全 文 ：2 0 00年 2 7( 6)微 生 物 学 通 报 .403 .
犷 ~ ~ ~ ~ ~ ~的乙旦窦丝竟堂
B IOL OG系统鉴定黄瓜根围促生菌的初步研究 *
陈晓斌 l *张炳欣 ` 楼兵干 ` M. H.助 d er,
(浙江大学农学院
(C S I RO
杭州 3 10 0 2 9 ) (南京农业大学植物保护系 南京
许志刚“
2 10 0 9 5 )
2
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a et r , 。 e n o s m o n d , s ^ 5 0 6 4 , A uS喇 i a ) ’
摘要 : 对筛选出的 8 株具有明显促生防病作用的黄瓜根围促生菌 c N l , C N3 1 , CM S , C N I 1 6 , C N 129 ,
x B 120
,
x B S
,
xB 41 通过 BI O L O G 法进行了分类鉴定 ,分别为 : 铜绿假单胞菌 (sP en do m on a : ae r ug in os a) ,
波纹假单胞菌 (尸. e o r r雌a at ) , 短芽抱杆菌 (枷e i lu s b r e v is ) ,荧光假单胞菌 B 型 ( .P j7u o r e s e e n s yt 详 B ) ,
铜绿假单胞菌 (尸. a e r叮 in o s a ) , 荧光假单胞菌 e 型 ( .P 7uj o r es e e n s yt 讲 C ) , 短芽饱杆菌 (加 e i ll u s b r e v is )
和解淀粉芽抱杆菌 ( .B a柳 ot il qu aef c ie ns ) 。 鉴定结果与分离筛选的 P G p R 菌株大多集 中在假单胞菌
(乃 e u do m o n a s s p p . )和芽抱杆菌 (加 e ilu s s即 . )两个属 。
关键词 : 黄瓜 , 根围促生菌 (P G P )R , BI O L O G 测试 , 鉴定
中图分类号 : 5 154 . 3 , 5 4 32 .4 文献标识码 : A 文章编号 : 02 5 3一2 6 54 (2 000 ) 0 6刁4 0 3刁 5
S T U D I E S O N I D E N T I F I C A T I O N T O P L A N T G R O W T H— P R O凡1 0 T I N GR H I Z O B A C T E R I A O F C U C U M B E R U SI N G B IO L O G A N A L Y SI S
e H E N 为汾B in , Z H A N G B i n g es x i n , 功 u B i吃 { 通n l M . H yR 山尸 x u 黝一G an g Z
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奄r i e u ltu r a l nU i v e r s i印, aN nj in g 2 10 0 9 5) 2
C SI R O 白 n J a n J 肠 te r , G le n os m o n d, 剐 5 0 6 4 , 血s tr a zi a ) ’
A b s tr a c t : B I O LO G a n a ly s is w as
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s e as e、 o n t r o】 o n C成 u 们n be f
s e e d li n g s
.
T七e er s ul t s how e d ht a t s lt a ln C N I 1 w as i de int if e d as 乃 e n do m o n a s a e r ug in o s a , C N 3 1
C N 4 5 as
C
,
加 e i l lu s b r e v is , C N I 1 6 as .P 7uj o r es e e n s yt pe B , C N 12 9 as P . a e r u g in o s a , X B 1 2 0
as P
.
