全 文 ：多功能菌群混合施用的生态效应*
张 昕1 张炳欣1* * 赵宇华1 杨 丽1 杨庆洪2 喻景权1
( 1 浙江大学农业与生物技术学院,杭州 310029; 2University o f W isconsin, M ilw aukee, USA)
摘要 从蔬菜地黄瓜根围土壤中经分离筛选, 得到两个对黄瓜枯萎病菌( Fusar ium oxy sp orum f . sp. cu
cumer inum)有抑制作用,并能明显促进黄瓜生长的菌株 ZJY1( Brev ibacillus br ev is )和 ZJY116( Bacillus
subtilis) .将这两菌株与一株毒死蜱降解菌 DSP3( A lcaligenes f aecali)按照不同组合处理黄瓜种子, 以研究
多功能菌群在环境中发挥生态效应的可行性.结果表明, 这两株具有生防和促生功能的菌株与 DSP3 按不
同组合混合后, 对黄瓜的防病促生作用均不受影响. 同时对黄瓜根围土中毒死蜱含量检测分析发现, DSP3
与这两株细菌混和施用后其降解率与单独施用相比没有明显差异.实验初步证明, 不同功能的菌株混合施
用后可以发挥其生态效应.
关键词 生防菌 促生菌 农药降解菌 多功能菌群
文章编号 1001- 9332( 2005) 10- 1909- 04 中图分类号 S476 文献标识码 A
Ecological effects of multifunctional microflora agent in environment. ZHANG Xin1, ZHANG Bingx in1 , ZHAO
Yuhua1, YANG L i1, YANG Chinghong2 , YU Jingquan1 ( 1 College of Agriculture and Biotechnology , Zhej iang
Univer sity , Hangz hou 310029, China; 2 Univer sity of Wisconsin, Milw aukee USA ) . Chin. J . A pp l . Ecol. ,
2005, 16( 10) : 1909~ 1912.
In this paper, str ains ZJY1( Brev ibacillus br evis ) and ZJY116( Bacillus subtilis) w ith evident inhibito ry effect
on Fusar ium oxysp orum f . sp. cucumer inum and w ith promotion effect on plant grow th were screened from cu
cumber rhizosphere, and the feasibilit y of ex er ting the ecological effects of multifunctional microflora agent was
studied by tr eating cucumber seeds with the two strains sing ly or mixed with chlorpyrifosdeg rading strain DSP3
( A lcaligenes f aecali) . The results show ed that the tw o str ains could keep their functions in suppressing disease
and promoting plant gr owth when mixed with DSP3, and the chlorpyr ifosdegrading effect of DSP3 had no sig
nificant differ ence w hen DSP3 w as applied singly or mixed with the two strains. This study testified the feasibili
ty of applying multifunctional micr oflora agent in the env ironment.
Key words Biocontr ol ag ent, Plant grow thpromoting microor ganism, Pesticidedegr ading microor ganism,
Multifunctional microflora.
* 浙江省科技厅项目( 2003C22029) 和国家自然科学基金重点资助
项目( 30230250) .
* * 通讯联系人.
2005- 01- 20收稿, 2005- 04- 30接受.
1 引 言
随着人们对环保和健康意识的逐渐加强, 运用
有益微生物防治植物病害以及生物净化环境已成为
研究热点[ 16, 21] , 其中具有产孢功能,耐热和耐干旱
的革兰氏阳性细菌越来越为人们所关注[ 4] . 然而,
由于单个生物因子在环境中作用的不稳定性, 人们
开始考虑将多个生物因子混合组成多功能菌群以达
到稳定功效的目的[ 6, 14] . 但迄今为止, 大多数研究
都集中在具有同一功能的不同生物因子的多功能菌
群[ 3, 8, 19] ,在此背景条件下, 本文探索了具有不同功
能的生物因子混合后的生态效应.
毒死蝉( chlorpy rifos)硫代磷酸酯, 是美国陶氏
化学公司( Dow. Chem ica1CO. )于 1965 年开发并研
制出来的一种广谱性有机磷酸酯类杀虫剂, 广泛用
于农业和城市害虫的防治[ 13] .它在植物和土壤中的
残留可通过食物链影响人们健康[ 11, 17] ,由于其在叶
面上持效期较短, 在土壤中持效期则较长[ 7] , 因此,
毒死蝉在土壤中的降解情况早已受到人们的普遍关
注.微生物是影响有机磷农药在环境中降解的最主
要因素, 因而微生物降解被认为是有机磷农药降解
最可靠、最高效的途径[ 9, 15] . 目前, 已有很多利用生
物降解菌减少环境污染残留的相关报道[ 5, 10, 20, 22] .
