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAGTGTG
图 1 嗜麦芽寡养单胞菌的 16S rDNA核苷酸序列
Fig. 1 Sequence of 16S rDNA fragment of Stenot rophomonas malt rophi lia.
314 优势菌降解酶的定位
分别测定胞内酶和胞外酶粗提液对阿维菌素的
降解能力. 结果表明, 只有菌体存在时才有降解活
性,而去除沉淀菌体后的上清液对阿维菌素没有降
解活性,故可推测降解酶存在于细胞内,即胞内酶.
315 粗酶液的米氏常数和最大反应速率
根据阿维菌素浓度和测得的粗酶液反应速率做
Lineweaver2Burk图(图 2) , 求得粗酶液降解阿维菌
素的米氏常数( Km)为 6178 nmol#ml- 1, 最大反应
速率 ( Vmax )为31 26nmol#min - 1( r = 019996) . 经
图 2 粗酶液的 Lineweaver2Burk图
Fig. 2 Lineweaver2Burk plot of the crude enzyme.
217711 期 张 卫等:阿维菌素在土壤中的微生物降解研究
测定, 粗酶液中可溶性蛋白含量为 0104 mg#ml- 1,
因此粗酶液对阿维菌素的最大降解速率为 8115
nmol#min- 1#mg- 1.
4 讨 论
试验所用土壤为粘壤土, 分离出的主要降解菌
为嗜麦芽寡养单胞菌 ( Stenotr ophomonas mal2
trophilia ) .如果土壤类型不同, 优势降解菌的种类
及降解能力如何,有待进一步探讨.
本文确定农药微生物降解的残留量时是在假定
土壤中生物降解全部由微生物所引起的前提下进行
的,所以忽略了土壤中其它生物如蚯蚓、土壤腐食性
昆虫等的作用. 在实际降解过程中,第 1步降解往往
是由它们进行的,然后才由微生物进行第 2步分解.
以往的研究均证实, 90%以上的农药降解是由土壤
微生物进行的, 土壤中其它生物所引起的降解仅占
生物降解总量的 10%以下[ 17] ,故可将其忽略不计.
试验通过富集培养, 从土壤中分离到 1株优势
菌,进一步说明了阿维菌素在土壤中被微生物降解
的可能性,但要充分发挥其降解潜力,还有必要对各
种环境因子对其降解性能的影响作深入研究, 另外
是否能应用于田间, 也有待于进一步探讨.
高效阿维菌素降解菌在治理工业废水污染中有
巨大的应用潜力,该菌株的分离鉴定将为进一步克
隆与阿维菌素降解有关的基因和构建降解多种污染
物的环保工程菌奠定基础.
鉴于本研究获得的优势菌降解酶对阿维菌素具
有较好的降解效果, 故开展降解酶的产酶条件、稳定
性和环境因子等对其降解性能影响的深入研究, 可
为农药污染的酶学控制提供科学的理论依据.
致谢 试验得到浙江大学微生物研究所吕镇梅博士以及农
药环境毒理研究所朱国念和吴慧明老师的指导和帮助, 深表
感谢!
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作者简介 张 卫, 男, 1975 年生,博士,主要从事环境安全
性评价、生物修复和生态毒理学方面的研究,发表论文 10 余
篇. E2mail: zwzju@sohu. com
2178 应 用 生 态 学 报 15卷