e o r r u g a at
,
as .P 刀u o r es e n s
ty pe X B 5 as 加 c ilu s b r e v is , 助 d X B 4 l as 及 a柳 ol il q u aef c ie n s . I t 昭 re e d ht a t m o s t o f s e re e ne d P G P R
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. 明 d aB e ilu s s P P
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K e y w o r d s : C u c
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lP an t gorw
ht es P rom
o it n g ihr
z o bac te ir a (P G于)R , B I O LO G an al y s is , I de int if e iat o n
植物根 围促生菌 (lP an t g~ 山 , p
r o m o it gn
ihr
z o b朗 et ir a , 简称 P G P R )是指根围的一类有益
细菌 , 能直接或间接地对植物生长起促进作用 。
自 19 7 8年 B ur 和 B e h r o ht 等在马铃薯上率先报
道 PG P R 以来 , 对其防病促生的研究蓬勃发展 ,
至 19 9 7 年 , 有关 P G田R 的国际专门研讨会已举
* 澳大利亚国际农业发展中心 (A C认 )R 资助的中澳合作
项目 (No . P卜珍6 8 0)
国家自然科学基金资助项 目 (No . 3O0 7O 5 1 1)
* * 现工作单位 : 上海交通大学农学院园环系
收稿 日期 : 19 9 9一1-0 1 4 , 修回 日期 : 2 0 0 0刁 6刁 6
DOI : 10. 13344 /j . mi crobi ol . chi na . 2000. 06. 001
微 生 物 学 通 报 2 00 0年 2 7 (6 )
行了 4届 。 P GR P的微生态制剂 已被广泛地用
于植物病害的生物防治 , 特别是有效地用于 防
治小麦全蚀病 、 马铃薯软腐病 、 棉苗碎倒病 、 作
物青枯病等多种顽 固性土传病害 [ ,一 ’ ] 。 从 19 9 6
年开始 , 我们从黄瓜 、 番茄等蔬菜作物根 围分离
筛选到一些对蔬菜生长有明显促进作 用和对不
同病原引起的苗期碎倒病有效好防治效果 的
P G p R 菌株 l4, ’〕 , 为进一步弄 清这些菌株 的防病
促生机 制及其在根 围的定殖情况等生态学 问
题 , 并为研究开发利用无污染 、 效果好的 P G P R
生防菌剂防治蔬菜苗期病害作准备 , 对其分类
状况作一个准确的鉴定是很有必要的 。
由美国 BI O LO G 公司生产的 腼c or s ta it o x l…I材
微孔板鉴定系统 (简称 BOI L O G 系统 )有 4 种类
型 , 分别用于对放线菌 、 酵母菌 、 革兰氏阳性菌 、
革兰氏阴性菌的重要生理生化反应作快速鉴定 。
当接种纯培养的细菌悬液时 , 其中一些孔中的营
养物质被利用 , 使孔中的氧化反应指示剂四氮哇
紫 (eT tr aZ of ium vi of et )呈现出不 同程度 的紫色 ,
从 而 构 成 该 种 细 菌 的 特 有 “代 谢 指 纹 ”
(eM
at bo l ic R gn e rp ir nt )
, 经相应的仪器记录 , 结
果输人 BI O LO G 配套软件 , 与标准菌种的数据库
比较后 , 该菌株的分类地位便被确定出来 6[, 7 ]。 该
方法具有快速 、 简便 、 高效 、 准确的特点 , 近年来
在国外广泛用于多种细菌 、 放线菌和酵母菌的鉴
定 , 用于指示不同生境如水样 、 土壤 、 根围 、 叶围
微生物群落的时空差异性等 8[] 。 国内赵友福等采
用 B IO LO G 鉴定系统来鉴定植物病原细菌 9[] 等 。
本文报道 了采用 BI O LO G 系统对黄瓜 P G沪R 菌
株进行分类鉴定的结果 。
性或阳性后再用相应的 G N 板或 G P 板测试 。
1
.
3 B IO L O G 测试
基本按 BI O LO G 测试操作程序 l0[] , 有所修改
为 : ①菌株首先经 K M B 平板活化 , 再于专用培养
基 B U G M ( B IO L O G U h iv e sr al 。 o w ht M七id um )
上划线培养 ( 30 ℃ , 12 一 1 8h) ; ②用棉拭小合刮取
菌苔至盛有 18 一 20 n 1 L 预热的灭菌生理盐水的三
角瓶 中 , 涡旋振荡至均匀菌悬液 , 取部分菌悬液
至 7 2 30 分光光度计上比色测定浓度 , 调节革兰氏
阴性菌 (G N )的 口。 5 9。值为 .0 25 一 0 . 30 , 革兰氏阳
性菌 (GP ) 的 OD 5 9。值为 0
.