本文将经过室内和盆栽试验筛选得到两株抑制黄瓜
枯萎病菌的具生防与促生功能的芽孢杆菌与一株毒
死蜱高效降解菌 DSP3按不同组合引入黄瓜根围土
壤,研究了这一具不同功效的菌群在环境中的生态
效应,为多功能菌的实际开发利用提供依据.
2 材料与方法
2 1 供试材料
菌株 ZJY1 ( Brev ibacillus br evis ) 和 ZJY116 ( Bacillus
subtilis)以及毒死蜱降解菌株 DSP3( A lcaligenes f aecali )均来
应 用 生 态 学 报 2005年 10 月 第 16 卷 第 10 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Oct. 2005, 16( 10)!1909~ 1912
自浙江大学华家池校区农场温室大棚内的黄瓜根围土壤. 经
本实验室分离筛选鉴定, ZJY1 和 ZJY116 对黄瓜枯萎病菌
( Fusar ium oxy sp orum f sp cucumerinum )具有明显的抑制
作用,而菌株 DSP3 经验证在蔬菜大棚新鲜土壤中能有效促
进毒死蜱在土壤中的降解.
供试作物为黄瓜(品种: 新泰密刺) . 杀虫剂毒死蜱由浙
江大学农药与环境毒理研究所提供,纯度为 97 5% .
供试培养基:室内 3 株细菌的培养和亲和性试验用培养
基为 KMB, 配方如下: 蛋白胨, 20 g ; MgSO4∀ 7H2O, 2 5 g ;
K 2HPO4∀3H2O, 1 5 g ; 甘油, 20 g ; 琼脂, 20 g, 加蒸馏水至
1 000 ml. 3 个供试菌株均能在 KMB平皿上良好生长.
22 菌株 ZJY1 和 JY116 的抑菌试验
采用平皿对峙法.将直径为 6 mm 新鲜培养的黄瓜枯萎
病菌菌丝块分别接种于 PDA 平板中央, 2 d 后将菌株 ZJY1
和 JY116 的单个菌落采用十字对峙法点样于菌丝块周围做
平皿拮抗试验.
23 毒死蜱降解菌的降解能力测定
取蔬菜大棚的新鲜土,设 4 个处理: # 灭菌土(新鲜土
自然风干后,过 20目筛,以无菌水调节湿度为 10% ,装入瓶
中,高压灭菌锅中 121 ∃ 灭菌 2 h) ; % 新鲜土; & 添加
DSP3 的灭菌土; ∋ 添加 DSP3 的新鲜土. 在各处理土壤中
加入毒死蜱,使之终浓度为 100 mg∀kg - 1, 均装在棕色瓶中,
30 ∃ ,每隔 5 d测定土壤中毒死蜱残留量.
24 供试菌株室内相容性实验
将 3株新鲜菌株在 KB 平板上活化后, 分别加入无菌水
配成菌悬液(约 108 cfu∀ml- 1 ) . 取 0 1 ml DSP3 悬液于新鲜
KB 平皿上均匀涂布 10 min 后, 分别将两株菌 ( ZJY1 和
ZJY116)在悬液中浸泡 10 min, 然后用直径 0 6 cm 的滤纸
圆片贴于上述平皿上,置于 28 ∃ 恒温培养, 48 h 后观察抑菌
圈的形成情况.用同样方法验证菌株 ZJY1 和 ZJY116 之间
的相容性.
25 菌株在田间小区的表现特性
251 菌悬液的制备及黄瓜种子的处理 黄瓜种子先经
70%酒精表面消毒,清水漂洗后催芽待用. 各细菌菌株在 KB
平板上 28 ∃ 培养 48 h 后,用无菌水稀释至 A600= 1 0, 制成
新鲜菌悬液,将上述 3 种菌悬液分别经单个因子以及按 1!1
体积比混合的不同组合,加上无菌水对照共 8个处理浸泡黄
瓜种子 2 h,而后种子经自然凉干后播种田间小区.
252 田间农药的准备 杀虫剂毒死蜱先配制成浓度为 10
g∀L - 1的母液储存. 使用时将母液稀释到 5 g∀L - 1均匀喷洒
播种小区土壤表面.
253 田间小区试验设计 试验在浙江大学华家池校区菜
圃进行, 选择多年种植黄瓜作物的土地.种子经上述各种组
合菌株处理后按常规栽培模式播入田间,每个组合菌株处理
播种面积 3 m2 ,设 3 个重复, 随机排列. 黄瓜种子播种后 1 d
向土壤中喷洒上述毒死蜱溶液.
254 供试菌株防病促生效应观察及土壤残留毒死蜱的检
测 防病促生效应:黄瓜出苗后, 观察各处理的出苗时间、发
病指数,并对成熟期黄瓜茎基粗、单株平均产量以及果实均
重进行测量称重. 发病程度按如下分级, 1 级: 病害较轻, 没
有明显症状; 2级: 病害较重,植株轻微萎焉, 维管束浅褐色;
3 级:病重, 植株明显萎焉,维管束变褐色.
土壤中毒死蜱含量的提取与检测: 田间小区经毒死蜱处
理后每隔 5 d 取黄瓜根围土样. 每个样品各取 5 g 土壤于
100 ml的三角烧瓶中,用 2 ( 20 ml重蒸石油醚, 25 ∃ 恒温震
荡提取 1 h,离心, 过滤, 合并滤液, 收集在 50 ml容量瓶中.
滤液用无水硫酸钠干燥后, 置于 KD 浓缩仪中, 蒸至近干,
再用氮气吹干, 毒死蜱残留用石油醚定容至 2 ml后用于气
相色谱测定.气相色谱测定采用仪器 Shimadzu GC9A, FPD
检测器进行. 色谱柱 : 5% OV101, 80~ 100 目, 长 1 5 m, 直
径 3 mm. 柱温 260 ∃ ,进样口和检测器温度分别为230 ∃ 和
250 ∃ .载气: 氮气,流速 45 ml∀min- 1 ;氢气 15 ml∀min- 1; 空
气 30 ml∀min- 1 .进样量 5l, 样品保留时间为 3 73 min.
3 结果与分析
31 拮抗菌株对黄瓜枯萎病菌的抑制作用
供试 菌 株 ZJY1 和 ZJY116 对 病 原 菌
Fof sp cucumer inum 均有较强的拮抗能力, 平
皿对峙试验中,两菌株菌落周围均可形成抑菌带,病
原菌生长受到明显抑制(图 1) .
图 1 菌株对病原菌 F o f sp cucumerinum 的抑制作用
Fig. 1 Antagon ist ic ef fect of tw o st rains on F o f sp cucumerinum .
32 毒死蜱降解菌的降解能力
由图 2可以看出, 毒死蜱在不同处理土壤中降
解速率存在着明显差异.在灭菌土壤中,毒死蜱降解
速率十分缓慢, 20 d只降解 10%左右, 而新鲜土壤
中毒死蜱降解速率明显快于灭菌土壤, 20 d 降解
20%左右,说明微生物在毒死蜱降解过程中起着重
要作用,因为与灭菌土壤相比,新鲜土壤中微生物数
量明显偏高. 新鲜土壤中毒死蜱降解速率又慢于添
加了DSP3菌株的灭菌土壤,虽然添加了 DSP3的灭
菌土壤中微生物数量明显少于新鲜土壤, 但降解率
却反而快于新鲜土壤, 说明土壤中降解毒死蜱的能
力并不是由微生物数量起决定性作用,而是)质量∗
在起作用,即添加了毒死蜱降解菌 DSP3的灭菌土
壤比新鲜土壤中存在着更多的可降解毒死蜱的微生
1910 应 用 生 态 学 报 16卷
物 最高的降解率出现在添加了 DSP3 的新鲜土.
由这种现象可以判断 DSP3在土壤中有良好的毒死
蜱降解能力, 并且推测 DSP3和土壤微生物间可以
形成一种稳定的微生物群落结构[ 12] .
图 2 菌株 DSP3在土壤不同处理中毒死蜱降解
Fig. 2 Degrading rate of chlorpyrifos in diff erent t reated soils with st rain
DSP3.
# 灭菌土壤 Steril ized soil; % 添加菌株 DSP3的灭菌土 Sterilized
soil added w ith strain DSP3; & 自然土 Nat ive soil; ∋ 添加菌株
DSP3的自然土 Nat ive soil added w ith st rain DSP3.
33 供试菌株室内相容性
平皿对峙实验发现, 在室内活体条件下, 培养
48 h 后, 平皿上长满新鲜菌苔, 而滤纸圆片周围没
有抑菌圈出现, 说明供试 3个细菌菌株互相之间不
产生拮抗.
34 多功能菌群的生态效应
341菌株对黄瓜的防病促生作用 生防与促生菌
株 ZJY1和 ZJY116与毒死蜱降解菌 DSP3以不同
组合混合后,其防病、促生作用不受影响, 结果见表
1.从表 1可以看出, 与对照相比,供试两株细菌均能
抑制病害发生、显著促进黄瓜的生长. 种子经处理
后,黄瓜出苗时间短、茎基粗、平均单株产量及果实
均重都较对照有明显提高, 尤其是菌株 ZJY116 的
促生作用显著. ZJY1 和 ZJY116 混合后其生防和
促生效应不能累加.同时发现两株菌与 DSP3 混合
施用后,其防病促生效应均不受影响.