16一 0 . 2 6 , 即相 当于菌
悬液浓度为 3 x 10s C F U / m L ; ③采用多头进液器
加样 , 每孔 15 0协L , 革兰氏阴性菌和阳性菌分别接
种在 G N 板和 G P 板上 30 ℃恒温中培养 ; ④分别
在接种 4 h 后和 24 h 后 目测 : 以 A I孔 (内无碳源 )
为对照 , 凡与该孔颜色相近者记 “ 一 ” , 与此孔相
比有明显紫色出现者记为 “ 十 ” , 不能分辨者记为
“ 士 ” ; ⑤培养 24 h 后用 iB 于 F泊d 5 0 型酶标仪测
读结果 , 滤光片波长为 590 imt ; ⑥将④⑤结果经
配套软件处理 , 得出菌株鉴定结果 。
1 材料与方法
L l 供试菌株
供鉴定菌株系本实验室分离 自黄瓜根围 ,
经盆栽和田间试验证 明对黄瓜植株生长有 明显
的促进作用 , 并对由多种病 原引起 的黄瓜苗期
碎倒病有较好的防效 4[, 5 ] , 菌株于含 2 0% 甘油的
L B 培养基中在 一 2 0 ℃下长期保存 。
L Z 供试菌株的革兰氏染色
按常规方法进行 , 确定菌株革兰氏反应阴
2 结果与分析
.2 1 革兰氏染色结果
供试菌株革 兰氏染色结果 为 : 革兰氏阴性
(G N ) 的 5 株 : C N l l 、 C N3 1 、 C N I 1 6 、 C N I 2 9 、
X B 12 0 ; 革 兰 氏阳性 (G P ) 的 3 株 : C 卜阵5 、 X B S 、
X B 4 1
。
.2 2 4 h
、
2 4 h 目测结果和酶标仪测读结果
目测往往不受条件限制 , 简便易行 。 30 ℃
培养 4 h 后 , B IO L O G 板上 发生 生化反 应 的孔
中出现颜色变化 , 尽管反应尚未 完成 ,但 “代谢
指纹 ” 已 显 现 出来 (如 图 1 , 以 菌株 X B 12 0 为
例 )对有些 G N 菌株 , 4 h 后显 色结果 已基本 与
最后结果相 同 , 对一些特殊 的菌株如肠细菌中
的某些种 , 4 h 目测 常很重要 , 因为这些细菌培
养时间过长 “代谢指纹 ” 往往不易读取 (全为阳
性 ) 。
2 4 h 后 , 各个孔的颜色变化已相 当明显 , 有的
孔底甚至 已有色素沉淀 。 目测时往往需要用无
菌牙签将不同孔适当搅动后以分辨颜色变化 。

微 生 物 学 通 报
表 3 pG RP 筛选菌株的鉴定结果’
2 00 0 年 2 7 (6 )
菌株 最匹配的种 相似系数 鉴定种
C N 1 1
C N 3 1
Ps ne do m
o n a s a e r
ug ni
o s a
只 e o r r u g a at
0
.
8 59
0
.
8 0 8
C N 4 5 丑 b r e v si 0. 5 9 7
C N I 16 卫 刀“ 口 r e s c e n s yt pe B 0. 6 67
Ps
e n
Od 水 o n a s a e r ug ni o s a
卫 c o r r“ g a故
丑 b r e v si
卫 jl u o r es e e n s yt详 B
Ps
e n
Od 阴 o n a s a e rug 仍 o s a
不能最后确定
不能最后确定
尸 jl u o r e s e e n s yt pe C
,ù内、ù,山, .1é`勺`C N 12 9 sP en do 用 o n a s a e r ug in o s a
丑 b r e v is
X B 4 1 丑 a娜 10 1叮u efa e ic n s
X B 12 0 只 加 o r e s e e n s yt pe C
. 相似系数 ( sl M )大于住50 则分类地位能最后确定
0
.