表 1 多功能菌群对黄瓜的防病促生效应
Table 1 Disease suppression and plant growthpromoting effect of mul
tifunctional microcommunity on cucumber
处理
Treatments
出苗时间
Germinate
time
( d)
发病指数
Susceptibility
index
( % )
根粗
Average stem
girth
( mm)
平均单株产量
Aver age yield
of each plant
( g)
果实均重
Average w eight
of fruit
( g)
CK 40 21 0 4 53 1 590 318
ZJY1 35 13 2 4 59 1 733 343
ZJY116 25 6 9 4 70 1 805 361
ZJY1+ ZJY116 25 8 4 4 63 1 778 354
DSP3 40 19 8 4 55 1 597 329
ZJY1+ DSP3 35 14 6 4 57 1 715 336
ZJY116+ DSP3 25 7 8 4 66 1 799 358
ZJY1+ ZJY116+ DSP3 25 9 3 4 63 1 697 353
342 不同组合处理后的毒死蜱降解 经定期对土
样中毒死蜱含量检测发现,与对照相比, 菌株 DSP3
能显著促进毒死蜱在土壤中的降解, 到 25 d 时, 土
样中已检测不到毒死蜱的存在. 研究发现, 与 ZJY
1、ZJY116按不同组合配合使用时, DSP3的降解效
力不受影响,且 DSP3+ ZJY116的组合表现出更强
的降解趋势.由图 1可以看出, 毒死蜱施入 5 d后,
DSP3与生防菌混合施用的 3个组合中农药残留均
低于仅有 DSP3的处理,呈现更快的降解速率,其中
以 DSP3+ ZJY116的组合残留量最低, 效果最佳.
图 3 不同组合处理后的毒死蜱降解
Fig. 3 Degradation eff iciency of chlorpyrifos in diff erent t reatments.
# 种子未经细菌处理 Seeds not t reated w ith bacteria; % 种子经菌
株 DSP3处理 Seeds treated w ith DSP3; & 种子经 DSP3、ZJY1组合
处理 S eeds treated w ith the mixture of DSP3 and ZJY1; ∋ 种子经
DSP3、ZJY116组合 S eeds t reated w ith the m ixture of DSP3 and ZJY
116; + 种子经DSP3、ZJY1和 ZJY116组合 Seeds treated w ith the
mixture of DSP3, ZJY1 and ZJY116.
4 讨 论
由于单个微生物因子在环境中发挥功效的不稳
定性,目前人们越来越多地着眼于研究利用多个生
物因子构成的多功能菌群协同作用发挥生态效应.
这方面的报道很多,如 Pierson和Weller 发现[ 18] ,由
多个荧光假单孢杆菌属组成的菌群防治小麦全蚀病
的防效要比这些菌株单独施用更好, 而 Duffy 等[ 2]
研究也表明, 将生防真菌 Trichoderma koningi i 与
Pseudomonas spp. 混合比这两种因子单独使用更能
抑制全蚀病的发生.然而,多个生物因子要想混和施
用, 使其发挥作用, 各生物因子首先应具有相容
性[ 1] . 因为引入的生物因子相互之间以及它们与土
著生物群落之间积极或消极的相互作用都能影响它
们在环境中的功能,例如,两群占据同一生态位点利
用同一底物的微生物可能产生空间和营养的竞争.
191110 期 张 昕等: 多功能菌群混合施用的生态效应
此外, 一种生物产生的次生代谢产物也可能对另一
种群产生不利影响. 本实验结果表明,供试 3种细菌
在室内活体条件下能够相互亲和,因而可用于田间
小区试验.
在小区试验中两株生防菌均能对黄瓜生长起到
防病促生作用, 但混合施用后, 没有观察到累加效
应.其原因可能是两株生防细菌均属芽孢杆菌,亲源
关系较近, 施入田间后竞争相同的空间位点和营养
底物,最后保存优势种群的效应.
尽管在农业生态系统中利用多个生防因子的菌
群协同作用发挥效应的研究很多,但将生防菌和农
药降解菌混用的报道并不多见.研究发现,供试两株
细菌与 DSP3混合的所有组合均对黄瓜有防病促生
作用,且与 DSP3单一因子相比, 它们对毒死蜱的降
解有更稳定的趋势,结果与室内菌株亲和实验相一
致.但菌株间协同作用的机制还有待详细查明. 此
外,生物因子在环境中发挥效应受到多种非生物因
素,诸如温度、湿度、光照、土壤质地、pH 值等的影
响,因此, 还需要对不同环境条件下菌群功能稳定性
作进一步研究. 本实验初步证明了多功能菌群在环
境中发挥效应的可行性, 为多个生物因子混合在环
境中的实际应用提供了有利依据.
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作者简介 张 昕, 女, 1976 年生,博士生. 主要从事生物防
治和微生物生态学研究, 发表论文数篇. Email: x inzhangw
@ eyou. com
1912 应 用 生 态 学 报 16卷