7 69
单胞菌护 . e o r r叮 a at ) ; e N I 一6 属荧光假单胞菌
B 型 ( .P j7 u o r e s e e n s yt 详 B ) ; X B 12 0 属荧光假
单胞 菌 C 型 护. j7 u o r e s c e n s yt 详 e ) ; e M S 和
X B S 可能属短芽抱杆菌 (aB e i l u : b r e v is ) ; X B 4 1
则与解淀粉芽抱杆菌 (.B a叩 lol iq u efa o ie ns )有
些相似 。 与模式种相似系数 ( S IM )革兰氏阴性
菌均大于 0 . 5 0 , 革 兰氏阳性菌相似系数则 只有
C卜阵5 一个菌株大于 0 . 50 , 其余两菌株相似系数
分别为 0 . 2 1 3 和 0 . 39 8 。
3 讨论
传统的细菌鉴定 主要偏重于表型特征 (如
细菌形态学特征 、 培养性状差异 )和一般的生理
生化特性等 1[ ’〕 . 表型特征的描述由于缺乏足够
的细 节资料而很难将细菌准确鉴定至种 ; 利用
生理 生化特性鉴定虽能较好地解决这一点 , 但
由于所测试项 目甚多 , 要求实验室 内大量 的工
作 , 因而相 当地费时费力 ; 而 BI O L O G 法 以纯培
养细 菌的 “代谢指纹 ” 图谱为基础 , 与计算机的
数值分类和聚类分析相结合 , 根据已有的菌种
库资料 , 获得细菌的分类鉴定 , 显示 了其快速 、
简便 、 测试程序标准化等优点 , 能大大节省测试
工作 中的繁重劳动 , 减少人为误差 。 只要菌种
库资料充分 , 对细菌的鉴定一般都能精确至种 ,
有的甚至能精确至种 以下 的分类阶元 , 如不同
生化变种 、 致病变种等 。 只是 , 在 目前的数据库
中 , 模式种的数量还较为有 限 , 不少待测样品有
时还不能准确鉴定到种 , 而只能到相似的类群 ,
有待不断完善 。 因此 对于微生物分类鉴定 , 仅
靠 某 一 种 系 统 的 方 法 进 行 是 远 远 不 够 的 ,
BI O L O G 系统也不例外 。 若同时能结合其它方
法如细胞壁脂肪酸气相色谱 (G C - F AM E )鉴定
系统 , 结果将更为可靠 (目前我们实验室已进行
这方面的工作 ) 。
从鉴定 的结果看 , 革兰 氏阴性菌株的相似
系数一般均远远大于 0 . 50 , 即能达到 BI O L O G
要求的鉴定水平 , 而革兰氏 阳性菌除 C N4 5 与
模式种短芽抱杆菌 aB icl lu : br ve i、 相似系数能
达 .0 50 之 外 , 一 般 均 小 于 .0 50 , 不 能 达 到
B I O L O G 的最终鉴定水平 , 究其原因 , 可能之一
是革兰氏阳性菌菌苔在生理盐水中难分散 , 菌
悬 液 不 均 一 , 要 达 到 要 求 的 O几 9。值 (0 . 16一
0
.
2 0) 则需要较长的振荡时间 (大于 10而 n) 和更
剧烈的分散条件 , 可能会影 响菌株 的活力 , 进而
影 响 “代谢指纹 ” 。
分类 鉴定 结果 显示 , 分 离筛选 的这几 株
P G沪R 菌株均分别属于假单胞菌 ( sP eu do m on as
s
P
.
)
, 或芽抱 杆菌 (加 c ilu 、 s P . ) , 这与分离筛
选的 P (护 R 菌株大多集中在这两个属并且研究
报道最多是相一致的 l[, 2〕。 而且 ,在这些菌株中还
出现了假单胞菌或芽抱杆菌同一种细菌的不同
分离物 , 这说明在某一种具体的作物根围 , P G旧R
往往以某种细菌为主 , 即 PG P R 菌种分布具特
异性 (随寄主植物基 因型不同而有差异 ) 。 oC o k
2 00 0年 2 7 (6)微 生 物 学 通 报
1.J, .J内、ù
4
户.Lr
等 l[ ’ l早就指出 , 植物生态系中的微生物与植物之
间 、 微生物与病原物之间 、 以及微生物之 间关系
复杂 , 相互依存又相互制约 , 微生物组成和数量
变化因植物的种类 、 部位 、 发育阶段和环境而变
化 , 筛选利用生防因子要求遵循从哪里来再回到
哪里去的原则 。 上述 P G P R 菌株分布的特异性 ,
或许能联系到 目前筛选利用 的 PG P R 菌株往往
普遍存在作用谱窄 、 推广应用时生防效果不稳定
等间题 , 并同时也为生防菌剂的开发利用时要考
虑菌株的复配混配提供一点依据 。
压 s e as e . F F TC B o ok S e ir e s , N o
B即 一 P e te rs e n . 19 9 1 , 14 2 ~ 15 2 .
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.
A n n
. 砒 v . P h ) 协 pa ht ol
40 7
.
.
40 7
.
4 2
.
E D
.
.J
[ 2 ] 1 9 8 8
.
2 6: 3 9 7 ~
[ 5 ]
陈晓斌 , 张炳欣 . 微生物学杂志 , 2 0 0 , 1 : 38 ~ 41 .
陈晓斌 , 张炳欣 . 山东农业大学学报 , 19 9 , 3 0 (增刊 ) :
14 2一 14 9 .
陈晓斌 , 张炳欣 , 楼兵干等 . 浙江大学学报 (农业与生命
科学版 ) , 1 99 9 , 6 : 5 7 8一 5 8 2 .
B oc hn
e r B R N a t u r e
,
19 8 9
,
3 3 9 : 15 7一 15 8 .
B oc h n e r B R A SM N ew s
.
19 8 9
.
5 5 : 5 3 6一 5 3 9 .
Sm al i
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E n v i r o n
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K, Wac h et
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,
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r H e t a l
,
A P P I
,胜,J, .JJ孟U,CI乃r胜LF.
M le or ib o l
.
19 9 8
。
6 4 : 1 2 20 一 1 2 2 5 .
致谢 本项研究得到了澳大利亚联邦科学院土
地和水资源管理部研究员 M助 r te n yR de r 博士的
帮助 , 美 国 K滋n s as 州立大学植病 系杨民和博士
提供部分资料 , 在此表示感谢 。
参 考 文 献
[ 1 1〕
[ 12 ]
赵友福 , 魏 亚东 , 高崇省 等 . 植 物病理学报 , 19 9 7,
2 7 ( 2 )
:
13 9一 14 4 .
In s lrU c it o n of r us e o f ht e BOI LO G M i
e or lP a te T M
.
19 9 3
,
I n e
.
许志刚 . 植物病理学报 , 19 98 , 28 (2) : 97 一 10 0 .
C o k R J
,
B ak
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,
Am
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P h y t o P a ht o l
.
S oc
.
19 8 3
.
5 3 9
飞.J叱J .
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川 幻 oc p ep r J W . I n : T h e B i o l o g i c al e o n tr o l o f 刊 ant
中华鳖白底板病和红底板病细菌的分离鉴定及致病性
叶巧真 何建国 邱德全 陈健光 黄苑玲
(中山大学生命科学学院 广州 5 10 2 7 5 )
张邦杰 叶普仁
(东莞市水产局
梁仁杰 潘 雷
东莞 5 1 1 70 0 )
摘要 : 从患白底板病和红底板病的病鳖中分离出 7株细菌 , 应用一般细菌分离鉴定的方法和美国生物一
梅里埃 ( iB o Me ir e ux US A )公司 V r E K 全 自动微生物鉴定系统进行鉴定 , 结果显示有 3 株嗜水气单胞菌
(eA
r 0 0 0 n a s hy dr 印 h i la ) 、 x株温和气单胞菌 (eA r o m o n a : : o b r ia ) 、 l 株金黄色葡萄球菌 (及叩hy ot e o e e u s
a u r e u s )
、
l 株肺炎克雷伯氏菌 (leK 占s ie la p n e u m o n i a e )和 l 株美人鱼弧菌 (琳 r i口 由ms e la ) , 其中金黄色葡
萄球菌和美人鱼弧菌为在中华鳌中首次分离 。 生物毒性试验表明 , 7 株细菌均可致死小白鼠 , 除肺炎克雷
伯氏菌外 , 其它 6 株菌对中华鳖均有一定的致病性 。
关键词 : 中华鳖 , 白底板病 , 红底板病 , 致病菌
中图分类号 : 59 4 7 . 1 文献标识码 : A 文章编号 : 02 53一2 6 54 ( 20 00 ) 0 6一04 0 7刁 7
收稿 日期 : 19 99 { 6一 l ,修回日期 : 19 9少 1 1{ l